摘要：柴胡（Bupleurum chinense DC.）為傘形科柴胡屬多年生草本植物，以根入藥。柴胡生產(chǎn)中種質(zhì)混雜較為嚴重，新品種選育勢在必行。為完善柴胡植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性（Distinctness，uniformity and stability，DUS）測試指南，本試驗收集了22份不同產(chǎn)地柴胡，對二年生與三年生柴胡基于形態(tài)學性狀開展了DUS測試指南的研制，與原指南相比，增加了根的產(chǎn)量與含量相關(guān)的性狀，最終確定了41個測試性狀，其中包括24個必測的基本性狀，17個選測性狀；有質(zhì)量性狀0個、假質(zhì)量性狀15個和數(shù)量性狀26個；涉及到植株性狀6個、莖性狀4個、葉性狀7個、基生葉性狀7個、花性狀6個、根性狀10個、生育期性狀1個。本指南為我國柴胡性狀測試、新品種的授權(quán)提供了支撐，對柴胡新品種選育具有重大意義。

關(guān)鍵詞：柴胡；DUS；性狀

中圖分類號：S567.79 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0435（2024）10-3121-12

Development of DUS Test Guide for New Bupleurum Chinense Varieties

HE Long-jiao^1#， SUN Zhe^1#， FAN A-mei¹， DU Xiao-rong¹， LI Ao-xuan¹， LI Jia-jie³， SONG Yun^1，2， QIAO Yong-gang^1，2*

（1. College of Life Sciences， Shanxi Agricultural University， Taigu，Shanxi Province 030801， China; 2. Shanxi key lab.for Modernization of TCVM， Taigu， Shanxi Provinc 030801， China; 3. College of Traditional Chinese Medicine， Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 301617， China）

Abstract：Bupleurum chinense DC. is a perennial herb of the genus Bupleurum in the Umbelliferae family，and its root can be used as medicine. The germplasm is seriously mixed in the production of Bupleurum chinense，and it is imperative to breed new varieties. In order to improve the DUS （Distinctness，uniformity and stability） test guidelines for Bupleurum chinense，22 samples of Bupleurum chinense from different habitats were collected in this study. The DUS test guidelines for 2-year-old and 3-year-old Bupleurum chinense were developed based on morphological traits，and the traits related to yield and content were added to prepare a more complete draft of DUS test guidelines for Bupleurum chinense medicinal plants in contrast to the original guidelines. A total of 41 traits were selected as the test traits of the DUS test guide for Bupleurum chinense，including 24 basic tested traits and 17 selected traits;there were 0 quality traits，15 false quality traits and 26 quantitative traits. It involved 6 plant traits，4 stem traits，7 leaf traits，7 basal leaf traits，6 flower traits，10 root traits，and 1 growth period trait. This guideline improves the lack of some traits and effective components in the DUS test guideline of Bupleurum chinense，which is of great significance for the breeding of new varieties of Bupleurum chinense in the future.

Key words：Bupleurum chinense；DUS；Characteristics

收稿日期：2024-02-23；修回日期：2024-04-06

基金項目：山西省基礎(chǔ)研究計劃自然科學研究面上項目（20210302123390）；山西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（2024）；山西農(nóng)業(yè)大學科技創(chuàng)新提升工程項目（CXGC2023041）資助

作者簡介：

#何龍嬌（2000-），女，漢族，山西運城人，碩士研究生，主要從事藥用植物遺傳學研究，E-mail：3219915173@qq.com；#孫哲（1997-），男，漢族，山西河津人，碩士研究生，主要從事藥用植物遺傳學研究，E-mail：297093122@qq.com；*通信作者Author for correspondence，Email：sxndqyg@126.com

柴胡是傘形科植物柴胡（Bupleurum chinense DC.）或狹葉柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Willd.）的干燥根^［1］，具有鎮(zhèn)痛、抗炎抗氧化^［2］、抗抑郁^［3］、保肝、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用^［4-5］。柴胡皂苷為柴胡主要活性成分，具有抗炎、抗癲癇、抗腫瘤和護肝等功效^［6-7］。目前，在柴胡中已發(fā)現(xiàn)了超過75種柴胡皂苷^［8］，含量較高的皂苷包括皂苷a（SS-a）、皂苷b（SS-b）^［9］、皂苷c（SS-c）、皂苷d（SS-d）、皂苷e（SS-e）和皂苷f（SS-f）^［10］。2020版《藥典》規(guī)定柴胡皂苷a（saikosaponin a，SSa）和柴胡皂苷d（saikosaponin d，SSd）在柴胡中的總量必須大于等于0.30%^［11］。

