收稿日期：2023-12-07；修回日期：2024-04-16

基金項(xiàng)目：雄安新區(qū)科技創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)（2022XAGG0100）與國(guó)家自然科學(xué)基金（32371764）資助

作者簡(jiǎn)介：蘇浩天（1994-），男，滿(mǎn)族，黑龍江牡丹江人，博士研究生，主要從事草坪草分子育種研究，E-mail：suhaotian2023@163.com；*通信作者Author for correspondence E-mail：yinsx369@bjfu.edu.cn

摘要：MYB（MYB transcription factors）是一類(lèi)在植物生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆方面起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，其功能包含抗鹽脅迫、抗干旱脅迫、抗重金屬脅迫及抗病害脅迫等，它的基因家族屬于植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。本研究基于草地早熟禾‘巴潤(rùn)’（Poa pratensis ‘Baron’）前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用同源克隆及染色體步移技術(shù)，獲得了PpMYB2的705 bp的編碼序列（Coding sequence，CDS）及1115 bp的啟動(dòng)子序列。qRT-PCR結(jié)果顯示，PpMYB2在根中具有最高的表達(dá)量，其次是葉片在葉鞘中的表達(dá)量最低，同時(shí)，PpMYB2的表達(dá)可以響應(yīng)植物激素GA及ABA，并在干旱脅迫（15% PEG6000）及高鹽脅迫（150 mmol·L^-1 NaCl）下，呈現(xiàn)出表達(dá)量顯著上調(diào)的變化趨勢(shì)。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，該基因定位于細(xì)胞核中。啟動(dòng)子分析表明，該基因啟動(dòng)子區(qū)域含有生長(zhǎng)素、赤霉素等植物激素響應(yīng)元件及低溫、干旱等逆境響應(yīng)元件。由此表明，PpMYB2在植物響應(yīng)脅迫中起到重要作用，對(duì)其的進(jìn)一步研究對(duì)探索草地早熟禾抗逆機(jī)理具有指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：MYB基因；轉(zhuǎn)錄因子；基因克??；表達(dá)模式；亞細(xì)胞定位

中圖分類(lèi)號(hào)：Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-0435（2024）10-3071-09

Cloning，Bioinformatics Analysis and Subcellular Localization of PpMYB2 Gene in Poa pratensis L.

SU Hao-tian， LIU Man， YIN Shu-xia^*

（School of Grassland Science in Beijing Forestry University， Beijing 100093， China）

Abstract：MYB （MYB transcription factor） is a class of transcription factors that plays an important role in plant growth and stress resistance，including salt stress，drought stress，heavy metal stress，and plant disease resistance，its gene family is one of the largest transcription factor families in plants. Based on the transcriptome data of Poa pratensis ‘Baron’，we obtained a 705 bp CDS sequence and a 1115 bp promoter sequence of PpMYB2 by using homologous cloning and chromosome walking techniques. The qRT-PCR results showed that PpMYB2 had the highest expression level in the roots，followed by the leaves and the lowest expression level in the，it also respond to plant hormones such as GA and ABA treatment，and showed a significantly upregulated expression trend under drought stress （15% PEG6000） and salt stress treatments （150 mmol·L^-1 NaCl）. The subcellular localization results indicated that PpMYB2 was located in the nucleus. Promoter analysis showed that the promoter region of PpMYB2 contains plant hormone responsive elements such as auxin and gibberellin，as well as stress responsive elements such as low temperature and drought. These results suggested that PpMYB2 played an important role in plant response to stresses，and further research on it had a guiding significance for exploring its stress resistance mechanism in Poa pratensis.

Key words：MYB gene;Transcription factor;Gene cloning;Expression pattern;Subcellular localization

轉(zhuǎn)錄因子是植物體內(nèi)重要的一類(lèi)DNA結(jié)合蛋白，它可以特異性地結(jié)合在基因的啟動(dòng)子區(qū)域，從而調(diào)控基因的表達(dá)^［1］。MYB家族是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其中COLORED1（ZmMYBC1）是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的植物MYB轉(zhuǎn)錄因子，它參與調(diào)控玉米花青素的生物合成^［2］。MYB蛋白通常含有數(shù)個(gè)重復(fù)的SANT保守結(jié)構(gòu)域（R），通過(guò)R的數(shù)量可將MYB蛋白分為四個(gè)大類(lèi)：1R-MYB，R2R3-MYB，3R-MYB，4R-MYB，以及5R-MYB等非典型MYB^［3］，其中R2R3-MYB是MYB家族中數(shù)量最多的一類(lèi)，其對(duì)植物激素響應(yīng)、抗生物與非生物脅迫以及生長(zhǎng)代謝調(diào)節(jié)起到重要作用^［4］。與相對(duì)保守的結(jié)構(gòu)域區(qū)域相反，MYB蛋白的C端為可調(diào)節(jié)其蛋白活性的激活域^［5］，序列可變性高，與其基因家族個(gè)體行使的不同功能有關(guān)^［6］。

