關(guān)鍵詞：人工濕地；氮同位素；微生物群落；氮代謝；功能基因《2022中國生態(tài)環(huán)境狀況公報》顯示湖泊（水庫）等重要水域的氮含量超標(biāo)。水體中氮含量過高，將不利于水生態(tài)健康發(fā)展，所以亟需對受污染水體進(jìn)行高效脫氮，提高水質(zhì)。包頭南海湖是我國西北部寒旱區(qū)的代表性湖泊之一，近年自然環(huán)境和人為活動常導(dǎo)致污染加重，對南海湖進(jìn)行全年水質(zhì)監(jiān)測，結(jié)果顯示TN和NH;-N濃度分別高達(dá)5.95mg·L-1和2.39mg·L-1，并且隨季節(jié)變化幅度較大，夏秋季濃度較高。

人工濕地（CWs）是天然濕地的工程模擬，具有良好的水體生態(tài)修復(fù)能力，是一種成本低、生態(tài)友好型水處理技術(shù)。目前，CWs在廢水的二級和三級處理中得到廣泛應(yīng)用，主要包括工業(yè)廢水、河湖水和農(nóng)業(yè)廢水。其中人工濕地系統(tǒng)的氮素去除性能受到多種因素的影響，如植物及基質(zhì)類型、微生物群落結(jié)構(gòu)等。植物在脫氮過程中起著至關(guān)重要的作用，同時對人工濕地系統(tǒng)的微生物群落結(jié)構(gòu)也有較大影響，是影響工藝運(yùn)行的重要因素之一。而基質(zhì)不僅是濕地植物生長的介質(zhì)，又是微生物附著的載體，其本身還可吸附污染物，成為保障人工濕地系統(tǒng)實現(xiàn)高效脫氮的關(guān)鍵。由于組成有差異，各類型人工濕地各組分對人工濕地的氮去除貢獻(xiàn)度尚不明晰。

近年來，新興的穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)取得了長足進(jìn)步，氮穩(wěn)定同位素已被用于生物氮循環(huán)的示蹤研究。基于此，本研究采集南海湖原水，通過對比不同基質(zhì)組成的有植物、無植物人工濕地系統(tǒng)，通過探究其對氮素的去除效果優(yōu)選人工濕地組成。并通過向最優(yōu)組中投加N同位素進(jìn)行氮示蹤，實現(xiàn)對人工濕地脫氮效果的準(zhǔn)確定量及各組分氮的去除貢獻(xiàn)率量化；利用高通量測序技術(shù)對微生物群落多樣性進(jìn)行探究，研究人工濕地中微生物對反硝化過程的影響，旨在闡明人工濕地對地表水體氮素削減機(jī)制，為人工濕地設(shè)計及功能的優(yōu)化提供理論支撐。

1材料與方法

1.1實驗裝置與運(yùn)行

由于垂直下行流人工濕地占地面積小，滲透速率快且在脫氮方面優(yōu)勢顯著，因此本實驗采用白色聚乙烯圓柱桶裝置構(gòu)建高為0.6m，內(nèi)徑15cm，體積為3.38L規(guī)模的垂直流人工濕地系統(tǒng)（圖1）。水樣取自包頭南海湖。在基質(zhì)選擇上，查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)和實際應(yīng)用案例，并考慮實用性和使用壽命等因素，選用了3種材料，分別為陶粒（粒徑2～4mm）、煤渣（粒徑2～5mm）和沸石（粒徑3～5mm），這些基質(zhì)具有儲量多，成本低，且吸附能力強(qiáng)，對環(huán)境無害等優(yōu)點，滿足實驗需求?；|(zhì)層上表面覆蓋防止基質(zhì)流失和便于植物定植的生態(tài)席墊（厚度為5mm）。為模擬流態(tài)水動力環(huán)境，在盛放試驗用水的塑料桶內(nèi)安裝同一規(guī)格的微型蠕動水泵（流量為10L·h-1）。

實驗所選用的基質(zhì)煤渣購置于網(wǎng)絡(luò)商家，沸石購置于河南同德環(huán)?？萍加邢薰?，陶粒購置于鞏義市水處理藥劑公司?？紤]到南海濕地中水生植物大部分是蘆葦，且蘆葦有較高的脫氮效率，因此選用蘆葦作為實驗植物。

