摘要：[目的]從轉(zhuǎn)錄組水平上探究刺榆葉片對鹽脅迫的響應(yīng)機(jī)制，篩選耐鹽基因。[方法]本研究以7個不同耐鹽能力刺榆無性系的扦插苗為試驗材料，對0、100、150、200 mmol·L-1 NaCl溶液處理15 d的葉片進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序與分析。[結(jié)果]（1）除DW1上調(diào)數(shù)量略多于下調(diào)數(shù)量外，其他無性系核心差異基因下調(diào)數(shù)量均多于上調(diào)數(shù)量，且各無性系在200 mmol·L-1鹽溶液處理時差異表達(dá)基因數(shù)量最多，對鹽脅迫的響應(yīng)最為強(qiáng)烈。Go富集分析顯示細(xì)胞壁等功能類別基因?qū)}脅迫的響應(yīng)較強(qiáng)。KEGG富集分析顯示植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等代謝通路在7個無性系響應(yīng)鹽脅迫時發(fā)揮了重要作用。（2）強(qiáng)耐鹽型的無性系DJ1、DJ3與弱耐鹽型的無性系DW1、DY1在200 mmol·L-1鹽溶液處理時的4個對比組合共有的差異基因數(shù)量為1 406個，共同上調(diào)基因393個、共同下調(diào)基因996個，其中脫落酸調(diào)節(jié)因子蛋白磷酸酶PP2C基因AHG1、ABI2，乙烯受體基因ERS1、ETR2，以及環(huán)核苷酸門控離子通道基因C～GC10和C～GC/5可能與DJ1、DJ3較強(qiáng)的耐鹽能力有關(guān)。[結(jié)論]鹽脅迫引起刺榆轉(zhuǎn)錄水平上功能類別基因與代謝通路的響應(yīng)，其中6個顯著差異表達(dá)基因?qū)⒆鳛楹蜻x耐鹽基因。本研究為揭示刺榆響應(yīng)鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄組特征與篩選耐鹽基因提供了理論參考，為進(jìn)一步開展刺榆種質(zhì)資源的研究與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：刺榆；鹽脅迫；差異表達(dá)基因；實時熒光定量PCR；耐鹽基因

中圖分類號：S722 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1001-1498（2024）05-0136-12

鹽漬土在我國分布廣泛，其類型多、面積大，且在不斷擴(kuò)張，嚴(yán)重威脅生態(tài)安全與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。諸多研究表明，植物具有改良土質(zhì)、改善生態(tài)環(huán)境、實現(xiàn)有效治理與開發(fā)利用鹽漬化土地的重要途徑，開展耐鹽植物種質(zhì)資源的挖掘、篩選與應(yīng)用研究對耐鹽植物栽培利用和鹽堿地改良具有重要意義。植物在受到鹽脅迫時首先會在基因和轉(zhuǎn)錄組水平上進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而控制代謝以應(yīng)對逆境。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究技術(shù)可以從植物整體轉(zhuǎn)錄水平揭示植物體中復(fù)雜的生物學(xué)通路和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分子，對研究植物響應(yīng)鹽脅迫的復(fù)雜機(jī)制具有重要意義，目前在金絲楸（Catalpa bungei C.A.Mey）、多枝檉柳（Tamarix ramosissima Ledeb.）、平邑甜茶（Malus hupehensis Rehd.）等樹種響應(yīng)鹽脅迫機(jī)理研究中得到較廣泛的應(yīng)用。