研究表明，R2R3-MYB基因家族在植物抗生物與非生物脅迫的過(guò)程中起重要作用，在植物遭受脅迫時(shí)，會(huì)通過(guò)鈣離子信s9uhMFqN0DhTbj1mKqYkUm0yBNg3pNglg7c76Q25OC4=號(hào)通路等途徑，激活細(xì)胞核中MYB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，其可以結(jié)合在植物抗逆相關(guān)基因的啟動(dòng)子上，調(diào)控此類(lèi)基因的表達(dá)^［7］。目前，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、大豆（Glycine max）、小麥（Triticum aestivum）、水稻（Oryza sativa）等多種植物中都鑒定出了R2R3-MYB基因家族成員^［8］。在擬南芥中，AtMYB2被證實(shí)與抗鹽脅迫相關(guān)^［9］，AtMYB15還可以通過(guò)與CBF轉(zhuǎn)錄因子（C-repeat binding transcription factors）的互作來(lái)影響擬南芥的抗冷脅迫反應(yīng)^［10］。在水稻中，R2R3-MYB基因OsFLP可以與OsNAC1和OsNAC6互作，從而正向調(diào)節(jié)水稻的抗旱反應(yīng)^［11］。在小麥中，R2R3-MYB基因TaODORANT1的過(guò)表達(dá)會(huì)使其抗旱性增強(qiáng)，抗氧化酶活性更強(qiáng)，活性氧（ROS）積累更低^［12］。同時(shí)，也有研究表明，MYB轉(zhuǎn)錄因子也參與了植物抗病的進(jìn)程，如過(guò)表達(dá)OsMYB110可以結(jié)合肉桂酸和石草酸通路中關(guān)鍵基因的啟動(dòng)子區(qū)域，激活其表達(dá)，促進(jìn)阿魏酸的積累，從而增強(qiáng)水稻的抗病性^［13］。

草地早熟禾是應(yīng)用廣泛的冷季型草坪草，其生長(zhǎng)速度快，再生能力強(qiáng)，抗逆性?xún)?yōu)秀，被稱(chēng)為“草坪之王”^［14］。隨著全球干旱氣候加劇^［15］，鹽堿土地面積不斷擴(kuò)大^［16］，草地早熟禾的抗旱和耐鹽性也受到了新的考驗(yàn)，在分子層面上研究其抗逆機(jī)理變得尤為重要，然而關(guān)于草地早熟禾R2R3-MYB基因家族成員的數(shù)量和特點(diǎn)還未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探究草地早熟禾MYB2基因的生物信息學(xué)特征與表達(dá)模式，從而對(duì)草地早熟禾抗逆機(jī)理研究及分子育種提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以草地早熟禾品種巴潤(rùn)作為材料，其種子購(gòu)于北京正道種業(yè)有限公司，種植于含3∶3∶1的草炭、蛭石、珍珠巖的營(yíng)養(yǎng)土中，并置于人工氣候箱內(nèi)晝夜溫度20℃/15℃、光周期12 h、光照度3000 lx、相對(duì)濕度60%進(jìn)行培養(yǎng)，至株高達(dá)到10 cm時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 草地早熟禾PpMYB2基因CDS序列及啟動(dòng)子序列的克隆 使用草地早熟禾巴潤(rùn)的前期轉(zhuǎn)錄組序列以及同源性較高的物種如小麥、大麥（Hordeum vulgare）、結(jié)縷草（Zoysia japonica）、多年生黑麥草（Lolium perenne）的基因組序列，通過(guò)同源克隆的技術(shù)，設(shè)計(jì)了基因片段引物（表1），經(jīng)普通PCR擴(kuò)增、TA克隆及測(cè)序獲得基因片段序列后，再通過(guò)染色體步移技術(shù)（Tail-PCR）^［17］設(shè)計(jì)三組特異性引物，使用三輪熱不對(duì)稱(chēng)交錯(cuò)巢式PCR獲得了CDS序列的5′端以及啟動(dòng)子區(qū)域的序列。通過(guò)NCBI BLAST（https：//blast.cnbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）及Bioedit 7.2.1^［18］軟件進(jìn)行多序列比對(duì)。