1.1.1人工濕地系統(tǒng)氮素去除效果分析

每組人工濕地只填充兩種基質(zhì)，并各設(shè)一組無植物人工濕地，探究植物對脫氮的影響。因此共設(shè)6組實驗，分為有植物實驗組陶粒+煤渣（TMZ）、陶粒+沸石（TFZ）、沸石+煤渣（FMZ），和無植物對照組（陶粒+煤渣（TM）、陶粒+沸石（TF）、沸石+煤渣（FM）。各類基質(zhì)填充厚度為15cm，總厚度均為30cm，水力停留時間為24h。實驗期間，每5d在出水口取100mL水樣過0.45um濾膜后，立即進(jìn)行NH4-N、N02-N、N03-N和TN濃度的測定。

1.1.2N示蹤對人工濕地系統(tǒng)各組分的N03去除量化

選用氮去除效果最佳的人工濕地繼續(xù)開展各組分的N03去除量化研究。準(zhǔn)確稱量N同位素標(biāo)記的硝酸鉀447.06mg（N為64mg）加入蓄水箱中，實驗進(jìn)水體積為2.5L，攪拌均勻后加入實驗裝置內(nèi)。設(shè)置系統(tǒng)運(yùn)行時間為15d，分別在第5、10、15天對人工濕地植物、上層基質(zhì)、下層基質(zhì)和出水口進(jìn)行破壞性采樣。植物樣品放入冰箱0℃冷藏保存，水樣和基質(zhì)樣品放人冰箱-20℃冷凍保存，所有樣品于實驗第16天用冰袋泡沫箱保存送往科學(xué)指南針天津辦事處進(jìn)行氮同位素含量檢測。

1.2分析方法

TN和NH-N分別采用過硫酸鉀紫外分光光度法和納氏試劑分光光度法測定；N02-N和N03-N測定采用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法和紫外分光光度法。

1.3高通量測序

為探究反應(yīng)系統(tǒng)中微生物群落變化，分別采集系統(tǒng)中上、下兩層基質(zhì)及植物根部樣品。有植物人工濕地系統(tǒng)，基質(zhì)樣品煤渣、陶粒依次標(biāo)號為A、B；植物根部樣品分別為C。無植物人工濕地系統(tǒng)，基質(zhì)樣品煤渣、陶粒依次標(biāo)號為A、B。進(jìn)行2次重復(fù)采樣，共采集10個樣品，將離心、抽濾后的樣品放置于-80℃條件下干冰保存送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司Illumina MiSeq平臺進(jìn)行16SrDNA高通量測序。本實驗選擇通用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAG-GCAGCAG -3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGT-WTCTAAT-3'）對細(xì)菌16S rDNA基因中的V3-V4進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件參數(shù)為：95℃預(yù)變性溫度下保持3min；95℃變性溫度下保持30s，55℃退火溫度下保持30s，72℃延伸溫度下保持45s，進(jìn)行27次循環(huán)擴(kuò)增；72℃下終止延伸10min，10℃至反應(yīng)結(jié)束，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用美國AXYGEN公司的AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并對其進(jìn)行檢測定量分析，之后構(gòu)建MiSeq文庫，利用Illumina MiSeq測序平臺進(jìn)行高通量測序，將所得序列通過OTUs（運(yùn)算分類單位）以97%的相似度進(jìn)行聚類，本實驗的測序工作由測序公司完成。

