摘要：分化的神經(jīng)細(xì)胞需要在細(xì)胞靜息狀態(tài)下維護(hù)軸突的生長和功能。前期研究顯示，表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）和L-茶氨酸（L-theanine）能夠維持神經(jīng)細(xì)胞的靜息狀態(tài)并具有神經(jīng)修復(fù)作用，但具體的作用機(jī)制還不清楚。在Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型中，EGCG和L-theanine聯(lián)合處理改善細(xì)胞代謝和修復(fù)能力，提高了細(xì)胞活力，表現(xiàn)顯著的協(xié)同作用。轉(zhuǎn)錄組和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果表明，EGCG主要通過抑制氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)脂肪酸代謝和淀粉樣蛋白毒性應(yīng)激來維持細(xì)胞靜息態(tài)；L-theanine則通過促進(jìn)軸突生長、調(diào)節(jié)神經(jīng)代謝和突觸功能發(fā)揮作用。兩者聯(lián)合應(yīng)用對細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)更為廣泛和溫和，減少對細(xì)胞的刺激作用。本研究為茶葉的神經(jīng)保護(hù)作用及其在老齡化社會中的飲用價值提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：表沒食子兒茶素沒食子酸酯；L-茶氨酸；神經(jīng)保護(hù)；網(wǎng)絡(luò)藥理；轉(zhuǎn)錄組；聯(lián)合分析

中圖分類號：S571.1；R972+.6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1000-369X（2024）05-779-14

A Study on the Neuroprotective Effects of Combined EGCG and L-Theanine from Tea Leaves

DING Shuqia1，3， XIE Xinya1，3， LIU Zhusheng2*， LIAO Xianjun2， LIU Zhonghua1，3， CAI Shuxian1，3*

1. National Research Center of Engineering and Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients， Changsha 410128， China; 2. Guangxi Research Institute of Tea Science， Guilin 541004， China; 3. Key Lab of Education Ministry of Hunan Agricultural University for Tea Science， Changsha 410128， China

Abstracts： Differentiated neurons need to maintain axonal growth and function in a quiescent state. Previous studies have shown that epigallocatechin gallate （EGCG） and L-theanine can maintain the quiescent state of neurons and have neurorestorative effects， although the specific mechanisms are still unclear. In the Aβ25-35-induced PC12 cell damage model， combined treatment with EGCG and L-theanine improved cell metabolism and repair capacity， enhanced cell viability and showed a significant synergistic effect. Transcriptomic and network pharmacological analyses indicate that EGCG mainly maintains the quiescent state of cells by inhibiting oxidative stress， regulating fatty acid metabolism， and mitigating amyloid protein toxicity stress. L-theanine promotes axonal growth and regulates neuronal metabolism and synaptic function. The combined application of both compounds results in a broader and milder regulation of cellular networks， reducing cellular stress. This study provided theoretical support for the neuroprotective effects of tea and its value in an aging society.

Keywords： EGCG， L-theanine， neuroprotection， network pharmacology， transcriptome， joint analysis

淀粉樣蛋白病（Amyloidosis）是由內(nèi)源性蛋白的異常聚集所形成的淀粉樣蛋白沉積于組織中，引發(fā)細(xì)胞毒性，最終導(dǎo)致組織損傷和病變[1-2]。目前有超過36種淀粉樣蛋白可沉積于心臟、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)、腦組織、眼球、皮膚、血管等組織，且具有特異性[3]。研究發(fā)現(xiàn)，除了致病蛋白Aβ42、IAPP、α-突觸核蛋白等外，所有的蛋白質(zhì)、核酸和脂肪等生物大分子均有集聚化傾向，可引發(fā)和促進(jìn)大部分與衰老相關(guān)的疾病，如動脈粥樣硬化、腫瘤、2型糖尿病和阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）等。致病蛋白質(zhì)聚集體的毒性可能源自其固有的錯誤折疊性質(zhì)和結(jié)構(gòu)異質(zhì)性。這些特性導(dǎo)致大量異常相互作用，引起細(xì)胞損傷與死亡[4-5]。Aβ在高濃度時形成沉淀斑塊，無分解代謝途徑，因此抑制Aβ結(jié)構(gòu)的形成對于預(yù)防老年性疾病至關(guān)重要。

