關(guān)鍵詞：厭氧發(fā)酵；牛糞；納米鐵氧化物；揮發(fā)性脂肪酸；宏基因組學(xué)

集約化養(yǎng)殖快速發(fā)展產(chǎn)生了大量畜禽糞污，以牛糞為例，根據(jù)中國統(tǒng)計年鑒（http：//www．stats．gov．cn/sj/ndsj／）和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布的養(yǎng)殖畜禽糞尿產(chǎn)生系數(shù)（https： //www. gov. cn/zhengce/zhengceku／2018-12／31／content_5442613．htm）估算，2018年我國年產(chǎn)牛糞約12.8億t。若不經(jīng)處理直接排放會對養(yǎng)殖場周圍的水體、土壤和大氣環(huán)境造成嚴(yán)重污染。厭氧發(fā)酵通過降解有機(jī)質(zhì)產(chǎn)沼氣，目前已廣泛應(yīng)用于牛糞處理。然而，產(chǎn)氣效率低是牛糞厭氧發(fā)酵面臨的主要問題，這是因為牛糞富含木質(zhì)纖維素，其緩慢的水解效率制約了產(chǎn)甲烷效率。目前，研究人員采用多種方法來提高牛糞厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣性能，包括：（1）與低木質(zhì)素含量底物共發(fā)酵以減輕木質(zhì)素對水解菌的生物抑制作用；（2）預(yù)處理破壞木質(zhì)纖維素提高其生物降解性；（3）新厭氧發(fā)酵體系構(gòu)建（如微生物電化學(xué)）；（4）外源添加劑強(qiáng)化水解和產(chǎn)甲烷階段。

在上述方法中，外源添加劑在提升產(chǎn)氣性能和經(jīng)濟(jì)可行性方面具有顯著優(yōu)勢。其中，鐵及其化合物作為多種酶（如甲酰一甲呋喃脫氫酶、氫化酶、一氧化碳脫氫酶）的輔因子參與甲烷合成，是公認(rèn)的可改善牛糞厭氧發(fā)酵性能的添加劑之一。此外，鐵還能參與厭氧微生物能量代謝途徑Wood-Ljungdahl（WL），并能作為最終電子受體改善厭氧發(fā)酵過程。

在鐵化合物中，納米鐵氧化物（Iron oxidenanoparticle，INP）因其具有高比表面積、超準(zhǔn)磁性、易跨膜運(yùn)送和低生物毒性受到研究者的廣泛關(guān)注。如Abdelsalam等添加20mg·L-1 INP，將牛糞厭氧發(fā)酵甲烷產(chǎn)量提升1.96倍。Farghali等開展系列實驗，證實了添加INP可將牛糞甲烷產(chǎn)量提升10.5%-56.9%?；谧髡咔捌谖墨I(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，INP促進(jìn)牛糞厭氧發(fā)酵相關(guān)研究主要集中于短期批式實驗，對于更接近牛糞沼氣工程實際運(yùn)行情況的長周期半連續(xù)實驗鮮有報道。此外，前人研究對INP強(qiáng)化微生物代謝途徑這一核心作用缺乏深入分析。因此，本研究將開展以牛糞為底物的半連續(xù)試驗，并基于16S rRNA分析和宏基因組闡明INP添加對牛糞厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣效率和微生物群落演替和代謝途徑的影響。研究結(jié)果以期為牛糞沼氣工程INP的使用和相關(guān)理論基礎(chǔ)的完善提供參考。