1.4數(shù)據(jù)分析與計算

為量化人工濕地中各組分N去除，需對人工濕地各組分樣品中N含量進(jìn)行計算。

2結(jié)果與討論

2.1人工濕地系統(tǒng)對TN的去除

各人工濕地系統(tǒng)中TN的起始濃度均為4.59mg·L-1，6組人工濕地出水中TN濃度隨時間變化如圖2所示。6組人工濕地對TN的去除效果存在著顯著差別，含植物的人工濕地在兩個周期中TN的含量均有顯著降低；未種植植物的人工濕地中TN含量則表現(xiàn)為先升高后降低。經(jīng)過各組人工濕地系統(tǒng)的凈化后，TMZ、FMZ、TFZ、TM、FM、TF水體中的TN濃度分別下降至（2.70±0.12）、（3.71±0.11）、（3.09±0.12）、（3.47±0.14）、（3.07±0.13）、（3.27±0.11）mg·L-1。有植物組中陶粒+煤渣人工濕地系統(tǒng)對TN的去除效果最好，去除率為41.18%+2.61%，無植物組中是陶粒+沸石人工濕地系統(tǒng)對TN的去除效果最好，去除率為28.76%±2.40%。有植物的人工濕地系統(tǒng)比無植物的人工濕地系統(tǒng)具有更高的TN去除率，說明植物對TN的去除性能影響較大。一方面由于人工濕地系統(tǒng)上層基質(zhì)中存在植物的一些細(xì)小根系，植物根系本身可以吸附一些氮素污染，同時也可以附著微生物并提供氧氣，有利于微生物的生長，從而增強(qiáng)微生物對氮素的去除；另一方面植物可促進(jìn)基質(zhì)的氮吸附作用，植物的根系可以改善基質(zhì)的孔隙結(jié)構(gòu)，幫助基質(zhì)緩解堵塞，更利于基質(zhì)對南海原水中氮素的吸收。因此植物的加入提高了人工濕地整體的氮去除性能。

2.2人工濕地系統(tǒng)對NH4-N的去除

6組人工濕地出水中NH4-N濃度隨時間變化如圖3所示。各人工濕地均能高效凈化南海湖的含氮污染物。各人工濕地系統(tǒng)出水中NH4-N都有下降的趨勢，整個過程有植物組NH;-N的濃度低于無植物組。實驗29d后，TMZ、FMZ、TFZ、TM、FM、TF水體中的NH4-N濃度從初始的2.28mg·L-1分別下降到（1.13±0.06）、（1.20±0.07）、（1.27±0.06）、（1.58±0.05）、（1.32±0.08）、（1.38±0.07）mg·L-1。結(jié)果顯示，有植物組中陶粒+煤渣人工濕地系統(tǒng)對NH4-N的去除效果最好，去除率為50.44%+2.63%，而無植物組中沸石+煤渣人工濕地系統(tǒng)對NH4-N的去除效果最好，去除率為42.11%±3.51%；同時在陶粒+煤渣人工濕地系統(tǒng)中植物的作用在NH4-N的去除中體現(xiàn)最明顯。植物對NH4-N的去除作用主要表現(xiàn)在兩個方面，一方面，植物可以直接吸收NH4N。另一方面，植物也有分泌氧氣的作用，可以將空氣中的氧氣傳遞至根部區(qū)域，南海湖原水在人工濕地中，表層溶解氧充足，在好氧的環(huán)境中，硝化反應(yīng)條件適宜，將NH4-N轉(zhuǎn)化為N02-N和N03-N。此外，通過無植物組的人工濕地出水中NH4-N的29d變化結(jié)果可知，基質(zhì)對NH4-N的吸附作用也是一種重要的氮去除方式。因此在本研究中，NH4-N的去除主要依賴于基質(zhì)的吸附、植物的吸收與硝化反應(yīng)。

2.3人工濕地系統(tǒng)對N03-N的去除

6組人工濕地出水中N03-N濃度隨時間變化如圖4所示。各人工濕地系統(tǒng)中N03-N的起始濃度平均為2.59mg·L-1，經(jīng)各組人工濕地系統(tǒng)的凈化后，TMZ、FMZ、TFZ、TM、FM、TF水體中N03-N的濃度分別為（1.53±0.06）、（1.84±0.05）、（1.76±0.05）、（2.07±0.07）、（2.09+0.08）、（1.83±0.06）mg·L-1之間。并且運(yùn)行29d后，有植物組陶粒+煤渣人工濕地系統(tǒng)對N03-N的去除效果最好，去除率為40.93%+2.32%，而無植物組中陶粒+沸石人工濕地系統(tǒng)對NH4-N的去除效果最好，去除率為29.34%±2.33%。3種有植物的人工濕地對N03-N的去除率均高于無植物的，即植物在人工濕地系統(tǒng)中對N03-N的去除起到重要作用。植物在N03-N去除過程中主要表現(xiàn)為植物的直接吸收。含植物的人工濕地，特別是具有發(fā)達(dá)根系的植物，可以吸收水中更多的N03-N以供其生長發(fā)育。此外，人工濕地植物根部可以富集微生物，具有根際效應(yīng)，能夠產(chǎn)生氧氣和分泌物，并被微生物用于生長繁殖。植物可以通過影響微生物的活性而對人工濕地中氮污染物的去除效果產(chǎn)生影響。在有植物的人工濕地系統(tǒng)中，特別是在植物根系中，有較多的微生物和較強(qiáng)的生物活性；而不含栽種植物的人工濕地系統(tǒng)因為植物的缺失，一方面，基質(zhì)缺乏反硝化所需的微生物、酶等；另一方面，基質(zhì)中缺乏有氧與無氧的過渡環(huán)境，導(dǎo)致底物中N03-N的持續(xù)積累，致使底物中N03-N的濃度非但沒有下降，反而升高。