AD及其他神經(jīng)退行性疾病（Neurodegene-

rative diseases，NDs）的主要病理機(jī)制包括細(xì)胞外Aβ斑塊的形成、異常磷酸化的tau蛋白在細(xì)胞內(nèi)積累、神經(jīng)元突觸功能障礙以及神經(jīng)元損失[6-8]?，F(xiàn)有療法主要緩解癥狀，無法阻止疾病進(jìn)程，并可能有副作用[9]。因此，開發(fā)能作用于多個生物靶點(diǎn)的天然產(chǎn)品具有重要治療潛力。

有研究認(rèn)為，日常飲用適量的綠茶可顯著降低認(rèn)知障礙的風(fēng)險[10]。綠茶中的兒茶素，尤其是EGCG，具有多重健康益處，可通過抗炎、抗氧化等途徑對ND有防治作用[11]。EGCG能阻斷淀粉樣蛋白的聚集并分解原纖維，改善中樞記憶缺陷[12-14]?？诜﨓GCG后，其代謝物EGC和GA促進(jìn)神經(jīng)軸突生長，減少腦部氧化損傷[15-16]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究已分析了EGCG及其代謝物對疾病靶點(diǎn)的影響[17-18]。L-茶氨酸（L-theanine）作為安全添加劑，在腦部、胃部和肝臟的炎癥損傷中顯示出其抗凋亡和保護(hù)作用[19-20]?？诜﨤-theanine后大鼠肝臟中的乙胺和谷氨酸水平顯著提高[21]，這種變化與其直接代謝和谷氨酰胺酶的作用有關(guān)[22]。L-

theanine通過抑制氧化損傷和tau蛋白過度磷酸化減輕神經(jīng)毒性，降低鎘誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡[23]。

本研究采用細(xì)胞試驗(yàn)、轉(zhuǎn)錄組分析和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，進(jìn)一步探索了EGCG和L-theanine及其主要代謝物在神經(jīng)保護(hù)方面的協(xié)同效應(yīng)和作用機(jī)制，通過轉(zhuǎn)錄組和網(wǎng)絡(luò)藥理的交集靶點(diǎn)分析，為揭示茶葉的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocat-

echin Gallate，EGCG）和L-theanine（純度均為99%以上）均購自Sigma-Aldrich公司（美國密蘇里州圣路易斯市）。大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系（PC12細(xì)胞）由北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫（北京）提供。Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶均由美國Biological Industries提供。β淀粉樣蛋白25-35（Aβ25-35）購自美國Sigma公司。氟硼二吡咯類熒光染料（BODIPY）購自美國Invitrogen公司。

1.2 不同Aβ25-35蛋白樣品制備

將EGCG、L-theanine及其組合與Aβ25-35按等濃度混合，并在37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育。孵育后，對混合液進(jìn)行稀釋并加入至細(xì)胞中，以探索最佳協(xié)同濃度。在后續(xù)結(jié)果描述中，這些處理組分別標(biāo)記為Aβ25-35、Aβ25-35/EGCG、Aβ25-35/L-theanine及Aβ25-35/EGCG＋L-theanine。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞在含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于含5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。

1.4 細(xì)胞活力檢測

將PC12細(xì)胞接種于96孔板中，密度為每孔1×104個，培養(yǎng)24 h。然后用不同的Aβ25-35蛋白樣品（Aβ25-35、Aβ25-35/EGCG、Aβ25-35/L-

theanine和Aβ25-35/EGCG＋L-theanine）處理細(xì)胞24 h，對照組加入等量的無菌水。去除上清液后，加入含0.5 g·mL-1 MTT的培養(yǎng)基，孵育4 h。隨后除去上清液，每孔加入150 μL DMSO。在多功能酶標(biāo)儀上，以570 nm波長測量吸光度。細(xì)胞活力以處理組與對照組吸光度的平均百分比表示，對照組活力設(shè)定為100%。