1材料和方法

1.1材料與實驗設(shè)計

半連續(xù)試驗在兩個完全相同的連續(xù)攪拌反應(yīng)器（Continuous stirred tank reactor. CSTR）中進(jìn)行，CSTR的工作容積為2.4L。其中R-Fe為添加INP的實驗組，R-C為對照組。表1列出了試驗的基本運(yùn)行狀況。牛糞理化性質(zhì)如下：pH： 8.59+0.03;總固體：（278+15）mg·g-1；揮發(fā)性固體：（168+12）mg·g-1;纖維素：（153.1+6.1）mg·g-1;半纖維素：（140.5+3.4）mg·g-1;C：（314.3+0）mg·g-1;H：（42.9+0.1）mg·g-1;N：（22.1+0.7）mg·g-1; 0： （615.7+0.1）mg·g-1;S：（5.1±0.2）mg·g-1。試驗開始前，兩個CSTR均以牛糞為唯一底物穩(wěn)定運(yùn)行100d，并具有相近的日產(chǎn)甲烷量（Pgt;0.05）。本試驗中有機(jī)負(fù)荷（Organic loading rate，OLR）和水力停留時間（Hydraulic retention time，HRT）分別為1g·L-1·d-1（以VS計）和25d，并在整個試驗中保持不變。試驗共分3個階段（表1），第1階段（第1～25天），R-Fe和R-C僅添加牛糞。第2階段（第26-51天），R-Fe每天額外加入1.5gINP（Fe304，粒徑50-100nm，CAS：1317-61-9），R-C無任何外源添加劑。在第3階段（第52-115天），R-Fe停止添加INP，R-C無任何外源添加劑。CSTR運(yùn)行模式為半連續(xù)進(jìn)料，即每日進(jìn)出料一次，先出料后進(jìn)料。反應(yīng)溫度為37℃，轉(zhuǎn)速設(shè)定為120r·min-1。

1.2測定指標(biāo)和分析方法

1.2.1氣體、液體化學(xué)組成分析

總固體含量（Total solid，TS）、揮發(fā)性固體含量（Volatile solid，VS）、纖維素和半纖維素測定方法參考Li等。沼氣體積由氣體流量計（Ritter，德國）測定，沼氣中CH4和C02含量由微型氣相色譜儀（C2V-200Micro GC，Thermo Scientific，美國）測定。

液體樣品的pH值由pH計測定。總揮發(fā)性脂肪酸（Total

volatile fattv

acids，TVFAs）和總堿度（TotalAlkalinity，TA）由自動滴定儀（AT1000，Hach，德國）測定，總化學(xué)需氧量（Total chemical oxygen demand．TCOD）用哈希試劑盒（LCK 014，Hach，德國）測定。

1.2.2 16S rRNA分析

在第2階段末期（第51天，標(biāo)記為R-Fe1和R-C1）和第3階段中期（第75天，標(biāo)記為R-Fe2和R-C2），取樣（每個處理取3個樣品）進(jìn)行16S rRNA分析。具體方法：使用FastDNA@Spin Kit提取樣品中總DNA。提取的DNA作為后續(xù)PCR反應(yīng)的模板。使用引物擴(kuò)增16S-rRNA基因的V3-V4區(qū)。其中，細(xì)菌用引物338F（5’-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’）和806R（5’-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3’）擴(kuò)增，古菌用引物524F（5’-TGY CAG CCG CCGCGG TAA-3’）和958R（5’-YCC GGC GTT GAV TCCAAT T-3’）擴(kuò)增。

1.2.3宏基因組分析

為了進(jìn)一步闡明INP對牛糞厭氧發(fā)酵的長期影響，在第3階段結(jié)束時（第115天）取樣（每個處理取3個樣品）進(jìn)行宏基因組分析。使用fastp（ https：／／github．com/OpenGene/fastp）去除適配序列（3’端和5’端）、低質(zhì)量堿基（lt;20個）、短長度（lt;50 bp）和有N個堿基的讀長，以獲得純凈讀長。然后使用MEGAHIT（https：//github．com/voutcn/megahit）對讀長進(jìn)行組裝（gt;300 bp），用于進(jìn)一步的基因預(yù)測和注釋。使用BLASTP（BLAST

Version

2.2.28+， http： //blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast．cgi）分別對EGGNOG數(shù)據(jù)庫（http：//egg-nog．embl．de/）和KEGG數(shù)據(jù)庫（http：//www．genome．jp/kegg/）進(jìn)行COG（蛋白質(zhì)同源群）和KEGG注釋，e值截斷值為e-。

1.2.4數(shù)據(jù)處理

使用Origin（9.4版）對數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗，以0.05做為顯著性的閾值。