1.2.2 草地早熟禾PpMYB2基因的組織表達(dá)及誘導(dǎo)表達(dá)模式分析 根據(jù)獲得的CDS全長(zhǎng)序列，使用Primer Premier 5.0^［19］設(shè)計(jì)一對(duì)qRT-PCR引物（表1）。因草地早熟禾在日常使用中最重要的三個(gè)組織部位為葉片、葉鞘和根部，故取成熟植株的葉片、葉鞘和根部組織分別測(cè)定PpMYB2相對(duì)表達(dá)量，并設(shè)置三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。誘導(dǎo)表達(dá)方面設(shè)置5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組（CK）為正常澆灌（30 mL純凈水澆透）、GA處理組正常澆灌并噴施250 mg·L^-1的GA3水溶液^［20］10 mL、ABA處理組正常澆灌并噴施50 μmol·L^-1的ABA水溶液^［21］10 mL、干旱處理組澆灌30 mL 15% PEG6000水溶液^［22］、高鹽處理組澆灌30 mL 150 mmol·L^-1 NaCl水溶液^［23］，每組設(shè)置三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，因草地早熟禾的坪觀質(zhì)量主要取決于葉片形態(tài)，故分別于處理的0 h，1 h，6 h，12 h，24 h，48 h取葉片樣本并分別測(cè)定PpMYB2相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR分析 RNA提取試劑盒OMEGA Plant RNA Kit（50），貨號(hào)R6927-019，購(gòu)于美國(guó)OMEGA公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimerScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time），貨號(hào)RR047A，qRT-PCR試劑盒TB Green Premix Ex Taq^TM II FAST qPCR，貨號(hào)CN830A，均購(gòu)于TAKARA公司（北京）。在qRT-PCR中每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)3個(gè)技術(shù)重復(fù)，使用2^-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，內(nèi)參基因選用草地早熟禾的PpActin基因^［24］（表1）。

1.2.4 草地早熟禾PpMYB2基因的生物信息學(xué)分析 利用在線ExPAsy工具（https：//web.expasy.org/protparam）預(yù)測(cè)草地早熟禾PpMYB2預(yù)測(cè)蛋白的理化性質(zhì)，包括氨基酸數(shù)量、分子量、分子式、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定性指數(shù)、脂肪族指數(shù)、親水系數(shù)及保守性^［25］；利用在線Predict protein工具（https：//predictprotein.org）對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)^［26］；利用在線SWISS MODEL工具（https：//swissmodel.expasy.org）對(duì)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)^［27］；利用在線Interpro工具（https：//www.ebi.ac.uk/interpro）對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析^［28］。利用在線YLoc工具（https：//abi-services.cs.uni-tuebingen.de/yloc/webloc.cgi）預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位^［29］；利用在線PlantCARE工具（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare）對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行順式元件的分析^［30］，利用TB tools 2.056對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化^［31］。

1.2.5 草地早熟禾PpMYB2基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 利用MEGA 10.0軟件中的Neighborhood Join法^［32］，分析擬南芥、丹參（Salvia miltiorrhiza）、苦蕎麥（Fagopyrum tataricum）、大豆、玉米（Zea mays）、羊草（Leymus chinensis）、水稻、小麥、節(jié)節(jié)麥（Aegilops tauschii）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、草地早熟禾的MYB基因家族，并使用氨基酸序列繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，利用在線iTOL工具（https：//itol.embl.de）對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行美化^［33］。