刺榆（Hemiptelea davidii （Hance） Planch.）為落葉小喬木，榆科（Ulmaceae）刺榆屬（Hemiptelea）單種，耐瘠薄、耐低溫、適應(yīng)性強(qiáng)，在我國西北、西南、東北及華東等地分布較廣泛，其中在山東主要分布在濟(jì)南南部山區(qū)、淄博魯山、膠東山區(qū)丘陵等地，近年來的調(diào)查發(fā)現(xiàn)在劉公島等近海島嶼中也有分布。目前，刺榆的研究主要集中在種苗繁育與生態(tài)作用方面，抗逆研究報道較少。其中，耐鹽性研究報道僅見楊穎對刺榆種子萌發(fā)及其幼苗進(jìn)行的鹽脅迫研究，該研究顯示在NaCl＜30 mmol·L-1的鹽脅迫下，刺榆種子能夠正常發(fā)芽，幼苗內(nèi)MDA含量和SOD、POD酶活性未發(fā)生顯著變化，表明刺榆種子萌發(fā)與幼苗生長對低濃度鹽環(huán)境具有一定的耐受性，為刺榆在鹽堿地的種植和推廣提供了理論依據(jù)。刺榆響應(yīng)脅迫的分子機(jī)制研究報道亦較少，無性系響應(yīng)鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征與耐鹽基因篩選目前尚未見報道，劉華波利用干旱模擬試驗和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)探討了刺榆核質(zhì)基因響應(yīng)干旱脅迫的分子機(jī)制，研究表明核質(zhì)基因中光合作用相關(guān)通路、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和次生代謝物合成通路受干旱脅迫影響最大，篩選并初步證實TrxG-like基因參與刺榆干旱脅迫響應(yīng)、提高植株的抗旱性。本研究以7個刺榆無性系為試驗材料，對不同濃度NaCl溶液處理下各無性系葉片的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征開展研究，以期為刺榆對鹽脅迫的響應(yīng)機(jī)制研究及耐鹽基因的篩選與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

試驗于山東省林草種質(zhì)資源中心溫室中進(jìn)行。7個供試刺榆無性系（DJ1、DJ2、DJ3、DJ4、DW1、DY1、DH1）為2021年春季采集野生母株1年生枝條進(jìn)行扦插繁育得到的無性系，其中DJ1～DJ4采自濟(jì)南市柳埠街道錦陽川、DW1采自濰坊仰天山、DY1采自煙臺昆崳山、DH1采自威海劉公島，前期研究表明DJ1與DJ3為強(qiáng)耐鹽型，DJ2為較強(qiáng)耐鹽型，DH1與DJ4為中等耐鹽型，DW1與DY1為弱耐鹽型。

試驗苗以泥炭土、蛭石、珍珠巖按10：4：1的體積比混勻配制的營養(yǎng)土為基質(zhì)，栽植于直徑18 cm、高度15 cm的花盆中。2022年7月，將根系發(fā)育良好、長勢基本一致的扦插苗置于溫室內(nèi)，室內(nèi)溫濕度與自然條件基本一致：試驗期間實測夜間溫度19～22℃、相對濕度73%～90%，日溫23～32℃、相對濕度50%～74%。

2022年8月，參照楊穎的工作及在前期預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)置清水（0 mmol·L-1）為對照，50、100、150、200 mmol·L-14種濃度NaCL溶液。為避免產(chǎn)生鹽激效應(yīng)，在試驗開展前先用100 mmol·L-1 NaCl溶液預(yù)處理150、200 mmol·L-1兩個梯度的試驗苗3d，預(yù)處理后與其他濃度一起開始鹽脅迫處理。處理時，花盆置于托盤上，每盆分2次澆施1L相應(yīng)濃度鹽溶液，澆施的鹽溶液從花盆自然滲出到托盤中，保留滲出的鹽溶液使其浸泡花盆1夜（12 h）以使栽培基質(zhì)充分吸收鹽溶液，次日取出后用塑料薄膜包裹花盆減少盆口水分蒸發(fā)，每5d處理1次，各處理重復(fù)3次，共處理105株。試驗處理至15 d時，各無性系葉片出現(xiàn)不同程度的鹽害癥狀，即進(jìn)行鹽害情況調(diào)查，并取相同葉位的葉片，去離子水沖洗后用濾紙吸干水分，采集后立即放到液氮中速凍，然后置于-80℃冰箱中保存，用于轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2 指標(biāo)測定方法