2結(jié)果與討論

2.1反應(yīng)器運(yùn)行情況

表1總結(jié)了反應(yīng)器的運(yùn)行情況。在第1階段，R-Fe和R-C的日甲烷產(chǎn)量（以VS計，下同）無顯著差異（Pgt;0.05）。R-Fe為（133.4+6.9） mL·g-1·d-1；R-C為（127.1+4.1）mL·g-1·d-1。這表明在沒有外加INP的情況下兩個反應(yīng)器具有相似的運(yùn)行情況。在第2階段，R-Fe中添加INP后，日甲烷產(chǎn)量迅速提高到173.4mL·g-1·d-1，與對照相比提高了38.3%（表1）。類似地，含鐵化合物對牛糞厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷的促進(jìn)作用在前人的批式實驗中已有報道，如Abdelsalam等發(fā)現(xiàn)添加10mg·L-1 FeC13可提升牛糞累積產(chǎn)氣量21.2%；Yun等發(fā)現(xiàn)添加鐵鹽[Fe2（S04）3、Fe （N03）3、FeCl3和FeC12]可以縮短反應(yīng)啟動時間（15-18d），累積甲烷產(chǎn)量提升2.7%-6.4%。此外，R-Fe出料殘渣中纖維素含量顯著低于R-C（Plt;0.05），表明INP添加有利于纖維素水解，這與Dehhaghi等的發(fā)現(xiàn)一致。此外，R-Fe中的TVFAs濃度顯著低于R-C（Plt;0.05），表明更多的酸轉(zhuǎn)化為甲烷，這也與Preeti等、劉莉莉等的發(fā)現(xiàn)一致。上述結(jié)果表明INP添加有利于水解菌、酸氧化菌和產(chǎn)甲烷菌的富集。然而，添加INP導(dǎo)致TA急劇下降，這是由于發(fā)酵料液中C02（以C03-和HC03形式存在）與INP發(fā)生礦物碳酸化形成FeC03或Fe2（C03）3所致，而C02的減少會導(dǎo)致堿度下降。第3階段，當(dāng)R-Fe停止添加INP后，其對產(chǎn)甲烷過程的促進(jìn)作用仍然持續(xù)存在，具體表現(xiàn)在R-Fe中日甲烷產(chǎn)量仍顯著高于R-C（Plt;0.05）（表1）。一個可能的原因是，INP被微生物（如產(chǎn)甲烷菌）吸收并構(gòu)建甲烷合成酶的相關(guān)輔酶因子，并隨著老化微生物裂解釋放到環(huán)境中，再被新生微生物利用，如此反復(fù)，從而能持續(xù)強(qiáng)化產(chǎn)甲烷過程。

2.2 16S rRNA分析

2.2.1 Alpha多樣性

表2通過OTUs、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映了不同樣本的Alpha多樣性。前人研究表明，優(yōu)異的厭氧消化性能通常與微生物Alpha多樣性相關(guān)，具體表現(xiàn)為更高的Shannon或Simpson指數(shù)。本試驗中，R-Fe與R-C相比具有顯著性更高的Alpha多樣性指數(shù)（Plt;0.05），尤其體現(xiàn)在產(chǎn)甲烷古菌中（表2）。這也解釋了R-Fe中更優(yōu)異的產(chǎn)甲烷性能。