1.2.6 亞細(xì)胞共定位分析 采用同源重組法，將PpMYB2基因連接于pBWA（V）HS亞細(xì)胞定位載體的GFP熒光蛋白序列之前，構(gòu)建重組載體PpMYB2-GFP-pBWA（V）HS，再準(zhǔn)備含細(xì)胞核Marker nls蛋白（氨基酸序列為MDPKKKRKV）與mkata熒光蛋白的重組載體nls-mkata-pBWA（V）HS，并將二者使用凍融法轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101中，在28℃的搖床內(nèi)以180 r·min^-1的轉(zhuǎn)速避光培養(yǎng)至OD600=0.6，再采用表皮注射法將兩種農(nóng)桿菌菌液同時(shí)注射至本生煙草葉片背部^［34］，于人工氣候箱內(nèi)20℃暗培養(yǎng)48 h后置于共聚焦顯微鏡下觀測(cè)熒光，其中GFP熒光蛋白的激發(fā)光波長(zhǎng)為400 nm，mkate熒光蛋白的激發(fā)光波長(zhǎng)為561 nm。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 23.0（SPSS Inc.，USA）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析^［35］，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差表示測(cè)定結(jié)果，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用t檢驗(yàn)方法，采用GraphPad Prism 9進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化^［36］。

2 結(jié)果與分析

2.1 PpMYB2的CDS序列及編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

使用同源克隆及染色體步移技術(shù)，設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物PpMYB-CDS-F/R，經(jīng)PCR獲得約700 bp的CDS序列，測(cè)序結(jié)果顯示其長(zhǎng)度為705 bp，共編碼234個(gè)氨基酸（圖1A-1B）。

如表2所示，PpMYB2編碼蛋白的分子量為27 005.46；分子式為C1184H1841 N345O357S12；等電點(diǎn)為5.60，屬于酸性蛋白質(zhì)，在中性環(huán)境中帶負(fù)電荷；不穩(wěn)定性系數(shù)為62.17，屬于不穩(wěn)定蛋白；脂肪族系數(shù)為74.66；親水性系數(shù)為-0.64，屬于親水性蛋白質(zhì)。

2.2 PpMYB2的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析及保守性分析

通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析得知，PpMYB2屬于典型的R2R3-MYB類(lèi)群，其與水稻、小麥、節(jié)節(jié)麥、二穗短柄草等禾本科植物的MYB基因進(jìn)化親緣關(guān)系較近，與擬南芥、玉米、丹參等植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖2）。保守性分析結(jié)果顯示，PpMYB2的氨基酸序列在5′端趨于保守，而在3′端趨于多變（圖3B）。

2.3 PpMYB2編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域（Motif）分析

通過(guò)結(jié)構(gòu)域分析可以得知，PpMYB2基因含有兩個(gè)MYB基因家族保守的SANT結(jié)構(gòu)域（R）（圖3A），故其為典型的R2R3-MYB基因，這些結(jié)構(gòu)域在MYB基因作為轉(zhuǎn)錄因子執(zhí)行功能時(shí)，具有結(jié)合目的基因啟動(dòng)子區(qū)域靶標(biāo)DNA的功能。

2.4 PpMYB2編碼蛋白的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及亞細(xì)胞定位

通過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析可以得知，PpMYB2蛋白的主要結(jié)構(gòu)為無(wú)規(guī)則卷曲，占整體的77.77%，其次為α-螺旋，占整體的20.51%，最少的是β-螺旋，占整體的1.28%。其中α-螺旋和β-螺旋集中在R2-R3結(jié)構(gòu)域中（圖4A）；通過(guò)三級(jí)結(jié)構(gòu)分析可以得知，PpMYB2蛋白含有兩個(gè)連續(xù)的SANT結(jié)構(gòu)域（R），并且這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間存在180°的折疊，這個(gè)空間構(gòu)象決定了它可以利用這個(gè)折疊的結(jié)構(gòu)域區(qū)域結(jié)合靶標(biāo)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，行使其作為轉(zhuǎn)錄因子的功能（圖4B）。

通過(guò)煙草瞬時(shí)表達(dá)分析可以得知，PpMYB2與細(xì)胞核Marker共同定位于細(xì)胞核內(nèi)（圖4C）。

2.5 PpMYB2的啟動(dòng)子序列順式元件分析

通過(guò)染色體步移技術(shù)^［17］lVaNQhnvvaSerg//E0EGugWWcsXOYDoRRDiBqflEUEg=，利用已知序列片段設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增獲得1115 bp的啟動(dòng)子序列。通過(guò)啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件分析可以得知，PpMYB2的啟動(dòng)子區(qū)域除含有TATA-box等植物通用元件、MYB特征元件、MYB及MYC結(jié)合位點(diǎn)之外，還含有生長(zhǎng)素（AUX）、赤霉素（GA）、脫落酸（ABA）、茉莉酸甲酯（MeJA）等植物激素的響應(yīng)元件，以及誘導(dǎo)光反應(yīng)、低溫反應(yīng)、干旱反應(yīng)、冷脅迫反應(yīng)、厭氧反應(yīng)的響應(yīng)元件（圖5），這些順式作用元件可以在植物激素誘導(dǎo)反應(yīng)及抗逆反應(yīng)中起到重要作用。

