摘要：[目的]本研究旨在解析對(duì)松枯梢病原菌Sphaeropsis sapinea具有強(qiáng)拮抗活性的生防菌株森吉木霉Trichoderma songyi M75的基因組基本信息。[方法]采用Illumina NovaSeq PE 150為依托的第二代測(cè)序技術(shù)對(duì)森吉木霉M75菌株進(jìn)行基因組測(cè)序。[結(jié)果]M75菌株全基因組總長(zhǎng)34 483 860 bp．GC含量49.50%，與木霉屬真菌特征相吻合。在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中，森吉木霉M75共注釋了28 494個(gè)基因；在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中有8192個(gè)基因富集在KEGG中的383條不同的在三級(jí)代謝通路中，主要集中表現(xiàn)在代謝途徑通路（848個(gè)）、次生代謝產(chǎn)物的生物合成通路（330個(gè)）、抗生素的生物合成（243個(gè)）、微生物代謝通路（240個(gè)）、氨基酸的生物合成（118個(gè)）、碳代謝通路（112個(gè)）等相關(guān)的代謝與次生代謝產(chǎn)物合成通路中；共有2 184個(gè)基因在KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得蛋白功能注釋；在碳水化合物活性酶CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)中，共注釋了259個(gè)糖苷水解酶GHs基因，105個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶GTs基因，7個(gè)多糖裂解酶PLs基因，21個(gè)糖類脂解酶CEs基因，54個(gè)糖類結(jié)合組件CBMs基因。森吉木霉M75全基因組中共包含41個(gè)基因簇，451個(gè)基因，多數(shù)與次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成相關(guān)。[結(jié)論]本研究首次獲得了生防真菌森吉木霉的基因組序列信息，為木霉的遺傳信息、抑菌機(jī)制及抑菌物質(zhì)的代謝通路等研究提供了數(shù)據(jù)支持和重要參考。

關(guān)鍵詞：森吉木霉；基因組；基因功能注釋；次級(jí)代謝

中圖分類號(hào)：S763.15 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-1498（2024）05-0160-09

在我國(guó)，由C型松枯梢病原菌松球殼孢菌（Sphaeropsis sapinea （Fr.） Dyko＆B.Sutton）侵染松屬（PinUS）、冷杉屬（Abies）、落葉松屬（Larix）、雪松屬（Cedrus）、云杉屬（Picea）、刺柏屬（Juniperus）、崖柏屬（Thuja）和黃杉屬（Pseudotsuga）8個(gè)屬約60種針葉植物的嫩梢、針葉、芽和球果等多個(gè)部位引起的病害稱為松枯梢?。ㄓ置缮铱莶。Ｆ涞湫桶Y狀為松球殼孢菌侵染頂芽，導(dǎo)致頂芽受害，新梢萎蔫彎曲無(wú)法正常生長(zhǎng)，新生的針葉顏色逐步變枯黃，發(fā)展成枯梢。松枯梢病已是目前世界范圍內(nèi)針葉樹(shù)上最常見(jiàn)和分布最廣的重要病害之一。

為了防治松枯梢病，現(xiàn)代營(yíng)林措施高度依賴化學(xué)農(nóng)藥，通常大量使用殺菌劑和熏蒸劑，導(dǎo)致化學(xué)物質(zhì)在土壤中逐年富集，對(duì)環(huán)境產(chǎn)生巨大的負(fù)面影響，此外，化學(xué)藥劑的長(zhǎng)期重復(fù)使用也會(huì)導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性。這促使人們尋求減少或消除使用農(nóng)藥的有害生物控制新策略，即將生防菌劑與低劑量的化學(xué)藥劑相結(jié)合使用，可有效控制植物病害且對(duì)環(huán)境危害較小。

已有眾多研究表明，木霉屬（Trichoderma）中豐富的真菌物種是可以用來(lái)當(dāng)做生物防治劑開(kāi)發(fā)的有益真菌種類，這種類群的真菌可以產(chǎn)生各種抗生素和拮抗作用酶等，同時(shí)可以通過(guò)誘導(dǎo)提高植物系統(tǒng)抗性以及對(duì)植物病原真菌的寄生作用來(lái)抑制病害的發(fā)生并降低危害，它們的代謝多樣性和強(qiáng)大的資源競(jìng)爭(zhēng)力，使木霉屬中的很多有益真菌被開(kāi)發(fā)制作為商業(yè)生物肥料和生物防控制劑。