2.4人工濕地系統(tǒng)對N02-N的去除

6組人工濕地出水中N02-N濃度隨時間變化如圖5所示。各人工濕地系統(tǒng)對N02-N的去除均表現(xiàn)出了較好的效果。在實驗開始時，人工濕地系統(tǒng)進(jìn)水的N02-N初始濃度為0.15～0.16mg·L-1，人工濕地系統(tǒng)運(yùn)行29d后，TMZ、FMZ、TFZ、TM、FM、TF水體中N02-N的濃度分別降低到（0.039±0.003）、（0.053±0.004）、（0.041±0.003）、（0.061±0.004）、（0.064±0.005）、（0.058±0.003）mg·L-1，去除率均達(dá)到58%以上，最高可達(dá)76.31%。從圖5中可以看出，相較于其他氮素指標(biāo)的去除，有植物的陶粒+煤渣組并未在N02-N的去除方面與無植物組拉開差距，這可能是因為N02-N在人工濕地環(huán)境中的轉(zhuǎn)化和去除過程相對復(fù)雜。N02-N屬于一種相對不穩(wěn)定的化合物，容易轉(zhuǎn)化為其他更穩(wěn)定的形態(tài)，如N03-N或NH4N。這些轉(zhuǎn)化過程可能受到人工濕地環(huán)境中多方面因素的影響，包括pH值、溫度、基質(zhì)孔隙大小、微生物活性等。因此，植物的存在可能對這些轉(zhuǎn)化過程產(chǎn)生一定的影響，但這種影響比較微弱。此外，在0～9d的時間內(nèi)，與陶粒+煤渣組相比，陶粒+沸石、沸石+煤渣基質(zhì)的有植物組N02-N的去除效果對比無植物組有顯著差異。說明含有沸石的基質(zhì)組合更能促進(jìn)人工濕地N02-N的去除，由于沸石的表面結(jié)構(gòu)較粗糙且多孔，在水中有利于離子的吸附與交換且不改變晶體結(jié)構(gòu)。同時具有更大比表面積，為微生物提供了更多的依附場所和活動空間。但是隨著吸附的污染物越多，基質(zhì)出現(xiàn)明顯堵塞，去除率下降，導(dǎo)致出水N02-N濃度逐漸趨于穩(wěn)定。

2.5N同位素在人工濕地中的絕對豐度質(zhì)量

為進(jìn)一步研究人工濕地系統(tǒng)中各組分對N03-N的去除貢獻(xiàn)度，采用陶粒+煤渣組人工濕地進(jìn)行氮同位素標(biāo)記定量實驗，選擇煤渣作為上層基質(zhì)，陶粒作為下層基質(zhì)。基質(zhì)和植物中氮含量、原子百分比（AT%）和同位素N的絕對豐度分別列于表1。其中，氮含量指的是基質(zhì)和植物中氮元素占整體物質(zhì)含量的百分比。由表1可知，植物根際的氮含量為0.57%，上層基質(zhì)和下層基質(zhì)氮含量分別為0.18%和0.13%，植物根際氮含量遠(yuǎn)高于基質(zhì)。原因是基質(zhì)本身只通過吸附作用去除氮，而植物能利用基質(zhì)中的氮元素合成自身的物質(zhì)；此外，基質(zhì)本體含量高也致使其氮含量占比低于植物。

i5N同位素的絕對豐度是指一種物質(zhì)中N同位素的凈含量，它是根據(jù)含氮量和原子百分比進(jìn)行計算的。根據(jù)AT%數(shù)值及N03-N濃度，計算出實驗原水N的絕對豐度，見圖6。實驗開始時，原水中的N的絕對豐度是0.396mg·L-1，經(jīng)過5d的處理后，N的絕對豐度降至0.230mg·L-1；15d后降到0.134mg·L-1，此時人工濕地對N的去除率達(dá)到了66.16%．也再次反映出該人工濕地良好的氮去除效果。植物和基質(zhì)中N的絕對豐度如表1所示：在上層基質(zhì)中，單位質(zhì)量的基質(zhì)中N濃度最高，其絕對豐度可達(dá)8.64x10-3mg·g-1，單位質(zhì)量基質(zhì)的吸附量也最大；下層基質(zhì)中，N的含量最小，絕對豐度為6.31x10-3mg·g-1，它的吸附能力是最小的。植物中N的絕對豐度達(dá)到55.29mg·g-1，明顯高于基質(zhì)，說明單位質(zhì)量植物對氮的吸收量較大。