植物新品種的特異性（distinctness）、一致性（uniformity）和穩(wěn)定性（stability）（簡稱DUS）是授予植物新品種權(quán)的重要依據(jù)^［12］。我國育種工作者選育出多個柴胡新品種，賈和田等^［13］選育了‘冀柴1號’；李玉春等^［14］經(jīng)過系統(tǒng)選育、雜交育種培育出‘濟柴1號’。在新品種選育、認定和保護過程都需要用到DUS測試指南，已發(fā)布實施的柴胡DUS測試指南存在植株生長年限不明確^［15］、測試性狀不全面和化學成分相關(guān)性狀缺失的問題，為了更好地鑒定與評價柴胡種質(zhì)，急需對柴胡DUS測試指南進行補充與完善。

本試驗以22個不同產(chǎn)地的柴胡種質(zhì)為材料，通過對二年生和三年生柴胡植株性狀以及主要化學成分性狀的觀察與測量，確定了數(shù)量性狀的分級標準，對質(zhì)量性狀與假質(zhì)量性狀賦代碼，通過補充完善形成了針對二年生與三年生柴胡的DUS測試指南，為柴胡的新品種的選育與保護提供DUS測試依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究收集22份不同產(chǎn)地柴胡的栽培種質(zhì)包括山西、陜西、甘肅、河北多個地區(qū)，22份柴胡種質(zhì)詳見表1，其中二年生柴胡共214株，三年生柴胡共197株。

1.2 DUS測試指南研制依據(jù)

根據(jù)我國《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南總則》（GB/T19557.1）的要求^［16］，綜合分析我國柴胡屬植物分類的相關(guān)技術(shù)與方法，植物便于直接觀測的表型形態(tài)特征作為優(yōu)先選擇的性狀，輔測性狀主要有生理性狀、化學成分等。

1.3 田間試驗

2020年6月，將收集到的22份柴胡種子種植在山西農(nóng)業(yè)大學申奉柴胡種質(zhì)資源圃（北緯37°25′，東經(jīng)112°25′），二年生植株性狀于2021年7-8月柴胡進入盛花期后開始測量，采用5點取樣法，每個點觀測2株樣本，每個樣本的觀測部位取樣數(shù)量為1，在田間對柴胡植株進行地上部分形態(tài)特征的觀察，觀測完地上性狀后對其進行掛牌標記，11月地上部分枯萎后對其取根進行地下性狀的測量。三年生植株性狀于2022年7-8月將其整株挖出開始測量，方法同二年生。柴胡植株各生育時期及代碼見表2。

1.4 性狀檢測方法

柴胡地上部分性狀檢測方法：株高為植株基部到花序頂部的長度，在測量時對植株進行扶正，使用卷尺測量；葉的性狀均為觀測植株主莖中部葉片的性狀，基生葉測量時選取最大的葉片進行測量，其中葉長、葉寬采用直尺測量；莖的性狀均為觀測植株主莖距離地面第10節(jié)莖的性狀，莖粗用游標卡尺測量，節(jié)間長用直尺測量；花的性狀均為觀測植株主莖最頂端的花。葉形、葉尖形狀、葉色、莖的顏色等性狀為假質(zhì)量性狀，采用統(tǒng)一標準目測進行記錄。

地下性狀測量方法：根長為主根的長度（沒有主根的測量其最粗的根的長度），使用直尺進行測量，根粗測量部位為蘆頭下方1 cm處的粗度，使用游標卡尺進行測量，鮮重為根去除泥土之后的重量，干重為鮮重烘干水分后的重量，均使用電子天平進行稱量，根色使用比色紙進行比對。

柴胡皂苷含量參照2020版《中國藥典》的方法進行測定^［17］。

1.5 標準品種的選擇

選擇性狀穩(wěn)定的品種作為標準品種^［18］，對所有的種質(zhì)性狀賦代碼值，篩選性狀最為均一的種質(zhì)，將該種質(zhì)的該性狀作為標準性狀。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

通過Excel計算出各數(shù)量性狀的最小值、最大值、平均值和標準差，參照褚云霞等^［19］的方法對各數(shù)量性狀進行分級，分級數(shù)是根據(jù)中值和級差而確定的。特異性與一致性的判斷通過統(tǒng)計分析數(shù)量性狀數(shù)據(jù)標準差（S）和變異系數(shù)（CV），穩(wěn)定性可通過分析柴胡兩個相同獨立生長季節(jié)表型性狀的分布情況得出，其數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用t檢驗^［20］。