2008年Martinez D等人首次對(duì)里氏木霉（Trichoderma reesei E.G. Simmons）展開(kāi)基因組測(cè)序，里氏木霉由此成為第一個(gè)完成全基因組測(cè)序的木霉屬真菌，此后，隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展以及測(cè)序成本的逐年降低，研究人員相繼公布了深綠木霉（Trichoderma atroviride P．Karst.）和綠木霉（Trichoderma virens（J．H．Mill．，Giddens& A.A. Foster） Arx）的基因組信息，哈茨木霉（Trichoderma harzianum Rifai）和蓋斯姆木霉（Trichoderma gamsii Samuels&Druzhin）也于2015和2016年相繼完成測(cè)序。此后，更多的木霉屬真菌相繼完成測(cè)序，獲得全基因組水平的基因信息，這標(biāo)志著針對(duì)木霉屬的研究正逐漸進(jìn)入全基因組時(shí)代，而關(guān)注木霉屬真菌基因表達(dá)層面的研究也為木霉基因功能的開(kāi)發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)。

截至目前，森吉木霉（Trichoderma songyiM．S．Park， Seung Y．Oh＆Y．W．Lim）這一物種還未開(kāi)展全基因組測(cè)序，為填補(bǔ)這一空白，獲得森吉木霉完整的基因序列，本研究以實(shí)驗(yàn)室前期篩選獲得的1株對(duì)松球殼孢菌具有較強(qiáng)抑菌活性且抑菌譜廣泛的森吉木霉M75菌株作為研究對(duì)象，采用lllumina NovaSeq PE 150為依托的第二代測(cè)序技術(shù)對(duì)該菌株進(jìn)行基因組測(cè)序，通過(guò)基因組組分分析，基因通用功能注釋與效應(yīng)因子注釋，深入研究森吉木霉菌株M75生防功能的內(nèi)在機(jī)制，闡述并推測(cè)森吉木霉具有高強(qiáng)度抑菌活性的可能原因，擴(kuò)充生防木霉菌庫(kù)，為生防木霉的拮抗機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為微生物防治松枯梢病及其他重要林木病害的技術(shù)開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供基因組水平上的數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：森吉木霉M75由本實(shí)驗(yàn)室分離篩選獲得，現(xiàn)保藏于中國(guó)林業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)：CFCC54490。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌絲體收集

用打孔器打取直徑5 mm的森吉木霉M75菌餅，接入裝有250 mL PDB培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，置于28℃、180 r·min-1的搖床上振蕩培養(yǎng)96 h，得到森吉木霉M75的發(fā)酵液，收集30 mL發(fā)酵液于50 mL離心管中，4℃下10 000 r·min-1離心10 min，棄上清，取沉淀，收集菌絲體。

1.2.2 文庫(kù)構(gòu)建及庫(kù)檢

采用SDS法提取森吉木霉M75菌株樣本基因組DNA，通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)樣本DNA的純度，基于Qubit技術(shù)進(jìn)行定量分析。選取質(zhì)量檢測(cè)合格的DNA，通過(guò)Covaris超聲儀將目的DNA打斷成長(zhǎng)度約為350 bp的片段。處理完成后的DNA片段，按NEB試劑盒中的方法操作，進(jìn)行末端修復(fù)、加PolyA尾、純化和擴(kuò)增處理后，獲得所需文庫(kù)。建立好所需文庫(kù)后，通過(guò)Qubit 2.0熒光計(jì)（美國(guó)Invit-rogen公司）定量分析，先稀釋到2.0 ng·μL-1，檢測(cè)其插入片段，接頭引物長(zhǎng)度符合預(yù)期后，為保證文庫(kù)質(zhì)量，通過(guò)Q-PCR對(duì)其有效濃度準(zhǔn)確分析。