2.6 PpMYB2的空間表達(dá)分析及誘導(dǎo)表達(dá)分析

如圖6所示，qRT-PCR分析表明，在草地早熟禾的不同組織中，根部的PpMYB2相對(duì)表達(dá)量最高，為葉片的4.923倍；而葉鞘的PpMYB2相對(duì)表達(dá)量最低，為葉片的0.253倍（圖6E）。在未經(jīng)處理時(shí)，對(duì)照組的PpMYB2表達(dá)量沒(méi)有顯著變化；經(jīng)GA處理后，PpMYB2的表達(dá)呈先下降后上升的趨勢(shì)，其表達(dá)量從1 h開(kāi)始顯著上升（P<0.05），在24 h表達(dá)量最低，為0 h的0.54倍，在48 h表達(dá)量顯著上升（P<0.05），為0 h的0.80倍（圖6A）；ABA處理后，PpMYB2的表達(dá)呈先下降后上升的趨勢(shì)，與GA處理相似，其表達(dá)量從1 h開(kāi)始顯著下調(diào)（P<0.05），在12 h表達(dá)量最低，為0 h的0.41倍，在24 h表達(dá)量顯著上升（P<0.05），為0 h的0.70倍，在48 h表達(dá)量上升為0 h的1.03倍（圖6B）；NaCl處理后，PpMYB2的表達(dá)呈先上升后下降的趨勢(shì)。其表達(dá)量從6 h開(kāi)始顯著上升（P<0.05），為0 h的2.40倍，在12 h表達(dá)量相較6 h顯著下降（P<0.05），為6 h的0.39倍（圖6C）；PEG6000處理后，PpMYB2的表達(dá)呈一直上升的趨勢(shì)。其表達(dá)量從1 h開(kāi)始顯著上升（P<0.05），為0 h的2.43倍，在48 h表達(dá)量再次顯著上升（P<0.05），為0 h的4.81倍（圖6D）。

可以得知，在GA處理和ABA處理后，PpMYB2的表達(dá)量均為先下降后回升，說(shuō)明該基因?qū)χ参锛に谿A和ABA存在響應(yīng)，并呈現(xiàn)出相似的表達(dá)模式（圖6A-6B）；在NaCl和PEG6000處理后，PpMYB2表達(dá)量均有上升，說(shuō)明該基因受到鹽脅迫和干旱脅迫的誘導(dǎo)，但二者表達(dá)模式存在差異（圖6C-6D）。

3 討論

MYB轉(zhuǎn)錄因子家族是植物最大基因家族之一，這些MYBs可分為數(shù)個(gè)亞族，其中最大的兩個(gè)亞族為R1-MYB和R2R3-MYB^［37］。多項(xiàng)研究表明，R2R3-MYB在植物抗逆境脅迫中起重要作用^［38］，研究R2R3-MYB在植物抗逆進(jìn)程中發(fā)揮的作用與機(jī)理，是近些年研究的熱點(diǎn)之一，而隨著研究的不斷深入，對(duì)于R2R3-MYB的研究也從雙子葉植物向單子葉植物比如禾本科植物中拓展^［39］。

本研究中，我們鑒定了一個(gè)草地早熟禾巴潤(rùn)的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子PpMYB2，其與其他單子葉植物如小麥、水稻等的MYB基因親緣關(guān)系較近，與擬南芥等雙子葉植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)與三級(jí)結(jié)構(gòu)分析及結(jié)構(gòu)域分析表明，該蛋白的α-螺旋及β-折疊集中于其兩個(gè)重復(fù)SANT結(jié)構(gòu)域區(qū)域，這與在大豆MYB124中研究的結(jié)果類(lèi)似^［40］，此空間構(gòu)象可能與其結(jié)構(gòu)域行使功能相關(guān)。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示其定位于細(xì)胞核內(nèi)，符合其作為轉(zhuǎn)錄因子的特征，但在其他物種如瓠瓜中MYB基因卻可能定位于其他部位，比如細(xì)胞質(zhì)膜或細(xì)胞外^［41］。