其中：極差=最大值－最小值；

級數(shù)1=極差/（標準差平均值×2）；

級數(shù)2是級數(shù)1按照1、3、5、7、9的就小取值；

級差=極差/級數(shù)2。

式中，X為第j個性狀第i個植株的觀測值，x-為第j個性狀的平均值，n為每個性狀觀測的樣本量。

2 結(jié)果與分析

2.1 測試性狀的選擇與確定

通過查閱資料與田間實際觀察，初步選定了45個性狀作為柴胡DUS測試的候選性狀。在將觀測不便、極易受環(huán)境影響、難以描述、相關(guān)性強的性狀刪除后，篩選出41個性狀（表3），包括24個必測的基本性狀，17個選測性狀。其中有質(zhì)量性狀0個、假質(zhì)量性狀15個和數(shù)量性狀26個；涉及到植株性狀6個、莖性狀4個、葉性狀7個、基生葉性狀7個、花性狀6個、根性狀10個、生育期性狀1個。

2.2 數(shù)量性狀的描述與分級

2.2.1 二年生柴胡植株數(shù)量性狀的描述與分級 22個產(chǎn)地的二年生柴胡植株數(shù)量性狀的變異系數(shù)分布在14%～63%之間，性狀27（花：小苞數(shù)量）變異系數(shù)小于15%，其余性狀變異系數(shù)均大于15%，表明各性狀種間差異大。根的分支數(shù)、鮮重、干重以及柴胡皂苷含量的變異系數(shù)均大于50%，柴胡皂苷d<柴胡皂苷a<根分支數(shù)<根干重<根鮮重，表明柴胡根部性狀種間差異極大，詳見表4。性狀4，5，8，9，15，16，22，23，25，29，30，33分成3個連續(xù)分布的分級范圍；性狀2，3，6，17，26，27，34，35，36，37，38，39，40分成5個連續(xù)分布的分級范圍；性狀24分成7個連續(xù)分布的分級范圍，詳見表5。

2.2.2 三年生柴胡植株數(shù)量性狀的描述與分級 柴胡植株到盛花期基生葉絕大多數(shù)已經(jīng)枯萎，將基生葉相關(guān)的所有性狀去除。小苞數(shù)量在測試時僅有2株為6個，其余植株均為5個，變異系數(shù)為1%，特異性極低，在分級時將該性狀去除。其他性狀的變異系數(shù)分布在17%～72%之間，均大于15%，表明各性狀種間差異大。植株的叢生莖，根的分支數(shù)、鮮重、干重以及柴胡皂苷含量的變異系數(shù)均大于50%，表明柴胡根部性狀種間差異大，植株叢生莖種間差異極大，詳見表6。性狀2，4，5，8，16，25，26，29，30，33，35，36，37，39，40分成3個連續(xù)分布的分級范圍；性狀3，6，9，15，17，34，38分成5個連續(xù)分布的分級范圍，詳見表7。

2.3 假質(zhì)量性狀賦值

為了便于觀測與記錄，對假質(zhì)量性狀的每個表達狀態(tài)進行賦代碼。根據(jù)實際觀察情況，將性狀1，7，10，11，12，14，18，19，20，21，28，41分為3個類別，將性狀13與32分為4個類別，性狀31分為7個類別。

2.4 標準品種的選擇

植物DUS測試指南需要標準品來進行參考，以減少不確定因素引起的差異。通過對22個產(chǎn)地柴胡性狀數(shù)據(jù)的整理，找出表達穩(wěn)定的產(chǎn)地的性狀作為標準性狀。選定CH3為性狀1收斂型的標準性狀，CH6為松散型的標準性狀；選定CH20為性狀2中的標準性狀；CH4為性狀6中的標準性狀；CH13為性狀10光滑的標準性狀；CH8為性狀11深的標準性狀；CH1為性狀13線性的標準性狀；CH3為性狀13線狀披針形的標準性狀；CH9為性狀14等于1的標準性狀；CH11為性狀15短的標準性狀；CH11為性狀18深的標準性狀；CH3為性狀20短的標準性狀；CH4為性狀26中的標準性狀；CH2為性狀32中間型的標準性狀；CH14為性狀33少的標準性狀，CH21為中的標準性狀；CH18為性狀34短的標準性狀；CH6為性狀35中的標準性狀；CH11，CH8，CH6分別為性狀41早、中、晚的標準性狀。