2.2.2細(xì)菌

從屬的層面來看，添加INP顯著提高了Syntrophu.s，Me.s otoga和noranh_f_W27的相對豐度（Plt;0.05，圖1）。其中，nora nh_f_Prolixibacteraceae[R-Fel：（19.7±2.8）%，R-Fe2：（ 25.3±4.4）%;R-C1：（16.4±2.1）%，R-C2：（17.2±1.9）%]具備降解纖維素的能力，這與R-Fe出料中纖維素濃度顯著低于R-C一致（表1）。[R-Fe 1：（7.4±1.1）%，R- Fe2： （5.3±1.4）%; R-C1：（3.2+ 1.0）%， R-C2：（3.1±1.2）%]和noranh_f_W27[R-Fel：（2.7±0.8）%，R-Fe2：（1.9±0.7）%；R-CI：低于檢測限，R-C2：低于檢測限]均參與酸氧化途徑，并與嗜氫產(chǎn)甲烷菌互利共生。Hassaneen等發(fā)現(xiàn)牛糞厭氧發(fā)酵中添加鐵鋅氧化物有利于和嗜氫產(chǎn)甲烷菌的富集，并最終提高了甲烷產(chǎn)量；[R-Fel：（5.5±1.3）%，R-Fe2：（7.4±1.1）%;R—Cl：（2.6±0）%，R—C2：（4.1±0.7）%]參與蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)乙酸、二氧化碳和氫氣，并可以分泌酶參與氫氣所攜帶的電子后續(xù)利用；Syntro phu.s[R-Fel：（2.0+0.1）%， R-Fe2：（2.0±0.2）%：R-C1：（1.1±0.4）%，R-C2：低于檢測限]是一種典型產(chǎn)氫菌，能參與氫氣介導(dǎo)的種間電子傳遞；Me.sotoga[R-Fe1：（2.3±0.6）%，R-Fe2：（3.1±0.4）%；R-C1：低于檢測限，R-C2：低于檢測限]可通過與嗜氫產(chǎn)甲烷菌的協(xié)同作用進(jìn)行高效的糖氧化（如纖維生物糖和木糖）。此外Mesotoga還能參與乙酸氧化（Syntrophic acetate oxi-dation．SAO）途徑。綜上，添加INP顯著提高了纖維素降解菌和酸氧化菌的相對豐度，這與表1中R-Fe中較低的纖維素濃度和TVFAs濃度一致。

2.2.3產(chǎn)甲烷菌

產(chǎn)甲烷階段是影響厭氧發(fā)酵效率的關(guān)鍵階段，其中產(chǎn)甲烷菌是關(guān)鍵菌群。鐵是構(gòu)成產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞組成的重要元素，且在所有的微量元素中，產(chǎn)甲烷菌對鐵的需求量遠(yuǎn)高于其他元素。

與細(xì)菌的多樣性不同，產(chǎn)甲烷菌主要由四個屬組成。其中BathVarchaeia在所有樣本中占絕對優(yōu)勢?；谧髡咧暗难芯?，Bathyarchaeia是一種具有多種功能的產(chǎn)甲烷菌，且主要分布于以牛糞為主的厭氧發(fā)酵體系中。在本研究中，添加INP會顯著降低BathVar-chaeia[R-Fel：（77.3+4.7）%，R-Fe2：（ 80.1+3.4）%;R-Cl：（92.0±5.2）%，R-C2：（92.4±4.4）%]的相對豐度，但有利于Methanoculleu.s的富集[R-Fel： （11.3+2.1）%，R-Fe2：（ 10.7+1.4）%： R-CI：（4.9±1.1）%，R-C2：（1.5+0.1）%，Plt;0.05]。Methanoculleus作為典型的嗜氫產(chǎn)甲烷菌，可與乙酸氧化菌通過SAO途徑協(xié)同產(chǎn)甲烷。有研究表明，在以纖維素或蛋白質(zhì)為底物的厭氧發(fā)酵中，Methanoculleus是產(chǎn)甲烷的主要貢獻(xiàn)者。此外，在作者之前的研究中發(fā)現(xiàn)Methanoculleus富集有助于提升牛糞厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣性能。類似地，高銘雪發(fā)現(xiàn)在牛糞批式厭氧發(fā)酵中添加INP后，Methanoculleus的相對豐度從對照的2.93%提升到4.58%，相應(yīng)的甲烷產(chǎn)量提升了33.6%;Preeti等也發(fā)現(xiàn)添加鐵化合物將產(chǎn)甲烷菌濃度從4.6x108個·mL-1提升到1.5X10個·mL-1，甲烷產(chǎn)量提升40%。綜合乙酸氧化菌如Mesotoga的富集，本研究揭示了Mesotoga和Methanoculleus之間協(xié)同共生的互營關(guān)系，這可能是INP提升甲烷產(chǎn)量的主要原因。