1.5 熒光染色分析

將細(xì)胞以每孔5×104個的密度接種到含有蓋玻片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并按1.3章節(jié)所述的方法培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，用PBS在避光條件下洗滌細(xì)胞3次。然后，將蓋玻片倒置于含有DAPI的載玻片上封片，使用Zeiss公司的Axio Scope.A1熒光顯微鏡進(jìn)行觀察和拍攝。

1.6 RNA測序和基因表達(dá)分析

試驗(yàn)結(jié)束后，立即將收集的細(xì)胞樣品在液氮中預(yù)凍2 min，隨后在干冰上快速冷凍并送至深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）。對每個基因的表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，使用每千堿基轉(zhuǎn)錄物的片段數(shù)（Fragments per kilobase of transcript per million mapped reads，F(xiàn)PKM）來計算基因表達(dá)水平。為了在轉(zhuǎn)錄組水平上全面探索作用機(jī)制，以|Fold Change|≥1.2和Q值≤0.05為條件，篩選差異表達(dá)基因（Differentially expressed genes，DEGs）進(jìn)行GO生物過程（Biological process，BP）富集分析。

1.7 EGCG和L-theanine及其主要代謝物藥理學(xué)信息收集

采用Lipinski的五法則來評估所設(shè)計化合物的體內(nèi)吸收潛力[24]，包括分子量（MW）＜500，氫鍵供體數(shù)量（Hdon）≤5，氫鍵受體數(shù)量（Hacc）≤10，脂水分配系數(shù)（LogP）≤5，以及可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)（Rbon）≤10。使用SwissADME網(wǎng)絡(luò)工具（www.swissadme.ch）評估化合物的藥物代謝動力學(xué)（Absorption，distribution，metabolism，and excretion，ADME）[25]，同時測定拓?fù)錁O性表面積（Topological polar surface area，TPSA）、脂水分布系數(shù)（LogS）和皮膚滲透率（LogKp）。

1.8 EGCG和L-theanine及其主要代謝物相關(guān)靶標(biāo)的收集

將主要代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)導(dǎo)入SwissTar-

getPrediction（www.swisstargetprediction.ch）和TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫，以獲取各自的作用靶點(diǎn)。

1.9 篩選神經(jīng)退行性疾?。∟Ds）靶標(biāo)

使用GeneCards數(shù)據(jù)庫（www.genecards.

org）[26]，以“神經(jīng)退行性疾病”作為關(guān)鍵詞，篩選與NDs相關(guān)的疾病靶標(biāo)。使用Venny 2.1.0軟件評估EGCG和L-theanine及其主要代謝物相關(guān)靶點(diǎn)與NDs相關(guān)靶點(diǎn)的交集，從而定義抗NDs相關(guān)靶點(diǎn)。在文中，EGCG組、L-theanine組和EGCG＋L-theanine組的抗NDs相關(guān)靶點(diǎn)分別標(biāo)記為EGCG/ND、L-theanine/ND和EGCG＋L-theanine/ND。

1.10 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)與聚類分析

使用STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org）構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，選定的生物體為智人（Homo sapiens）。PPI網(wǎng)絡(luò)由代表目標(biāo)蛋白的節(jié)點(diǎn)和表示蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的邊組成。使用Cytoscape軟件（v.3.8.2）確定核心目標(biāo)，其插件MCODE用于分析網(wǎng)絡(luò)中的聚類模塊[27]。

1.11 轉(zhuǎn)錄組學(xué)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合分析

使用Draw Venn Diagram在線程序，由網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出的EGCG和L-theanine協(xié)同治療神經(jīng)退行性疾病的潛在靶點(diǎn)，以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)中協(xié)同組與模型組相比較的差異表達(dá)mRNA基因取交集，此分析幫助識別了兩種方法共同支持的關(guān)鍵靶基因，其中弦圖和熱圖分析由微生信（www.bioinformatics.com.cn）在線平臺完成。

1.12 數(shù)據(jù)處理方法

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，取自3次重復(fù)的獨(dú)立試驗(yàn)。不同組間的統(tǒng)計比較采用單因素方差分析（ANOVA）和多重對比后檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理組的PC12細(xì)胞比較分析