2.5 柴胡DUS測試指南性狀表

通過對二年生與三年生柴胡數(shù)量性狀分級，假質(zhì)量性狀賦值及標準品種選擇，繪制出柴胡植物新品種DUS測試指南性狀表，詳見表8。

3 討論

我國自1999年加入國際植物新品種保護聯(lián)盟（UPOV）以來，植物品種的特異性、一致性和穩(wěn)定性（DUS）測試為品種保護、審定和登記等提供技術(shù)依據(jù)，在使優(yōu)良種質(zhì)得到較好保護的同時，也會促進種質(zhì)資源開發(fā)與利用。DUS測試中表型性狀描述是否足夠多、詳細，對品種保護也十分重要^［21］。孫建軍等^［22］以164份紫云英為材料，通過多年種植，確定了包括生長習性、開花期、越冬性等33個測試性狀。伍豐宇等^［20］對56份包括商業(yè)、栽培、穩(wěn)定品種的野牛草進行觀測，加入花、葉性狀等28個性狀，較全面概括了野牛草的表型性狀。育種事業(yè)以及新品種不斷涌現(xiàn)的同時，許多現(xiàn)有的DUS測試部分性狀不再適用。如紀軍建等^［23］對153份谷子新品種的14個數(shù)量性狀進行分級研究，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有谷子測試指南中許多數(shù)量性狀的分級標準不再適用；賴運平等^［24］利用現(xiàn)有玉米DUS測試指南中的基本性狀，對2020年四川省聯(lián)合體區(qū)試玉米品種的表型進行多樣性分析，發(fā)現(xiàn)其對糯玉米和甜糯型玉米的區(qū)分效果不甚理想。

本試驗最初篩選了45個性狀，檢測中發(fā)現(xiàn)植株形態(tài)表型有直立型和匍匐生長型，在田間觀察時，柴胡所有產(chǎn)地的植株均直立生長；柴胡所有的莖均為空心；柴胡的花均為黃色，顏色無明顯區(qū)別，不滿足特異性的要求，因此將以上4個性狀刪除。柴胡總皂苷包括柴胡皂苷a和d以及其他柴胡皂苷的總和，具有極強的相關(guān)性，因此刪除。24個基本性狀除柴胡皂苷a和d的含量為藥用植物特別重要的性狀外，其余性狀在二年生柴胡植株和三年生柴胡植株中可直接觀察或測量，均有明顯的特征。

本指南與現(xiàn)有的柴胡與狹葉柴胡植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南（NYT 2589-2014）相比，將二年生與三年生的柴胡分開進行DUS測試指南的研制，制定不同的分級標準，在使用時更具有針對性。藥用植物為經(jīng)濟作物，產(chǎn)量在生產(chǎn)中很重要，將柴胡的產(chǎn)量性狀（鮮重、干重、干鮮比）列入指南，更加有利于生產(chǎn)中挑選高產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)品種。近年來有部分中藥材均有將產(chǎn)量相關(guān)的性狀加入指南中，如黃芪DUS測試指南（NYT 2592-2014）^［25］中包括單根鮮重、干重等性狀；方明雅等^［26］在菱屬DUS測試指南中加入果實鮮重及干重等性狀。同時本指南還加入了有效成分（柴胡皂苷a和柴胡皂苷d）含量，彌補了藥用植物測試指南中化學成分的缺失，豐富了測試指南的內(nèi)容，也體現(xiàn)了藥用植物本身的特異性。本指南中所選的標準品種的性狀在二年生和三年生植株中均穩(wěn)定表達，更具有代表性，滿足標準品種的要求。

本指南對性狀的完善有利于提高柴胡DUS測試的科學性，豐富了柴胡表型性狀，今后可基于表型性狀對柴胡進行遺傳多樣性分析，促進柴胡選種育種事業(yè)的發(fā)展。如張曉娟等^［27］對55個紫花苜蓿品種農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量性狀進行分析及綜合評價，以提高新品種選育效率。王鳳宇等^［28］以590份燕麥營養(yǎng)器官表型性狀進行遺傳多樣性分析，明確燕麥各性狀之間的相關(guān)關(guān)系，進而為燕麥育種和種質(zhì)資源創(chuàng)新利用提供理論依據(jù)。在國內(nèi)外植物新品種保護不斷發(fā)展的同時，及時發(fā)現(xiàn)并改進指南中存在的問題，需要廣大中藥材專家及育種工作者付出努力，共同推進測試指南的研制。

4 結(jié)論

本研究對22份不同產(chǎn)地的柴胡通過田間種植、性狀調(diào)查及數(shù)據(jù)測定最終篩選確定了41個測試性狀，包括24個必測的基本性狀和17個選測性狀，有假質(zhì)量性狀15個和數(shù)量性狀26個，同時也篩選到了13個標準品種，完善了柴胡DUS測試指南的研制。本指南的成功研制對于提高我國柴胡新品種保護，促進選種育種事業(yè)的發(fā)展有著重要意義。

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（責任編輯 閔芝智）