保守性分析顯示，PpMYB2在5′端重復(fù)SANT結(jié)構(gòu)域的區(qū)域趨于保守，而在3′端的可變區(qū)趨于多變，這與MYB基因在不同器官、組織或物種中的功能多樣化相關(guān)^［42］，比如在擬南芥中AtMYB44可以調(diào)控氣孔的關(guān)閉，使擬南芥響應(yīng)各種逆境脅迫^［43］，AtMYB33可以促進(jìn)擬南芥的生殖發(fā)育^［44］，同時(shí)有研究表明，在瓠瓜（Lagenaria siceraria）中MYB基因可以響應(yīng)白粉菌的侵染^［40］，揭示了其在植物抗病方面可能也起到重要作用。

誘導(dǎo)表達(dá)分析和啟動(dòng)子序列分析表明，PpMYB2具有響應(yīng)多種植物激素及逆境脅迫的能力，如生長(zhǎng)素、赤霉素、脫落酸、茉莉酸甲酯及干旱脅迫、高鹽脅迫、冷脅迫等。在非洲菊（Gerbera jamesonii）中，GhMYB4與GhMYB5在GA3處理后表達(dá)量下調(diào)，這與本研究中的結(jié)論相似，而GhMYB1與GhMYB3在GA3處理后表達(dá)量上調(diào)^［45］；在葡萄（Vitis vinifera）中，VvMYB95在ABA處理后表達(dá)量下調(diào)，這與本研究中的結(jié)論相似，而另外8個(gè)VvMYB基因在ABA處理后表達(dá)量上調(diào)^［46］，這些說(shuō)明了MYB基因家族在植物激素響應(yīng)模式上存在差異性。在棗樹(shù)（Ziziphus jujuba）中，9個(gè)ZjMYB基因受到鹽處理后表達(dá)量上調(diào)^［47］，在藍(lán)莓（Vaccinium）中，4個(gè)VcMYB基因在受到干旱處理后表達(dá)量上調(diào)^［48］，這些與本研究中的結(jié)論相似，但這些基因上調(diào)表達(dá)的起始時(shí)間存在很大差異^［47-48］，說(shuō)明了MYB基因家族在脅迫響應(yīng)方面存在時(shí)間差異性，這些差異可能與其行使不同功能相關(guān)。

同時(shí)，在蘋(píng)果樹(shù)（Malus pumila）中，MYB88可以在干旱條件下參與脫落酸的合成^［49］；在水稻中，MYB102可以抑制脫落酸的合成^［50］；在粳稻（Oryza sativa subsp. japonica）中，MYB1可以在低磷脅迫下參與赤霉素的合成^［51］，由此推測(cè)MYB基因家族參與植物抗逆的機(jī)理可能與調(diào)控植物激素的水平相關(guān)。除影響植物的抗逆外，MYB還可以調(diào)控一些萜類(lèi)物質(zhì)的生物合成，如丹參酮、紫杉醇、青蒿素、類(lèi)胡蘿卜素、羅勒烯、蟲(chóng)菊素等^［8］，展示了其在功能上的多樣性。

由此可見(jiàn)，對(duì)草地早熟禾MYB基因家族的研究，在研究植物抗逆機(jī)理以及分子育種的領(lǐng)域具有重要意義，PpMYB2可以作為一個(gè)重要的分子指標(biāo)或分子育種的候選基因，在后續(xù)的研究中用以提高草地早熟禾的抗逆性。

4 結(jié)論

本研究鑒定了草地早熟禾的一個(gè)R2R3-MYB基因PpMYB2的705 bp的CDS序列及1115 bp的啟動(dòng)子序列。PpMYB2在不同的組織中存在表達(dá)量的差異，在根中最高，在葉鞘中最低，其表達(dá)對(duì)植物激素GA及ABA具有響應(yīng)，且在兩種激素誘導(dǎo)下的表達(dá)模式相似，均為在48 h內(nèi)先下降后上升。該基因也可被干旱脅迫和鹽脅迫誘導(dǎo)，但在兩種脅迫下表達(dá)模式不一致。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，該基因定位于細(xì)胞核中，符合其作為轉(zhuǎn)錄因子的特性。順式元件分析表明，PpMYB2的啟動(dòng)子區(qū)域含有多種植物激素反應(yīng)元件及植物逆境反應(yīng)元件。這些結(jié)論揭示了研究MYB基因家族對(duì)研究草地早熟禾抗逆機(jī)理所具備的潛力。

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（責(zé)任編輯 劉婷婷）