1.2.1 鹽害情況調(diào)查

參照白榆耐鹽性評價研究中對鹽害程度分級的方法，根據(jù)刺榆葉片損傷癥狀，將刺榆鹽害分為0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ4個等級（圖1），鹽害等級評價標(biāo)準(zhǔn)為：0級：葉片無鹽害癥狀；Ⅰ級：葉緣輕度萎蔫，萎蔫面積不足1/5；Ⅱ級：葉緣卷曲干枯，葉片萎蔫面積1/5～1/2：Ⅲ級：葉緣卷曲干枯，葉片萎蔫面積1/2以上至干枯脫落。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測序和分析

使用Trizol試劑（Invitrogen，CA，USA）提取樣本總RNA，利用Bioanalyzer 2100和RNA 1000 Nano LabChipKit（Agilent，CA，USA）對提取的樣本總RNA質(zhì)量進(jìn)行檢測，質(zhì)檢合格后，利用附著有poly-T寡核苷酸的磁珠純化mRNA，然后使用Fragmentation Buffer對其進(jìn)行片段化，利用mRNASeq sample preparation kit（Illumina，SanDiego，USA）逆轉(zhuǎn)錄裂解的RNA片段創(chuàng)建最終的cDNA文庫，文庫質(zhì)檢合格后采用IlluminaNovaseqTM6000進(jìn)行測序，測序讀長為雙端2x150 bp。

在去除測序接頭、低質(zhì)量等不合格序列后，使用FastQC驗證序列質(zhì)量，包括有效數(shù)據(jù)的Q20、Q30和GC含量，所有的下游分析均基于高質(zhì)量的有效數(shù)據(jù)。使用Trinity 2.4.0進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組的從頭組裝，歸一化后得到非重復(fù)基因序列（unigenes）。使用DIAMOND將組裝完的unigenes與六大數(shù)據(jù)庫（NCBI_NR、GO、Swiss-Prot、KEGG、Pfam、eggNOG）進(jìn)行比對、分類和相應(yīng)的功能注釋，E-value閾值小于0.000 01。

通過Salmon計算樣品基因TPM值以評估unigenes的表達(dá)水平。使用R包edgeR對樣本之間進(jìn)行顯著差異分析，將llog2 fold changel＞1，且P值＜ 0.05的unigenes作為差異表達(dá)基因，并對其進(jìn)行GO和KEGG富集分析。

1.2.3 實時熒光定量PCR分析

隨機(jī)選擇4個差異表達(dá)基因進(jìn)行實時熒光定量PCR分析，進(jìn)一步驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。利用Trizol法提取樣品的總RNA，使用NovoScript Plus All-in-one 1stStrand cDNA Synthesis SuperMix（gDNAPurge）反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以較為穩(wěn)定的GAPDH作為內(nèi)參基因，按照TBGreen⑩Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）熒光定量試劑盒的操作方法，進(jìn)行實時熒光定量PCR，測定樣品中相關(guān)基因的表達(dá)量，按照2-△△CT法計算基因的相對表達(dá)量，基因擴(kuò)增引物序列見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對各株系葉片表型的影響

如圖2所示，在50 mmol·L-1濃度處理下各無性系均未表現(xiàn)出鹽害癥狀；在100 mmol·L-1鹽溶液處理時，各無性系均表現(xiàn)為Ⅰ級鹽害癥狀；在150 mmol·L-1鹽溶液處理時，各無性系進(jìn)一步表現(xiàn)出受害癥狀，且受鹽害程度出現(xiàn)較大分化，其中DJ1、DJ2、DJ3、DJ44個無性系鹽害程度為Ⅰ級，DW1、DH1鹽害程度為Ⅱ級，DY1無性系受害情況最重、達(dá)到Ⅲ級；在200 mmol·L-1鹽溶液處理時，各無性系健康分值均為處理間最低，不同無性系的受害程度也進(jìn)一步分化，其中DJ1無性系、DJ3無性系鹽害程度雖然加重但仍為I級，DJ2、DJ4、DH1 3個無性系鹽害程度為Ⅱ級，DW1、DY1兩個無性系受害情況最嚴(yán)重、達(dá)到Ⅲ級。