2.3宏基因組分析

為了進(jìn)一步闡明INP對牛糞厭氧發(fā)酵的長期影響，在第3階段結(jié)束時進(jìn)行了宏基因組分析。基于分析結(jié)果預(yù)測了參與牛糞厭氧發(fā)酵不同代謝途徑的關(guān)鍵酶，如表3、表4所示。R-Fe中共含有19445492+674 628個純凈讀長，R-C中共有19286875+1145429個純凈讀長。牛糞富含較難降解的木質(zhì)纖維素，其中可生物降解的成分主要是纖維素和半纖維素。針對纖維素水解，首先微生物分泌脫支鏈酶，如乙酰木聚糖酯酶（EC 3.1.1.72）、阿拉伯糖苷酶（EC 3.2.1.185／3.2.1.55）和羧酯酶（EC 3.1.1.1），用于去除木聚糖骨架的側(cè)鏈單元，使水解酶更容易接觸纖維素和半纖維素單元。這些酶的活性在R-Fe和R-C中無顯著差異（Pgt;0.05）。要徹底降解纖維素需要來自細(xì)胞酶相關(guān)酶（纖維素酶、外切纖維酶和B -葡萄糖苷酶）的協(xié)同作用，尤其是纖維素酶（EC3.2.1.4）。宏基因組結(jié)果表明R-Fe的纖維素酶活性顯著高于R-C（Plt;0.05），表明添加INP強(qiáng)化纖維素降解，這與R-Fe中出料殘渣中更低的纖維素濃度以及前人研究一致（表1、表3）。此外，添加INP還顯著強(qiáng)化了葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21）的活性（Plt;0.05），這表明添加INP有利于纖維素水解產(chǎn)物（如纖維二糖）的降解，從而加速水解產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。針對半纖維素水解，首先木聚糖酶（EC3.2.1.8）隨機(jī)切斷B-1，4-木聚糖骨架結(jié)構(gòu)中的B-1，4-糖苷鍵，生成木糖和木寡糖。然后，乙酰木聚糖酯酶（EC 3.1.1.72）、a-D-葡萄糖醛酸酶（EC 3.2.1.1）、木聚糖1，4-B-木糖苷酶（EC 3.2.1.37）和阿拉伯糖苷酶（EC 3.2.1.55）協(xié)同切斷木糖單體和木聚糖側(cè)鏈之間的連接，方便微生物進(jìn)一步利用。INP添加未顯著提升這些酶的活性（Pgt;0.05）．這與出料中接近的半纖維素濃度相一致（表1）。這可能是因為半纖維素的高支鏈結(jié)構(gòu)、低結(jié)晶度和異質(zhì)性本身使其很容易被水解微生物降解。

宏基因組進(jìn)一步揭示了將水解產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A（乙酸前體物質(zhì)）的相關(guān)酶。從纖維素／半纖維素降解產(chǎn)生的兩個中間產(chǎn)物：B-D-果糖6-磷酸和a-D-葡萄糖6-磷酸主要通過一系列酶轉(zhuǎn)化為丙酮。生成的丙酮通過丙酮一二氫化輔酶還原酶（EC 1.2.7.1）進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A。R-Fe中與纖維素水解中間產(chǎn)物利用的相關(guān)酶活性顯著高于R-C（Plt;0.05），但與半纖維素水解中間產(chǎn)物利用的相關(guān)酶活性無明顯差異（Pgt;0.05）。該結(jié)果進(jìn)一步表明INP添加主要促進(jìn)纖維素水解及中間代謝產(chǎn)物利用，而對于半纖維素水解和后續(xù)利用的提升效果有限。