2.6人工濕地各組分N03-N去除的貢獻(xiàn)率

人工濕地各組分N去除總量變化如表2所示，在15d后，有植物組植物、上層基質(zhì)、下次基質(zhì)以及微生物的N去除總量分別為13.49、12.51、11.04、11.59mg;而無植物各組分的N去除總量分別為11.76、9.01、15.64mg。從整個過程來看，植物的N去除總量在0～5、10～15d變化較小，而在5～10d變化較大，即對N的吸收速率呈現(xiàn)出先緩后快再緩的趨勢。由于初期是植物對新環(huán)境的適應(yīng)階段，故N的吸收在初期并不顯著，適應(yīng)后則會加速對N03-N的吸收。在初期，上層基質(zhì)對N03-N的吸收發(fā)揮更重要作用。試驗中后期，由于土壤養(yǎng)分、環(huán)境等因素的影響，植物對N的積累速度減慢，但此時的微生物已經(jīng)適應(yīng)環(huán)境并逐漸發(fā)揮作用，加快對N的吸收。此外，對比有植物和無植物組發(fā)現(xiàn)，有植物組微生物中N去除總量低于無植物組，這是由于無植物組對N03-N有去除作用的只有基質(zhì)與微生物，而有植物組中植物也能吸收氮，從而為人工濕地系統(tǒng)氮素去除貢獻(xiàn)一定比例，使得微生物對N03-N去除的量減少；同時植物根系有泌氧功能，一定程度制約微生物對氮的反硝化。因此無植物組微生物的脫氮效果好于有植物組。

同時以各組分N同位素的去除總量為依據(jù)，可以得出有植物人工濕地植物、基質(zhì)和微生物組分在15d后對N03-N去除的貢獻(xiàn)率。植物的吸收和基質(zhì)的吸附對人工濕地系統(tǒng)N03-N去除的貢獻(xiàn)率分別為27.74%和48.43%，微生物對N03-N的去除貢獻(xiàn)率占23.83%。但從表2可以看出，實驗的中后期植物與基質(zhì)對N的吸收變得緩慢，而微生物則加快了對N03-N的去除，說明在人工濕地穩(wěn)定運(yùn)行后微生物將會對人工濕地N03-N的去除起主導(dǎo)作用。

2.7植物對微生物多樣性的影響

5組樣品的微生物多樣性指數(shù)如表3所示，通過物種多樣性指數(shù)（Simpson）與豐富度指數(shù)（Chao、Ace）變化情況可知，5組樣品中的多樣性及豐富度均有較大的差異，有植物組的豐富度較無植物組有顯著提升。植物的加入使人工濕地中的微生物數(shù)量得到了增加，從而提高了人工濕地的氮凈化性能。植物能向基質(zhì)中輸送氧氣，維持底物中微生物的活力和多樣性；植物的生長和代謝，凋落物和植物根系分泌物等也可以為微生物的繁殖和發(fā)育提供能量，豐富的微生物群落物種多樣性強(qiáng)化了人工濕地系統(tǒng)去除氮素的能力。