2.2 測序質(zhì)量

測序得到的原始序列（Raw Reads）數(shù)量介于39 993 532條～44 393 618條，共1 169 469262條，過濾后得到的有效序列（Valid Reads）數(shù)量介于37 318 336條～43 091 940條，共1 123 282 434條，有效序列占比介于92.28%～97.07%，平均占比96.05%；原始堿基（RawBases）數(shù)量6.00 G～6.66 G，共175.42 G，有效堿基（Valid Bases）數(shù)量5.19 G～5.99 G，共156.03 G；Q20介于96.64%～97.14%，平均97.01%，Q30介于90.82%-91 .88%，平均91.62%；GC含量介于43.61%～44.61%，平均44.14%。有效數(shù)據(jù)、Q20、Q30及GC含量表明測序質(zhì)量可靠，可進(jìn)行深層次分析。

2.3 基因組裝結(jié)果

將獲得的有效數(shù)據(jù)使用Trinity 2.4.0進(jìn)行組裝，共組裝轉(zhuǎn)錄本174 852條、堿基192 45681 1個，其長度介于201～16 721 bp，中值為715 bp，200～500 bp占比為3g%，GC含量為39.97%，N50為1799 bp；歸一化后共得到基因87 712條、堿基78 334 647個，長度范圍與轉(zhuǎn)錄本相同，中值為483 bp，200～500 bp占比達(dá)51%，GC含量為40.03%，N50為1590 bp，組裝結(jié)果較好。

2.4 基因功能注釋結(jié)果

使用DIAMOND對組裝好的Unigenes進(jìn)行功能注釋，6種數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果統(tǒng)計見表2，各數(shù)據(jù)庫注釋的基因數(shù)量由多到少依次為eggNOG、GO、Pfam、Swissprot、NR、KEGG，總注釋87712個基因。

2.5 差異表達(dá)基因分析

2.5.1 各無性系核心差異表達(dá)基因篩選與分析

2.5.1.1 各無性系核心差異表達(dá)基因篩選

為明確獲得刺榆各株系響應(yīng)鹽脅迫的差異表達(dá)基因，對各無性系中與對照組差異明顯的100、150、200 mmol·L-13個處理濃度（依次標(biāo)記為2、3、4）與對照0 mmol·L-1（標(biāo)記為1）進(jìn)行比較，以llog2 fold changel＞1且P值＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因，將3個對比組共有的差異基因作為該無性系核心差異表達(dá)基因。

如圖3（A-G）所示，在DJ1株系共篩選出703個核心差異基因，其中在3個處理濃度對比組中均上調(diào)的基因184個、均下調(diào)的514個；DJ2株系共篩選出430個核心差異基因，其中在3個處理濃度對比組中均上調(diào)的基因154個、均下調(diào)的263個；DJ3株系共篩選出1 021個核心差異基因，其中在3個處理濃度對比組中均上調(diào)的基因178個、均下調(diào)的830個；DJ4株系共篩選出960個核心差異基因，其中在3個處理濃度對比組中均上調(diào)的基因166個、均下調(diào)的780個；DW1株系共篩選出702個核心差異基因，其中在3個處理濃度對比組中均上調(diào)的基因351個、均下調(diào)的319個；DY1株系共篩選出1 757個核心差異基因，其中在3個處理濃度對比組中均上調(diào)的基因629個、均下調(diào)的1 097個；DH1株系共篩選出323個核心差異基因，其中在3個處理濃度對比組中均上調(diào)的基因108個、均下調(diào)的194個。除DW1株系上調(diào)基因數(shù)量略多于下調(diào)基因數(shù)量外，其他無性系下調(diào)基因數(shù)量均多于上調(diào)基因數(shù)量。此外，各無性系的3個對比組中差異表達(dá)的基因數(shù)量均為200 mmol·L-1VS對照0 mmol·L叫的對比組最多，表明各無性系在200 mmol·L-1高濃度鹽溶液處理下受到的脅迫壓力最重，對鹽脅迫的響應(yīng)也最強(qiáng)烈。