1.2.3 測(cè)序、組裝與組分分析

利用IlluminaNovaSeq PE 150，并按照有效濃度相關(guān)參數(shù)對(duì)不同文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。使用readfq（v10.0）軟件對(duì)采集數(shù)據(jù)中的低質(zhì)量數(shù)據(jù)部分過(guò)濾處理，過(guò)濾后得到的數(shù)據(jù)為有效數(shù)據(jù)。具體操作方法為：去除所含低質(zhì)量堿基中（Mass value在20以下）超過(guò)40%的reads，刪掉N堿基在10%及以上的reads，刪掉接頭引物序列重疊部分超過(guò)15 bp的reads，同時(shí)對(duì)可能來(lái)自于其他物種的信息進(jìn)行過(guò)濾，除去重復(fù)樣本污染。得到清潔數(shù)據(jù)后，對(duì)所獲得的樣本基因組進(jìn)行組裝，得到反映基因組基本情況的序列文件，并對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。具體處理流程如下：經(jīng)過(guò)預(yù)處理后得到Clean Data，使用SOAPdenovo（v2.04），SPAdes（v3.5.0）。ABySS（v1.4.8）組裝軟件進(jìn)行組裝，使用CISA（http：//sb.nhri.org.tw/CISA/en/CISA）軟件進(jìn)行整合；而為使組裝的序列更完整，需再次利用測(cè)序的雙末端數(shù)據(jù)配對(duì)關(guān)系鏈接contigs，同時(shí)基于相應(yīng)的覆蓋關(guān)系填充空隙。應(yīng)用Gapcloser（v1.1.2）軟件工具進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，過(guò)濾長(zhǎng)度低于50 bp的片段。使用Tandem RepeatFinder（v4.04）軟件預(yù)測(cè)串聯(lián)重復(fù)序列，根據(jù)重復(fù)單元長(zhǎng)度及數(shù)目篩選出其中的微衛(wèi)星以及小衛(wèi)星序列。具體測(cè)序和組裝過(guò)程由北京諾禾致源公司完成。

1.2.4 基本功能注釋

使用Diamond軟件（v0.9.10.111）針對(duì)編碼基因序列進(jìn)行不同數(shù)據(jù)庫(kù)的功能注釋，包括GO（Gene Ontology）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）、CAZy（Carbonhydrate-Active Enzymes Data-base）、KOG（Clusters of Orthologous Groupsfor Eukaryotic Complete Genomes）等功能基因數(shù)據(jù)庫(kù)。GO注釋采用InterPro（v66.0）軟件完成，KO及Pathway注釋使用KEGG的KAAS（v2.1）自動(dòng)化注釋系統(tǒng)，KOG注釋使用egg-NOG-mapper（v4.5）完成。相關(guān)基因功能注釋時(shí)依據(jù)如下的流程進(jìn)行：（1）將所預(yù)測(cè)基因的蛋白序列與各功能數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白序列進(jìn)行比較（evalue≤1e-5）；（2）將按默認(rèn)值（identity≥40%，coverage≥40%）對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行過(guò)濾，對(duì)所獲得的各序列的比對(duì)結(jié)果，確定出其中分值最高的進(jìn)行基因基本功能注釋。

1.2.5 效應(yīng)因子注釋

效應(yīng)因子注釋主要包括樣品全基因組中的分泌蛋白和次級(jí)代謝基因簇。在研究過(guò)程中通過(guò)SignaIP（v6.0）和TMHMM（v2.Oc）等軟件工具對(duì)其進(jìn)行預(yù)測(cè)，檢測(cè)全基因組序列中是否含有信號(hào)肽等與分泌蛋白相關(guān)的生物信號(hào)或結(jié)構(gòu)，并對(duì)所分析的蛋白序列是否為分泌蛋白進(jìn)行全面預(yù)測(cè)。采用antiSMASH程序（v6.1.1）對(duì)基因組進(jìn)行次級(jí)代謝基因簇預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)

森吉木霉M75全基因組總長(zhǎng)度為34 483 860bp，大小約34.5 MB，GC平均含量（鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶與全部堿基的摩爾百分比）為49.50%，共預(yù)測(cè)到9 315個(gè)編碼基因，編碼區(qū)的總長(zhǎng)度為15 352 435 bp，約1.50 MB，占全基因組總長(zhǎng)的44.52%．統(tǒng)計(jì)分析確定出其中編碼基因長(zhǎng)度1 648 bp。散在重復(fù)序列共2 674個(gè)，總長(zhǎng)度198 068 bp，在全基因組中占比0.57%；小衛(wèi)星DNA 2 768個(gè)，總長(zhǎng)度118 514 bp，占比為0.3%；微衛(wèi)星DNA 388個(gè)，總長(zhǎng)度16 186 bp，所占比例0.05%。詳見(jiàn)表1。