2.8植物對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

各組人工濕地系統(tǒng)中微生物門水平群落結(jié)構(gòu)組成如圖7（a）所示。各組人工濕地系統(tǒng)中基質(zhì)及植物根系上的細(xì)菌共鑒定出53個菌門。其中相對豐度前10為優(yōu)勢菌門，主要包括Proteobacteria（變形菌門）、Actinobacteriota（放線菌門）、Bacteroidota（擬桿菌門）、Firmicutes（厚壁菌門）、Patescibacteria（髕骨菌門）、Chloroflexi（綠彎菌門）、Acidobacteriota（酸桿菌門）和Cyanobacteria（藍(lán)藻門）。Proteobacteria的豐度最高，相關(guān)研究表明，其大部分菌門均參與氮循環(huán)途徑，在生物脫氮過程中具有至關(guān)重要的作用。對比兩組人工濕地系統(tǒng)，植物中的Bacteroidota數(shù)量明顯高于兩組基質(zhì)，Bacteroidota為異養(yǎng)細(xì)菌，能夠分解水中的碳水化合物，利用水中的N03-N，參與反硝化作用。Firmicutes是具有脫氮功能的互養(yǎng)細(xì)菌，對比5組樣品，有植物組中Firmicutes相對豐度占比均較高，故有植物人工濕地系統(tǒng)脫氮效果更佳。

各組人工濕地系統(tǒng)中微生物屬水平群落結(jié)構(gòu)組成如圖7（b）所示，各系統(tǒng)的群落組成存在一定的差異，主要表現(xiàn)在有植物的人工濕地系統(tǒng)優(yōu)勢菌屬主要分布在P.seudomona.s（ 49.08%～62.69%）、P.seudarthro-bacter（4.11%～4.93%）和Malilcia（3.25%～10.78%）菌屬；無植物系統(tǒng)主要為Limnobacter （40.32%～51.58%）、Nevskia （9.23%～11.57%）和Rhodobacter（3.04%～5.45%）菌屬。此外，不同于有植物系統(tǒng)，無植物系統(tǒng)兩基質(zhì)表面的微生物群落組成表現(xiàn)出明顯不同，陶粒中Saccharimonadaceae、Rhodobacter、Azoar-cus等菌屬的比例顯著提高，suiDritaiea、Rhodoferax和Sphingomonas等菌屬顯著降低。說明植物的加入使兩個基質(zhì)的微生物系統(tǒng)逐漸均質(zhì)化，使出水水質(zhì)更穩(wěn)定。植物根系和基質(zhì)附著的微生物也有明顯的不同，植物根系的優(yōu)勢菌屬豐度更大，尤其是Flavobacteri-um菌屬占比明顯高于其他兩基質(zhì)。Flavobacterium是常見的植物促生菌之一，可以溶解磷酸鹽，制造生長激素，推測植物的加入提高了此類菌屬的占比，反過來又促進(jìn)植物生長及其對氮素的循環(huán)作用，從而通過影響基質(zhì)中氮素的分布間接影響基質(zhì)所附著微生物的群落結(jié)構(gòu)。

2.9微生物氮代謝功能基因分析

通過對植物根系C、有植物組煤渣A、陶粒B和無植物組煤渣A、陶粒B’基質(zhì)樣品的微生物氮代謝基因功能的鑒定與分析，篩選出具有脫氮功能的優(yōu)勢基因。目前，國內(nèi)外研究已發(fā)現(xiàn)的氮代謝功能基因有：亞硝酸還原酶（NIR）基因nirS/nirK；硝酸還原酶（NR）基因narG/napA；一氧化氮（NO）還原酶基因norB；一氧化二氮（N20）還原酶基因nosZ；單加氧酶（AMO）基因aomA；羥胺氧化酶（HAO）基因hao；亞硝酸鹽氧化酶（NXR）基因nor等。在各系統(tǒng)中鑒定出與氮代謝相關(guān)的功能基因主要有參與反硝化過程的narG/narZ、narH/narY．nirK、nirS和參與固氮過程的nasA、nirA、nirB，如圖8所示。不論是在基質(zhì)還是植物中，nasA與nirB基因的豐度都遠(yuǎn)高于其他基因，這表明固氮過程是本實驗人工濕地微生物氮代謝的主要途徑。此外，有植物人工濕地系統(tǒng)不同基質(zhì)表面微生物nirS基因豐度明顯高于無植物系統(tǒng)，說明植物能有效促進(jìn)人工濕地系統(tǒng)中微生物的氮代謝，主要體現(xiàn)在反硝化過程中。而另一個反硝化過程的nirK基因，其在植物根系中的基因豐度明顯高于基質(zhì)中的。植物可以通過根系分泌多種初級代謝物，例如糖和有機(jī)酸等，并釋放到水體中，或附著在基質(zhì)表面，被微生物吸收利用，這改變了根際區(qū)域微生物的結(jié)構(gòu)與多樣性，從而促進(jìn)人工濕地的反硝化速率以及反硝化基因豐度，對氮素去除的反硝化過程中微生物的作用產(chǎn)生了不容忽視的影響。但也可以看出，無植物人工濕地基質(zhì)中nirB基因豐度大于有植物系統(tǒng)，說明在人工濕地固氮過程中，植物反而產(chǎn)生了負(fù)反饋。這是由于植物可以通過光合作用產(chǎn)生氧氣，而參與固氮過程的微生物周圍氧氣濃度越高，對固氮作用的抑制程度就越大，即固氮速率與氧氣濃度成反比關(guān)系，同時也會影響基質(zhì)中固氮基因的豐度。