2.5.1.2 各無性系差異表達(dá)基因富集分析

如圖4（A-G）所示，GO功能富集分析顯示DJ1株系核心差異表達(dá)基因功能主要被顯著富集在細(xì)胞壁、細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞壁組織、鈣調(diào)素結(jié)合、對過氧化氫的反應(yīng)、質(zhì)膜等類別。DJ2株系核心差異表達(dá)基因功能主要被顯著富集在葉綠體類囊體膜、葉綠體包膜、類囊體、葉綠體類囊體、細(xì)胞壁、葉綠體等類別。DJ3株系核心差異表達(dá)基因功能主要被顯著富集在細(xì)胞壁、細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞壁組織、植物型細(xì)胞壁、細(xì)胞分裂、胞間連絲等類別。DJ4株系核心差異表達(dá)基因功能主要被顯著富集在細(xì)胞壁、DNA結(jié)合、細(xì)胞外區(qū)、核、細(xì)胞分裂、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性等類別。DW1株系核心差異表達(dá)基因功能主要被顯著富集在細(xì)胞外泌體、膜、細(xì)胞壁、核糖體的結(jié)構(gòu)成分、細(xì)胞外區(qū)、蛋白質(zhì)結(jié)合等類別。DY1株系核心差異表達(dá)基因功能主要被顯著富集在DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、質(zhì)膜、細(xì)胞外區(qū)、轉(zhuǎn)錄與DNA模板、蛋白質(zhì)絲氨酸／蘇氨酸激酶活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控與DNA模板等類別。DH1株系核心差異表達(dá)基因功能主要被顯著富集在對缺水的反應(yīng)、對過氧化氫的反應(yīng)、細(xì)胞外區(qū)、序列特異性DNA結(jié)合、細(xì)胞壁等類別。其中，細(xì)胞壁、細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞壁組織、植物型細(xì)胞壁、細(xì)胞壁生物發(fā)生、膜錨定構(gòu)件、質(zhì)膜錨定構(gòu)件、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性在7個無性系中均被顯著富集，表明上述功能類別基因，尤其是與細(xì)胞壁和細(xì)胞膜相關(guān)的基因?qū)}脅迫的響應(yīng)較強(qiáng)。

如圖5（A-G）所示，KEGG富集分析顯示DJ1株系核心差異表達(dá)基因主要被顯著富集在淀粉和蔗糖代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙烷生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化、植物MAPK信號通路、氧化磷酸化等通路。DJ2株系核心差異表達(dá)基因主要被顯著富集在光合作用、植物MAPK信號通路、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙烷生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化、植物與病原體的相互作用等通路。DJ3株系核心差異表達(dá)基因主要被顯著富集在戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化、淀粉和蔗糖代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氨基糖與核苷酸糖代謝、半乳糖代謝、苯丙烷生物合成等通路。DJ4株系核心差異表達(dá)基因主要被顯著富集在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA復(fù)制、植物MAPK信號通路、半乳糖代謝、淀粉和蔗糖代謝、嘧啶代謝等通路。DW1株系核心差異表達(dá)基因主要被顯著富集在核糖體、氧化磷酸化、吞噬體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝等通路。DY1株系核心差異表達(dá)基因主要被顯著富集在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙烷生物合成、植物MAPK信號通路、淀粉和蔗糖代謝、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化、半乳糖代謝等通路。DH1株系核心差異表達(dá)基因主要被顯著富集在植物MAPK信號通路、淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氨基糖與核苷酸糖代謝、核糖體等通路。其中，植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝、苯丙烷生物合成、植物與病原體互作、植物MAPK信號通路在各無性系中富集基因數(shù)量較多且在多個無性系中呈顯著富集，表明鹽脅迫對上述代謝通路產(chǎn)生了較大影響。