2.1.1 EGCG與Aβ25-35/EGCG處理的PC12細(xì)胞比較分析

不同濃度EGCG分別孵育PC12細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示在50 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，EGCG對細(xì)胞活力影響不顯著；而在100 μmol·L-1濃度時，EGCG顯著降低細(xì)胞活力（圖1A）。相比之下，Aβ25-35/EGCG孵育PC12細(xì)胞24 h后，與Control組相比，50 μmol·L-1 Aβ25-35細(xì)胞活力下降約50%。隨著EGCG濃度增加，Aβ25-35/EGCG處理組的細(xì)胞活力顯著增加，尤其在EGCG濃度為100 μmol·L-1時，細(xì)胞活力超過Control組，表明Aβ25-35/EGCG處理組在EGCG高濃度時具有促進(jìn)細(xì)胞生長的作用（圖1A）。

細(xì)胞凋亡熒光染色結(jié)果表明，EGCG單獨(dú)孵育PC12細(xì)胞24 h，與Control組相比，100 μmol·L-1 EGCG處理的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)不完整，caspase-3染色強(qiáng)烈，表現(xiàn)出促凋亡活性（圖1B）。50 μmol·L-1 Aβ25-35處理組的DAPI染色顯示細(xì)胞異染色質(zhì)集聚，caspase-3染色增強(qiáng)，細(xì)胞核集聚，早期凋亡增加；而50 μmol·L-1 Aβ25-35/100 μmol·L-1 EGCG處理組細(xì)胞核增大，caspase-3幾乎沒有陽性染色，細(xì)胞未表現(xiàn)凋亡性，這與100 μmol·L-1 EGCG單獨(dú)處理的促凋亡作用相反（圖1B）。

2.1.2 L-theanine與Aβ25-35/L-theanine處理的PC12細(xì)胞比較分析

MTT試驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的L-theanine孵育PC12細(xì)胞，L-theanine濃度低于100 μmol·L-1時，細(xì)胞活力隨其濃度增加而提高（圖1C）。PC12細(xì)胞用50 μmol·L-1 Aβ25-35孵育處理7 d，再分別采用不同濃度的L-theanine處理后發(fā)現(xiàn)，與未加L-theanine相比，加L-theanine濃度低于100 μmol·L-1時對Aβ25-35沒有表現(xiàn)顯著的保護(hù)作用（圖1C）。

2.1.3 EGCG與L-theanine的協(xié)同作用分析

通過MTT檢測可得，模型組顯著抑制細(xì)胞活力（P＜0.05），在添加了EGCG和L-theanine之后，細(xì)胞的活力得到了顯著提高，其中L-theanine的效果更為顯著（圖1D）。當(dāng)同時添加這兩種藥物時，細(xì)胞活力達(dá)到了最高水平。因此，我們推測EGCG和L-theanine可能具有協(xié)同作用，在同時使用時可以顯著提高細(xì)胞活力。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果與差異基因分析

基于圖1D的細(xì)胞協(xié)同試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序分析。從15個轉(zhuǎn)錄組cDNA文庫中獲得了69 987萬個原始讀數(shù)，過濾后有效讀數(shù)占比超過91.23%。將這些讀數(shù)與小鼠基因組進(jìn)行比對，總比對率超過81.7%，唯一比對率超過76.65%，表明測序質(zhì)量高，適用于后續(xù)分析。韋恩圖顯示，所有處理組中共有15 760個共表達(dá)基因（圖2A）。根據(jù)|Fold Change|≥1.2和Q值≤0.05篩選差異表達(dá)基因（DEGs），與對照組相比，Aβ25-35建模組鑒定出1 344個DEGs（上調(diào)588個，下調(diào)756個）；Aβ25-35/EGCG組鑒定出1 320個DEGs（上調(diào)718個，下調(diào)602個）；Aβ25-35/L-theanine組鑒定出221個DEGs（上調(diào)50個，下調(diào)171個）；Aβ25-35/EGCG＋L-theanine組鑒定出1 187個DEGs（上調(diào)691個，下調(diào)496個）（圖2B）。結(jié)果表明，與Aβ25-35相比，Aβ25-35/EGCG對細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響最為顯著，約是Aβ25-35/L-theanine的6倍。