本質(zhì)上，厭氧發(fā)酵是碳的一種生物固定過程，并以甲烷為最終產(chǎn)物。Fe通過作為多種酶（甲酰一甲呋喃脫氫酶、氫化酶、一氧化碳脫氫酶）的輔因子參與甲烷生成。宏基因組數(shù)據(jù)表明，嗜乙酸產(chǎn)甲烷途徑和嗜氫產(chǎn)甲烷途徑相關(guān)酶均參與了甲烷合成（表4）。經(jīng)過水解酸化產(chǎn)生的乙酰輔酶A最終通過一系列代謝途徑磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶（EC 2.3.1.8）、乙酸激酶（EC2.7.2.1）．乙酸-CoA連接酶（EC 6.2.1.1）、CO-甲基化乙酰-CoA合成酶（EC 2.3.1.169）、乙酰輔酶脫碳酶／合成酶（EC 2.1.1.245）、四氫甲氧基蝶呤S甲基轉(zhuǎn)移酶（EC 2.1.1.86）和甲基輔酶M還原酶（EC 2.8.4.1）]最終轉(zhuǎn)化為甲烷。本研究中，R-Fe的磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶（EC 2.3.1.8）、乙酸激酶（EC 2.7.2.1）和乙酸-CoA合成酶（EC 6.2.1.1）活性顯著高于R-C（Plt;0.05），表明INP促進(jìn)了乙酰輔酶A和乙酸之間的相互轉(zhuǎn)化，從而強(qiáng)化了嗜乙酸產(chǎn)甲烷途徑（表4）。對于嗜氫產(chǎn)甲烷途徑，其主要依賴WL途徑，WL途徑在產(chǎn)甲烷古菌的能量產(chǎn)生和碳固定中起重要作用。嗜氫產(chǎn)甲烷菌（如Methanoculleus）通過WL途徑的甲基支鏈Methyl-Branch Pathway：包含鐵元素的甲酰基甲呋喃脫氫酶（EC 1.2.7.12）、甲酰甲呋喃一四氫氫蝶呤N-甲酰轉(zhuǎn)移酶（EC 2.3.1.101）、四氫甲氧基苯甲蝶呤環(huán)氫酶（EC3.5.4.27）、亞甲基四氫蝶呤脫氫酶（EC 1.5.98.1）和5，10-亞甲基四氫蝶呤還原酶（EC 1.5.98.2）]逐步將二氧化碳還原為Methyl-H4MPT。形成的Methyl-H4MPT的甲基基團(tuán)通過四氫甲氧基蝶呤S甲基轉(zhuǎn)移酶（MTR： EC 2.1.1.86）催化到輔酶M，生成CH3-S-CoM，并由甲基輔酶M還原酶（MCR： EC 2.8.4.1）將其還原為甲烷和異二硫酸（CoM-S-S-CoB）。R-Fe中參與嗜氫產(chǎn)甲烷途徑相關(guān)酶，如嗜氫產(chǎn)甲烷途徑核心酶一輔酶F420（EC 1.12.98.1），以及甲?；走秽摎涿福‥C 1.2.7.12）、甲酰甲呋喃一四氫氫蝶呤N-甲酰轉(zhuǎn)移酶（EC 2.3.1.101）和四氫甲氧基苯甲蝶呤環(huán)氫酶（EC 3.5.4.27）的活性均顯著高于R-C，表明INP添加也促進(jìn)了嗜氫產(chǎn)甲烷途徑（Plt;0.05，表4）。該結(jié)果與16S rRNA中嗜氫產(chǎn)甲烷菌Methanoculleu.s的富集相一致。作為甲烷合成的最后一步，R-Fe中MCR（EC2.8.4.1）活性顯著高于R-C（Plt;0.05，表4），表明添加INP強(qiáng)化了甲烷合成，這與R-Fe中更高的甲烷產(chǎn)量相一致（表1）。

3結(jié)論

（1）牛糞連續(xù)厭氧發(fā)酵中添加納米鐵氧化物（INP）可顯著提升日產(chǎn)甲烷量（Plt;0.05），與對照相比提升38.3%。在停止添加INP后，反應(yīng)器的日產(chǎn)甲烷量依然顯著高于對照，并持續(xù)了至少2個水力停留時間。

（2）16S rRNA分析表明，添加INP富集了纖維素水解菌，以及協(xié)同乙酸氧化互營菌：乙酸氧化菌Me.sotoga和嗜氫產(chǎn)甲烷菌Methanoculleu.s，有利于揮發(fā)性脂肪酸的代謝，從而促進(jìn)產(chǎn)甲烷過程。

（3）宏基因組學(xué)分析表明，添加INP顯著促進(jìn)了水解階段、嗜乙酸產(chǎn)甲烷和嗜氫產(chǎn)甲烷階段相關(guān)酶活性，并顯著強(qiáng)化了甲烷合成關(guān)鍵酶一甲基輔酶M還原酶（EC2.8.4.1）的活性（Plt;0.05）。