2.5.2 強(qiáng)耐鹽型與弱耐鹽型的無性系之間差異表達(dá)基因篩選與分析

由2.5.1可知，各無性系在最高濃度200 mmol·L-1鹽溶液處理下對鹽脅迫響應(yīng)最強(qiáng)烈、差異表達(dá)基因最多，為進(jìn)一步了解耐鹽性好的刺榆無性系響應(yīng)鹽脅迫的機(jī)制及篩選耐鹽基因，對強(qiáng)耐鹽型無性系DJ1、DJ3與弱耐鹽型無性系DW1、DY1在最高濃度200 mmol·L-1鹽溶液處理時的葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。

如圖3（H）所示，DJ14 vs DW14有6 248個差異顯著表達(dá)基因，3 209個上調(diào)、3 039個下調(diào)；DJ14 vs DY14有2 954個差異表達(dá)基因，1 057個上調(diào)、1 897個下調(diào)；DJ34 vs DW14有6 930個差異顯著表達(dá)基因，3 704個上調(diào)、3 226個下調(diào)；DJ34 vs DY14有3 913個差異表達(dá)基因，1 687個上調(diào)、2 226個下調(diào)；4個對比組中共有的差異基因數(shù)量為1 406個，其中共同上調(diào)基因393個、共同下調(diào)基因996個。

對4個對比組共有的1 406個差異基因進(jìn)行富集分析，如圖4（H） GO富集分析所示，差異基因主要富集在細(xì)胞外泌體、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、膜、轉(zhuǎn)錄，DNA模板、轉(zhuǎn)錄調(diào)控-DNA模板、質(zhì)膜、細(xì)胞壁等功能類別。圖5 （H） KEGG富集分析顯示，差異基因主要富集在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、半乳糖代謝、植物MAPK信號通路、苯丙烷生物合成等代謝通路。

植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在2.5.2各無性系差異基因分析和本節(jié)強(qiáng)耐鹽型與弱耐鹽型的無性系間差異表達(dá)基因分析中均為主要富集通路，且富集基因數(shù)量較多，反映其與刺榆響應(yīng)鹽脅迫有較大關(guān)系，本研究對其在本節(jié)富集的22個差異基因進(jìn)行分析。如圖6代謝通路圖所示，生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中富集6個基因，其中上調(diào)節(jié)點中2個基因注釋為生長素響應(yīng)蛋白IAA、1個基因注釋為生長素響應(yīng)蛋白SAUR，下調(diào)節(jié)點中1個基因注釋為生長素響應(yīng)因子ARF、2個基因注釋到GH3生長素響應(yīng)基因家族；細(xì)胞分裂素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑富集2個下調(diào)基因，分別注釋到細(xì)胞分裂素受體CRE1和轉(zhuǎn)錄因子ARR-B；赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑富集的1個上調(diào)基因注釋為赤霉素受體GID1，富集的2個下調(diào)基因均注釋為DELLA蛋白；脫落酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑富集到5個下調(diào)基因，均注釋為蛋白磷酸酶PP2C;乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑富集的2個下調(diào)基因均注釋為乙烯受體ETR；油菜素內(nèi)酯富集的2個上調(diào)基因分別注釋到油菜素內(nèi)酯受體BRI1和轉(zhuǎn)錄因子CYCD3，富集的1個下調(diào)基因注釋為木葡聚糖：木葡糖基轉(zhuǎn)移酶TCH4；茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑富集到1個下調(diào)基因，注釋為轉(zhuǎn)錄因子MYC2。上述途徑中相關(guān)基因的差異表達(dá)表明多個激素參與了DJ1與DJ3對鹽脅迫的響應(yīng)，且這些差異基因的表達(dá)可能與兩個無性系有較好的耐鹽性有關(guān)。

此外，在對4個樣本中基因表達(dá)量的分析中發(fā)現(xiàn)一個在耐鹽性好的無性系中大幅表達(dá)而在耐鹽性差的無性系中表達(dá)量較低的基因C～GC15，注釋顯示其為植物環(huán)核苷酸門控通道（cyclic nucleotidegated channel，plant），KEGG分析顯示該基因在植物與病原體互作途徑中通過調(diào)控Ca2+進(jìn)而影響下游防御響應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)，其大幅表達(dá)可能與刺榆DJ1和DJ3株系有較好的耐鹽性有關(guān)。