圖2D至2G展示了不同組別差異基因的KEGG富集分析結(jié)果，揭示了Aβ25-35處理、EGCG處理、L-theanine處理及其聯(lián)合處理對細(xì)胞的多方面影響。Aβ25-35處理顯著干擾了血管發(fā)育、染色質(zhì)重塑、細(xì)胞對生長因子反應(yīng)和細(xì)胞遷移等多個關(guān)鍵生物過程，表明Aβ25-35通過影響細(xì)胞信號傳導(dǎo)、代謝調(diào)節(jié)、發(fā)育和免疫應(yīng)答，可能導(dǎo)致神經(jīng)退行性改變和組織損傷（圖2D）。EGCG處理顯著影響了酶聯(lián)受體蛋白信號通路、磷酸代謝和膽固醇生物合成等關(guān)鍵通路，通過促進(jìn)細(xì)胞增殖和修復(fù)、調(diào)節(jié)代謝平衡，

提高組織修復(fù)能力和抗逆性（圖2E）。L-theanine處理調(diào)控了染色質(zhì)重塑、DNA代謝和免疫過程，顯著影響了基因表達(dá)、細(xì)胞周期和低氧反應(yīng)，表明其在基因調(diào)控和免疫增強(qiáng)方面具有重要作用（圖2F）。EGCG和L-theanine聯(lián)合處理擴(kuò)展了單獨(dú)處理的作用范圍，顯著調(diào)控了血管發(fā)育、膽固醇和次級醇代謝、氧化還原過程等通路，展現(xiàn)出顯著的協(xié)同效應(yīng)，可能通過多機(jī)制、多途徑的聯(lián)合作用，增強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)，改善細(xì)胞代謝和修復(fù)能力，顯示出在神經(jīng)退行性疾病防治中的潛在應(yīng)用價值（圖2G）。

KEGG分析結(jié)果表明，P值越低，通路越顯著，富集因子反映了通路中差異基因的數(shù)量。與EGCG相比，L-theanine對細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響相對較弱，但聯(lián)合處理展示了更強(qiáng)的調(diào)控能力，為神經(jīng)保護(hù)機(jī)制及臨床應(yīng)用研究提供了重要依據(jù)。

2.3 EGCG和L-theanine及其主要代謝物的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.3.1 EGCG和L-theanine及其主要代謝物ADME性質(zhì)

EGCG和L-theanine及其主要代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)從PubChem數(shù)據(jù)庫中獲得（圖3）。隨后，使用在線工具SwissADME對這些代謝產(chǎn)物的吸收、分布、代謝和排泄（ADME）性質(zhì)進(jìn)行了深入評估（表1）。分析結(jié)果顯示，拓?fù)錁O地表面積（Topological polar surface area，TPSA）和膜滲透性具有良好的相關(guān)性。一般來說，較大的TPSA值可能會導(dǎo)致較低的膜滲

透性。脂溶性是藥物化學(xué)中小分子的重要參數(shù)，脂水分配系數(shù)（logP）大于零時化合物親脂性比較強(qiáng)，反之則表明親水性較強(qiáng)。溶解度（LogS）則決定了EGCG等物質(zhì)在腸道中的吸收與口服利用度。表1的數(shù)據(jù)表明，EGCG和L-theanine的代謝物在跨細(xì)胞膜滲透性方面表現(xiàn)良好。這些特性有助于它們在體內(nèi)的有效吸收和利用，支持其在神經(jīng)保護(hù)中的潛在應(yīng)用。

2.3.2 EGCG與L-theanine及其主要代謝物抗NDs靶標(biāo)篩選和PPI分析

通過SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫對EGCG及其主要代謝物EGC和GA的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測，共獲得了176個靶點(diǎn)。對于L-theanine及其主要代謝物谷氨酸和乙胺的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，共獲得了170個靶點(diǎn)。EGCG與L-theanine及其主要代謝物的共有潛在靶點(diǎn)320個。同時，從GeneCards數(shù)據(jù)庫中確定了7 341個與NDs相關(guān)的靶點(diǎn)。使用維恩圖展現(xiàn)EGCG和L-theanine主要代謝物與NDs相關(guān)的交集靶點(diǎn)（圖4A、圖4B與圖4E）。