2.2 基本功能注釋

2.2.1 GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋

GO數(shù)據(jù)庫(kù)分析所得結(jié)果如圖1所示：分析此圖結(jié)果可知相應(yīng)的細(xì)胞組分共包括10類，其中細(xì)胞（cell）和細(xì)胞組分（cellpart）相關(guān)基因最多，分別注釋了2 511個(gè)。分子功能共包含12類，其中催化活性（catalyticactivity）相關(guān)基因最多，注釋了3 511個(gè)，其次為結(jié)合（binding）相關(guān)基因3 411個(gè)，相對(duì)較少的是伴金屬活性（metallochaperone activity）4個(gè)、電子載體活性（electron carrier activity）1個(gè)、通道調(diào)節(jié)劑活性（channel regulator activity）3個(gè)。生物過(guò)程共包含25類，基因注釋最多的功能為細(xì)胞過(guò)程（cellular process）3 527個(gè)、細(xì)胞代謝（metabotic process）3 560個(gè)，而節(jié)律過(guò)程（thythmic process）注釋1個(gè)、氮素利用（hitrogen utilization）注釋1個(gè)、細(xì)胞殺傷（cellkilling）注釋3個(gè)、生長(zhǎng)（gro注釋wth）2個(gè)、免疫系統(tǒng)過(guò)程（immune system process）注釋2個(gè)，這些功能涉及到的基因較少。

2.2.2 KEGG代謝通路數(shù)據(jù)庫(kù)注釋

在森吉木霉M75的代謝通路中，基因覆蓋率最高的類型是新陳代謝（metabolism），在新陳代謝二級(jí)分類單元下，全球地圖概覽（gloabal and overviewmaps）基因最多，注釋了927個(gè)，碳水化合物代謝（ca巾ohydrate metabolism）319個(gè)，氨基酸、脂類和能量代謝（Amino acids，lipids，andenergy metabolism）共596個(gè)；其他二級(jí)分類單元下，運(yùn)輸和分解代謝（transport and catabolism）277個(gè)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（signal transduction）238個(gè)，翻譯（translation） 301個(gè)，折疊分類和降解（folding，sorting and degradation）221個(gè)（圖2）。根據(jù)基因在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋中的富集分析可知（表2），在三級(jí)代謝通路中，森吉木霉M75全基因組中8 192個(gè)基因富集在KEGG中的383條不同的代謝通路中，其中，代謝途徑通路（metabolic pathways）共注釋848個(gè)基因、次生代謝產(chǎn)物的生物合成通路（biosynthesis ofsecondary metabolites）注釋330個(gè)基因、微生物代謝通路（microbial metabolism in diverseenvironments）240個(gè)、碳代謝通路（carbonmetabolism）112個(gè)。

2.2.3 碳水化合物活性酶（CAZy）數(shù)據(jù)庫(kù)注釋

森吉木霉M75菌株在CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)中的注釋結(jié)果表明，在森吉木霉M75的全基因組序列中，有259個(gè)與碳水化合物相關(guān)聯(lián)的糖苷水解酶GHs基因，30個(gè)氧化還原酶AAs基因，105個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶GTs基因，54個(gè)糖類結(jié)合組件CBMs基因，7個(gè)多糖裂解酶PLs基因，21個(gè)糖類脂解酶CEs基因（圖3）。

2.2.4 KOG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋

如圖4所示，在森吉木霉M75全基因組中，共有2 184個(gè)基因在KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得蛋白功能注釋，蛋白質(zhì)功能共分為24個(gè)類型，主要集中表現(xiàn)在一般通用功能預(yù)測(cè)（general function prediction only）241個(gè)、翻譯后的修飾，蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)及伴侶蛋白（posttranslational modification，protein turnover，chaperones） 211個(gè)、翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物合成（translation，ribosomal structure andbiogenesis） 202個(gè)、能量的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化（energyproduction and conversion） 191個(gè)、氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝（amino acid transport and metabolism）171個(gè)。在防御機(jī)制（defense mechanisms）注釋8個(gè)、核結(jié)構(gòu)（nuclear structure）6個(gè)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)（cell motility）1個(gè)，功能注釋較少。

2.3 效應(yīng)因子注釋

2.3.1 分泌蛋白預(yù)測(cè)

測(cè)序結(jié)果顯示森吉木霉M75具有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的蛋白個(gè)數(shù)為872個(gè)，具有跨膜結(jié)構(gòu)的1 798個(gè)，分泌蛋白703個(gè)。

2.3.2 次級(jí)代謝基因簇分析

預(yù)測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)如圖5所示：森吉木霉M75全基因組中共包含41個(gè)基因簇，共451個(gè)基因。其中，TIPKS型基因簇13個(gè)，包含135個(gè)基因，N RPS-like型10個(gè)，包含127個(gè)基因，NRPS型基因簇6個(gè)，包含75個(gè)基因，萜烯類terpene基因簇8個(gè)，包含43個(gè)基因，NRPS，TIPKS型3個(gè)，包含48個(gè)基因，NRPS，NRPS-like，TIPKS型1個(gè)，包含23個(gè)基因。