2.6 差異表達(dá)基因qRT-PCR驗證

如圖7所示，TRINITY_DN61310_c1_g2、TRINITY_DN38595_c1_g1、TRINITY DN63193c0_g2、TRINITY_DN65673_c0_g24個基因的qRT-PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)趨勢一致、相關(guān)性較強(qiáng)，表明本研究的測序結(jié)果具有可靠性。

3 討論

通過轉(zhuǎn)錄組測序得到87 712條基因，對各無性系及處理濃度之間進(jìn)行比較顯示，除DW1株系差異基因中下調(diào)基因數(shù)量略低于上調(diào)基因數(shù)量外，其他無性系下調(diào)差異基因數(shù)量均多于上調(diào)基因數(shù)量，表明在刺榆響應(yīng)鹽脅迫的過程中下調(diào)基因發(fā)揮了重要作用。鹽脅迫會引起植物細(xì)胞壁與細(xì)胞膜發(fā)生變化，本研究中各無性系核心差異基因GO富集分析亦顯示與細(xì)胞壁和細(xì)胞膜相關(guān)的功能類別在7個無性系均被富集到。KEGG富集分析顯示植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝、苯丙烷生物合成、植物與病原體互作、植物MAPK信號通路在各無性系中富集基因數(shù)量較多且在多個無性系中呈顯著富集，與其他學(xué)者對金絲楸（C．bungeiC.A.Mey）、無瓣海桑（Sonneratia apetalaBuchanan-Hamilton）等植物響應(yīng)鹽脅迫的研究結(jié)果相似，表明上述通路在7個刺榆無性系響應(yīng)鹽脅迫時發(fā)揮了重要作用。

對耐鹽性好的DJ1、DJ3株系與耐鹽性差的DW1、DY1株系在高鹽脅迫下的葉片轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較，共有的差異基因數(shù)量為1 406個，其中共同上調(diào)基因393個、共同下調(diào)基因996個。對4個對比組共有的1 406個差異基因進(jìn)行富集分析，GO富集分析顯示，差異基因主要富集在細(xì)胞外泌體、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、膜、轉(zhuǎn)錄與DNA模板、轉(zhuǎn)錄調(diào)控與DNA模板、質(zhì)膜、細(xì)胞壁等功能類別；KEGG富集分析顯示，差異基因主要富集在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、半乳糖代謝、植物MAPK信號通路、苯丙烷生物合成等代謝通路，GO富集分析與KEGG富集分析表明200 mmol·L-1高濃度鹽溶液脅迫下DJ1與DJ3株系有更強(qiáng)的調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)、碳水化合物、次生代謝物與維護(hù)細(xì)胞壁與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的能力，上述過程對DJ1和DJ3株系響應(yīng)鹽脅迫、提高抵御鹽害的能力具有重要作用。