為了探究交集靶點(diǎn)之間的關(guān)系，使用STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-protein interaction，PPI）分析。EGCG/ND的靶點(diǎn)生成了包含127個節(jié)點(diǎn)和

1 010條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)，平均節(jié)點(diǎn)度值為15.5（圖4C）。L-theanine/ND的靶點(diǎn)生成了包含122個節(jié)點(diǎn)和602條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)，平均節(jié)點(diǎn)度值為9.79（圖4D）。EGCG＋L-theanine/ND靶點(diǎn)生成了229個節(jié)點(diǎn)和2 372條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖4F）。靶點(diǎn)之間連線越多，表示該靶點(diǎn)與其他靶點(diǎn)的關(guān)系越密切，度值越大，被確定為核心靶點(diǎn)。核心靶點(diǎn)可能在NDs治療中發(fā)揮重要作

用。EGCG和L-theanine共有潛在靶點(diǎn)之間的連接更為緊密。

2.3.3 EGCG與L-theanine及其主要代謝物抗NDs的蛋白質(zhì)互作富集簇分析

蛋白質(zhì)互作富集簇分析結(jié)果表明，EGCG/ND組的交集靶點(diǎn)主要富集在表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑、黏附功能、神經(jīng)配體-受體相互作用和PI3K-Akt信號通路（圖5A）。L-theanine/ND組的交集靶點(diǎn)主要富集在松弛素信號通路、精氨酸和脯氨酸代謝、神經(jīng)活性配體受體相互作用和脂肪酸代謝途徑（圖5B）。EGCG＋L-theanine/ND交集靶點(diǎn)主要富集在上述簇中，其中神經(jīng)配體-受體相互作用、磷脂酶D信號通路、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子（Rap1）信號通路、環(huán)磷腺苷（cAMP）信號通路、細(xì)胞凋亡和溶酶體相關(guān)富集DE靶點(diǎn)數(shù)量和連接緊密度明顯增加（圖5C）。

EGCG及其代謝物可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)

并減輕細(xì)胞凋亡途徑的損傷，從而發(fā)揮治療NDs的作用。L-theanine及其代謝物則具有調(diào)節(jié)代謝和促進(jìn)生長的作用，能夠產(chǎn)生興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。EGCG與L-theanine協(xié)同作用，能夠增強(qiáng)EGCG和L-theanine各自的效果。

2.4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合分析

本研究通過細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對Aβ25-35/EGCG+L-theanine協(xié)同處理組的差異基因進(jìn)行交互分析，識別出24個關(guān)鍵交互靶基因（圖6A），這些基因在Aβ25-35處理組與Aβ25-35/EGCG＋L-theanine聯(lián)合處理組之間顯示出顯著的表達(dá)差異。GO分析顯示，這些基因主要富集在膽固醇代謝、生長調(diào)節(jié)、多細(xì)胞有機(jī)體水平的穩(wěn)態(tài)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、腦發(fā)育和酒精代謝過程等關(guān)鍵生物通路中（圖6B、圖6C）。

同時，EGCG＋L-theanine聯(lián)合處理上調(diào)了AXL、APP、CTSD、GCLC等基因的表達(dá)，這些基因主要富集在多細(xì)胞有機(jī)體穩(wěn)態(tài)、行為調(diào)控、磷酸化反應(yīng)、核受體元途徑和小分子代謝調(diào)節(jié)等生物過程中。AXL和APP是已知的神經(jīng)保護(hù)因子，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活和信號傳導(dǎo)，

表明EGCG和L-theanine可能通過這些基因促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù)和功能恢復(fù)。GCLC編碼谷胱甘肽合成酶，在抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用，其上調(diào)可能增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力，減輕Aβ25-35誘導(dǎo)的氧化損傷。