3 討論

木霉屬真菌由于其對(duì)各種生態(tài)條件及生存環(huán)境的高度適應(yīng)性和寄生拮抗等功能，在當(dāng)今農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中被廣泛用作商業(yè)生物殺菌劑。除此之外，木霉能成功作為生物防治劑還歸因于這些真菌能夠產(chǎn)生較多的次生代謝產(chǎn)物，這些次生代謝產(chǎn)物如細(xì)胞壁水解酶可以破壞寄主植物細(xì)胞壁，這些次生代謝產(chǎn)物的合成與各種基因的調(diào)控息息相關(guān)，因此從基因組層面探究木霉的代謝途徑及生物功能，成為全面開(kāi)發(fā)利用木霉屬真菌的必要手段。

本研究基于新一代測(cè)序技術(shù)對(duì)森吉木霉M75菌株完成了基因組測(cè)序，與哈茨木霉、綠木霉、深綠木霉等木霉屬中的近緣物種相比，他們的基因組大小較為接近，都約為35 MB左右。其中，森吉木霉M75在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得注釋的基因數(shù)目高達(dá)28 294個(gè)，遠(yuǎn)高于哈茨木霉Th-33的6 238個(gè)，碳水化合物酶相關(guān)的糖苷水解酶基因259個(gè)，高于子囊菌綱中發(fā)現(xiàn)的GHs的平均數(shù)量211個(gè)；糖基轉(zhuǎn)移酶GTs基因105個(gè)，與里氏木霉的103個(gè)相差不大，略高于平均水平96個(gè)；糖類脂解酶CEs基因21個(gè)，也略高于平均水平16個(gè)，多糖裂解酶PLs基因7個(gè)，低于平均水平18個(gè)。在次級(jí)代謝基因簇中，森吉木霉M75具有8個(gè)萜烯類terpenes基因簇。Croteau等人在對(duì)萜烯類物質(zhì)進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，萜烯是一大類具有高度多樣化功能的次生代謝產(chǎn)物，對(duì)植物病原菌具有一定的抵御能力。而TPS基因簇恰恰就是控制萜烯類物質(zhì)合成的次級(jí)代謝基因簇，這表明森吉木霉M75菌株強(qiáng)大的代謝合成能力可能與萜烯類基因簇的控制有關(guān)，這或許是生防菌株森吉木霉M75具有強(qiáng)抑菌活性的原因。本研究結(jié)果首次解析了森吉木霉全基因組信息，獲得了大量與次級(jí)代謝相關(guān)的功能基因，有助于全面了解木霉的生防機(jī)制，同時(shí)為更深層次進(jìn)行木霉屬真菌的功能基因研究奠定理論基礎(chǔ)并提供數(shù)據(jù)支持。

4 結(jié)論

本研究獲得了森吉木霉M75的基因組序列，全基因組總長(zhǎng)34 483 860 bp，GC含量49.50%，與木霉屬真菌特征相吻合。在GO數(shù)據(jù)庫(kù)共注釋了28 494個(gè)基因；在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中，森吉木霉M75全基因組中8 192個(gè)基因富集在KEGG中的383條不同的在三級(jí)代謝通路中，主要集中表現(xiàn)在代謝途徑（848個(gè)）、次生代謝產(chǎn)物的生物合成通路（330個(gè)）、抗生素的生物合成（243個(gè)）、微生物代謝通路（240個(gè)）、氨基酸的生物合成（118個(gè)）、碳代謝通路（112個(gè)）等與代謝或代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的通路中；共有2 184個(gè)基因在KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得蛋白功能注釋；在碳水化合物活性酶CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)中，共注釋了259個(gè)糖苷水解酶GHs基因，105個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶GTs基因，7個(gè)多糖裂解酶PLs基因，21個(gè)糖類脂解酶CEs基因，54個(gè)糖類結(jié)合組件CBMs基因；森吉木霉M75全基因組中共包含41個(gè)基因簇，451個(gè)基因，多數(shù)與次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成相關(guān)，存在較大開(kāi)發(fā)潛力。

（責(zé)任編輯：崔貝）

基金項(xiàng)目：北京市公園管理中心科技課題（ZX2024012）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題（2018YFC1200402）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31270682）