本研究中多個差異基因被注釋到生長素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、油菜素內(nèi)酯、脫落酸、乙烯等植物激素信號途徑，研究表明這些激素不僅可以調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育，在植物響應(yīng)鹽脅迫的過程中也發(fā)揮著重要的作用。其中脫落酸（ABA）是植物響應(yīng)鹽脅迫非常重要的應(yīng)激激素，在ABA信號通路中包含多種關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，蛋白磷酸酶2C（protein phosphatases 2C，PP2C）作為核心調(diào)節(jié)因子之一，以負(fù)調(diào)控的方式發(fā)揮作用，其機(jī)理為PP2C與ABA正調(diào)控因子SnRK2蛋白激酶結(jié)合后抑制了其酶活性，阻止了其對下游轉(zhuǎn)錄因子的激活，鹽脅迫下，PP2C活性會被抑制從而激活A(yù)BA信號傳導(dǎo)，調(diào)控植株耐鹽性，李夢霜對鹽堿脅迫下茶樹（Camellia sinensis（L．）O．Ktze．）ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)PP2C基因家族的研究結(jié)果顯示CsPP2CA6呈現(xiàn)顯著的下調(diào)表達(dá)。本研究中強(qiáng)耐鹽型無性系相較于弱耐鹽型無性系的差異基因中AHG1、ABI2等5個注釋為PP2C的基因均顯著下調(diào)，與前述研究結(jié)果一致。AHG1、AB12是PP2C家族中的A組成員，作為核心負(fù)調(diào)控因子在ABA信號傳導(dǎo)通路中發(fā)揮著重要作用，這2個基因可能與DJ1株系和DJ3株系有較好的耐鹽性相關(guān)。乙烯是一種氣態(tài)植物激素，在植物響應(yīng)鹽脅迫過程中同樣起著非常重要的調(diào)控作用。張駛等闡述了在乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中ETR1、ERS1、ETR2等乙烯受體可與下游的蛋白激酶CTR1結(jié)合阻斷乙烯信號傳導(dǎo)，即以負(fù)反饋形式控制乙烯信號的輸出，在對強(qiáng)耐鹽型無性系與弱耐鹽型無性系的差異基因分析中發(fā)現(xiàn)2個乙烯受體基因ERS1和ETR2表達(dá)量均顯著下調(diào)，這2個基因表達(dá)量的下調(diào)可能會增強(qiáng)乙烯信號傳導(dǎo)，進(jìn)而影響了DJ1株系與DJ3株系對鹽脅迫的的耐受能力。此外，注釋為CNGC15的基因在強(qiáng)耐鹽型無性系中大幅上調(diào)表達(dá)而在弱耐鹽型無性系中表達(dá)量較小，其為環(huán)核苷酸門控離子通道（CNGCs）家族成員，CNGCs是植物細(xì)胞中非選擇性陽離子通道和分子開關(guān)，參與植物的生長發(fā)育，抵御生物和非生物脅迫。Saand等以番茄（Solanum lycopersicum L．）沉默株為材料對C～GC15基因的進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示其與抗旱性有關(guān)，與耐鹽性相關(guān)性較小，但Saand也闡述了該基因在沉默株中有表達(dá)，認(rèn)為需要進(jìn)一步研究C～GC15基因在植物耐鹽脅迫中的作用，在本研究中C～GC15基因在耐鹽性好的DJ1株系、DJ3株系大幅上調(diào)表達(dá)，而在耐鹽性較差的DY1株系、DW1株系中表達(dá)量較低，可能與刺榆DJ1株系、DJ3株系較好的耐鹽性機(jī)制有關(guān)。CNGC10是CNGCs家族另一重要成員，Guo等、Jin等的研究均顯示C～GC10對擬南芥（Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.）的耐鹽性具有負(fù)調(diào)控作用，在本研究中，C～GC10在強(qiáng)耐鹽型無性系中表達(dá)量較弱耐鹽型無性系顯著下調(diào)，根據(jù)上述研究推測，差異基因C～GC10亦可能與DJ1株系、DJ3株系較好的耐鹽能力相關(guān)。

4 結(jié)論

鹽脅迫引起刺榆細(xì)胞壁、細(xì)胞外區(qū)、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性等功能類別基因與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝、苯丙烷生物合成等代謝通路的響應(yīng)，強(qiáng)耐鹽型無性系較弱耐鹽型無性系對上述過程具有更強(qiáng)的調(diào)節(jié)能力，其中6個顯著差異表達(dá)基因?qū)⒆鳛楹蜻x耐鹽基因。本研究為揭示刺榆響應(yīng)鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄組特征與篩選耐鹽基因提供了理論參考，為進(jìn)一步開展刺榆種質(zhì)資源的研究與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

（責(zé)任編輯：張研）

基金項目：山東省重點研發(fā)計劃（重大科技創(chuàng)新工程）項目“珍貴用材樹種種質(zhì)資源挖掘與精準(zhǔn)鑒定”（2021LZGC02304）