此外，研究發(fā)現(xiàn)，這些基因還富集在酒精生物合成過程、發(fā)育生長的負(fù)向調(diào)節(jié)和蛋白質(zhì)磷酸化的正向調(diào)節(jié)等通路中，這些過程主要受到EGCG的影響。EGCG通過調(diào)控這些通路，維持細(xì)胞的靜息狀態(tài)和代謝平衡，減少異常細(xì)胞生長和增殖[30]。聯(lián)合L-theanine的應(yīng)用，則進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的能量代謝和生長修復(fù)，增強(qiáng)了神經(jīng)保護(hù)的效果。表明EGCG和L-theanine在協(xié)同減輕細(xì)胞應(yīng)激、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮了顯著作用[31-32]。這種協(xié)同作用為進(jìn)一步探索EGCG和L-theanine在神經(jīng)退行性疾病中的治療機(jī)制及其臨床應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù)。

3 討論

NDs是老年人的常見疾病，隨著人口老齡化的加劇，其患病率迅速上升[33]。迫切需要更有效的治療策略來遏制NDs的進(jìn)展，同時深入了解每種治療策略的原因和機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的進(jìn)展為闡明某些藥物治療復(fù)雜疾病提供了全新的機(jī)會[34]。基于前期研究結(jié)果[35]，本研究分析了EGCG和L-theanine協(xié)同抑制神經(jīng)退行性改變的作用，并通過網(wǎng)絡(luò)藥理與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的交集靶點(diǎn)分析，揭示了茶葉中的EGCG與L-theanine聯(lián)合應(yīng)用在神經(jīng)退行性改變中的協(xié)同作用。

細(xì)胞試驗(yàn)驗(yàn)證了EGCG和L-theanine能有效抑制由Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷，且聯(lián)合應(yīng)用時表現(xiàn)出明顯的協(xié)同效應(yīng)。EGCG主要通過抑制淀粉樣蛋白的毒性應(yīng)激和維持細(xì)胞靜息狀態(tài)來發(fā)揮作用，而L-theanine則通過抑制DNA損傷和調(diào)節(jié)谷氨酸代謝來提供神經(jīng)保護(hù)（圖1和圖2）。這些結(jié)果與之前的研究一致[35-38]，進(jìn)一步證實(shí)了EGCG和L-theanine在防治NDs中的潛在價值。

細(xì)胞試驗(yàn)顯示，EGCG和L-theanine聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著提高細(xì)胞活力。轉(zhuǎn)錄組分析表明，協(xié)同組上調(diào)的基因與膽固醇和脂質(zhì)代謝相關(guān)，這些基因可能作為神經(jīng)退行性疾病中的治療靶點(diǎn)。下調(diào)基因與蛋白質(zhì)合成相關(guān)（圖2）。在NDs中，蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡可能導(dǎo)致錯誤折疊蛋白積累，形成有毒聚集體，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷和死亡[39]。因此，通過靜息態(tài)效應(yīng)減少蛋白質(zhì)的合成可能具有腦保護(hù)效果。

EGCG和L-theanine聯(lián)合應(yīng)用展現(xiàn)了顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。EGCG在高濃度下（100 μmol·L-1）顯示出促凋亡活性，而在與Aβ25-35聯(lián)合處理時卻表現(xiàn)出相反的結(jié)果（圖1）。這種現(xiàn)象可能是由于EGCG在高濃度下具有雙重作用：既可以引發(fā)氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，又能在Aβ25-35存在情況下通過抗氧化和抗炎機(jī)制緩解細(xì)胞毒性，從而對細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果進(jìn)一步支持這一觀點(diǎn)，顯示EGCG能調(diào)控多條與抗氧化應(yīng)激和脂質(zhì)代謝相關(guān)的信號通路，減輕Aβ25-35的毒性作用，保護(hù)細(xì)胞免受凋亡（圖2）。這進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了EGCG在神經(jīng)退行性疾病防治中的復(fù)雜作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供了重要理論依據(jù)。