為了深入研究植物對人工濕地系統(tǒng)氮去除機(jī)理的影響，通過高通量技術(shù)獲得不同處理組的非冗余基因集，將全部基因片段與KEGG（Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫內(nèi)氮代謝相關(guān)的酶基因信息進(jìn)行比對，獲得氮循環(huán)過程中相關(guān)功能酶的豐度。在本實驗中檢測出的氮代謝相關(guān)功能酶的具體功能和名稱如表4所示。有植物和無植物人工濕地豐度前三的功能酶相同，為硝酸還原酶（EC：1.7.99.4）、亞硝酸鹽還原酶（EC：1.7.1.15）、谷氨酸脫氫酶（EC：1.4.1.2）。相比于無植物系統(tǒng)，有植物人工濕地中顯著上調(diào)了NADP依賴型（谷氨酸脫氫酶，EC：1.4.1.4）、谷氨酸合酶（鐵氧還蛋白，EC：1.4.7.1）、固氮酶（EC：1.18.6.1）、一氧化氮還原酶（細(xì)胞色素c，EC：1.7.2.5）、氰化酶（EC：4.2.1.104）、羥胺還原酶（EC：1.7.99.1）、亞硝酸鹽還原酶（EC：1.7.2.1）、氨基甲酸激酶（EC：2.7.2.2）、一氧化二氮還原酶（EC：1.7.2.4）、鐵氧還蛋白一硝酸還原酶（EC：1.7.7.2）、亞硝酸鹽還原酶（細(xì)胞色素，氨形成，EC：1.7.2.2）豐度，表明植物的加入有促進(jìn)固氮、硝化、反硝化以及異化硝酸鹽過程的作用。同時觀察到植物根系微生物中的氮代謝相關(guān)功能酶豐度與兩基質(zhì)層幾乎一致，說明功能酶在整個有植物的濕地中分布均勻，整體氮代謝作用穩(wěn)定。

3結(jié)論

（1）凈化效果最佳的組合為陶粒+煤渣，相比無植物系統(tǒng)，有植物系統(tǒng)的TN、NH;-N、N03-N和N02-N去除率分別為（41.18±2.61）%、（50.44±2.63）%、（40.93±2.32）%、（74.34±1.97）%，有植物人工濕地具有較好的氮去除效果及反硝化作用。3組有植物人工濕地系統(tǒng)對南海湖水體氮污染物的總體凈化效果排序為陶粒+煤渣gt;陶粒+沸石gt;沸石+煤渣。無植物系統(tǒng)對南海湖水體氮污染物的凈化效果依次為陶粒+沸石gt;陶粒+煤渣gt;沸石+煤渣。

（2）基質(zhì)中N絕對豐度值低于植物中的，單位質(zhì)量植物吸收氮素能力更強(qiáng)。N同位素的示蹤量化了植物、基質(zhì)和微生物對人工濕地系統(tǒng)N03-N去除的貢獻(xiàn)率分別為27.74%、48.43%和23.83%。在人工濕地建設(shè)初期，N03-N的去除主要是由上層基質(zhì)完成；穩(wěn)定運(yùn)行后，N03-N的去除主要以微生物為主。

（3）在有植物人工濕地系統(tǒng)中，參與氮循環(huán)的優(yōu)勢菌門相對豐度較高，促進(jìn)系統(tǒng)的脫氮性能。此外，有植物人工濕地系統(tǒng)基質(zhì)中的nirS基因、植物根系的nirK基因豐度顯著增加，植物有效促進(jìn)了人工濕地系統(tǒng)中微生物的反硝化能力，且植物根系微生物中的氮代謝相關(guān)功能酶豐度與兩基質(zhì)層幾乎一致，即有植物的濕地中整體氮代謝效果相對穩(wěn)定。