L-theanine單獨(dú)處理未能顯著改善Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷（圖1C和圖1D），轉(zhuǎn)錄組分析也支持這一點(diǎn)，顯示L-theanine處理組的DEGs數(shù)量較少，對細(xì)胞整體基因表達(dá)影響較弱（圖2F）。L-theanine主要通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)重塑、DNA代謝和免疫過程發(fā)揮作用，但在抵抗Aβ25-35誘導(dǎo)的急性毒性應(yīng)激方面作用有限。相比之下，EGCG處理顯著影響了氧化應(yīng)激反應(yīng)、脂質(zhì)代謝和細(xì)胞凋亡路徑（圖2E），增強(qiáng)了細(xì)胞的抗逆性。當(dāng)EGCG與L-theanine聯(lián)合應(yīng)用時，顯著擴(kuò)展了單獨(dú)處理的作用范圍，調(diào)控多個關(guān)鍵生物過程（圖2G），增強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)效果，提高細(xì)胞活力（圖1D）。因此，L-theanine單獨(dú)應(yīng)用在神經(jīng)代謝和突觸功能調(diào)控方面有潛力，但在急性細(xì)胞毒性應(yīng)激抵抗方面作用有限，聯(lián)合EGCG應(yīng)用則顯著增強(qiáng)了細(xì)胞的抗逆性和修復(fù)能力，體現(xiàn)出更強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)效果。這一發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步探索EGCG與L-theanine在神經(jīng)退行性疾病中的協(xié)同機(jī)制提供了理論依據(jù)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示，EGCG在調(diào)節(jié)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中起著顯著作用，其潛在靶點(diǎn)主要涉及氧化應(yīng)激、β-淀粉樣蛋白的處理以及細(xì)胞凋亡路徑。L-theanine通過參與神經(jīng)元的突觸信號傳遞，有助于恢復(fù)功能失調(diào)的谷氨酸穩(wěn)態(tài)。當(dāng)EGCG和L-theanine聯(lián)合應(yīng)用時，它們在NDs相關(guān)的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中展示了更廣泛且溫和的調(diào)控作用（圖4～圖5）。這種協(xié)同效應(yīng)可能提高了它們在治療NDs中的潛在效果，支持了進(jìn)一步的臨床研究與應(yīng)用。

此外，轉(zhuǎn)錄組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的交互分析進(jìn)一步揭示了EGCG和L-theanine在NDs中的潛在協(xié)同機(jī)制（圖6）。本研究共識別出24個關(guān)鍵交互靶基因，這些基因主要富集在膽固醇代謝、生長調(diào)節(jié)、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、氧化應(yīng)激反應(yīng)和腦發(fā)育等通路。EGCG通過調(diào)節(jié)這些通路，維持細(xì)胞靜息狀態(tài)，減少異常細(xì)胞生長和增殖。聯(lián)合L-theanine的應(yīng)用則進(jìn)一步促進(jìn)了細(xì)胞的能量代謝和生長修復(fù)，表明EGCG和L-theanine在減輕細(xì)胞應(yīng)激、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮了顯著作用。

本研究通過體外Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞AD模型和利用人類疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行的網(wǎng)絡(luò)藥理分析，發(fā)現(xiàn)EGCG與L-theanine協(xié)同抑制淀粉樣蛋白應(yīng)激、調(diào)節(jié)代謝并促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞軸突功能，通過多途徑多靶點(diǎn)抑制神經(jīng)退行性改變。這項研究首次揭示了EGCG與L-theanine協(xié)同作用，通過維護(hù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)來促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)和再生，為茶葉的神經(jīng)保護(hù)的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

然而，本研究還存在一定的局限性，后續(xù)的研究可以進(jìn)一步探索如何優(yōu)化EGCG和L-theanine的聯(lián)合治療策略，以提高其療效和應(yīng)用范圍。另外，需要進(jìn)一步聚焦EGCG與L-theanine聯(lián)合應(yīng)用對神經(jīng)細(xì)胞代謝的具體調(diào)節(jié)機(jī)制，并利用神經(jīng)退行性改變的動物模型，深入研究EGCG和L-theanine在體內(nèi)的協(xié)同作用機(jī)制。

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