關(guān)鍵詞：氮肥形態(tài)；鉻污染；李氏禾；根系特征；修復(fù)效率

鉻作為被廣泛使用的工業(yè)原料，在工業(yè)生產(chǎn)過程中會被排放到環(huán)境中，對環(huán)境造成污染，同時其可以通過食物鏈在人體中累積，對身體健康產(chǎn)生有害影響，所以土壤鉻污染一直是人們關(guān)注的熱點環(huán)境問題之一。植物修復(fù)作為土壤修復(fù)的一種有效且低成本技術(shù)，植物生物量和土壤中重金屬的生物利用度是影響植物修復(fù)效率的關(guān)鍵因素。李氏禾（Leersiahexandra Swartz）是中國境內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)的鉻超富集植物，為多年生植物，能多次刈割，具有生物量大、生長迅速等特點，是修復(fù)土壤鉻污染的一種理想植物。

氮作為植物生長的必需營養(yǎng)元素，施加氮肥能提高植物的葉綠素含量，促進植物生物量積累。而且植物生長發(fā)育受植物激素調(diào)控，施加氮肥可能會影響植物體內(nèi)的植物激素含量，從而對植物生長產(chǎn)生影響。在植物修復(fù)技術(shù)中，植物生物量的大小對植物重金屬累積量有直接影響。近年來，有研究表明，不同氮肥形態(tài)對超富集植物東南景天的生物量影響不同，進而影響其對重金屬的累積量。同時，不同形態(tài)氮肥會在土壤中發(fā)生不同反應(yīng)，對土壤pH值的影響不同。土壤中重金屬遷移轉(zhuǎn)化受土壤pH值影響，而土壤重金屬遷移轉(zhuǎn)化可能改變土壤重金屬賦存形態(tài)占比，從而影響植物吸收效率。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，合理地施加氮肥能顯著提高植物根系活力，且不同氮肥形態(tài)會對植物根系形態(tài)產(chǎn)生不同影響，如銨態(tài)氮能促進植物的根直徑增加，而硝態(tài)氮能促進植物側(cè)根發(fā)育，從而增加植物根長。植物根系是植物吸收重金屬的重要器官，有研究發(fā)現(xiàn)植物重金屬含量與植物的總根長、根表面積、根體積呈正相關(guān)，所以根系形態(tài)的變化可能會影響植物對重金屬的吸收，從而影響重金屬在植物組織中的累積。而植物根系活性會受重金屬抑制，植物根系活性的降低會影響根系發(fā)育。所以在鉻污染土壤中研究施加不同形態(tài)氮肥對李氏禾根系形態(tài)與根系活力的影響，對李氏禾鉻吸收機理具有重要意義。

本試驗在張學(xué)洪等的研究基礎(chǔ)上，在鉻污染土壤中，以超富集植物李氏禾作為研究對象，增加酰胺態(tài)氮及氯化銨，對施氮條件進行優(yōu)化，施加0.02mol·kg-1的不同形態(tài)的氮肥。通過對李氏禾的生物量、根系形態(tài)特征、鉻含量和土壤鉻含量等進行分析，探究施加不同形態(tài)氮肥對李氏禾富集能力的影響，以期闡明氮肥對強化李氏禾鉻修復(fù)機制，為鉻污染土壤場地應(yīng)用提供理論參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

李氏禾幼苗采自于廣西壯族自治區(qū)桂林市荔浦市某礦區(qū)，對采回來的李氏禾幼苗進行挑選修剪后，于溫室下用20%的Hoagland營養(yǎng)液于2.5L塑料桶中進行預(yù)培養(yǎng)7d，使其長出根。

供試土壤選用桂林市雁山區(qū)桂林理工大學(xué)校園土，土壤在陰涼處自然風(fēng)干后，挑去其中的雜質(zhì)、樹根和落葉等，將所取土樣研磨，充分混勻后過10目篩。土壤基本理化性質(zhì)：pH4.97，有機質(zhì)50.1g·kg-1，銨態(tài)氮16.0mg·kg-1，速效磷49.1mg·kg-1，速效鉀144mg·kg-1，總鉻含量66.4mg·kg-1。以溶液形式添加K2Cr202配制鉻污染土，平衡3周后測定土壤總鉻含量為315.1mg·kg-1。

1.2盆栽試驗

稱取2kg供試土壤裝入規(guī)格為2.5L（高21cm，直徑19cm）的塑料桶中，選取生長一致的李氏禾移人盆內(nèi)，每盆20株。試驗共設(shè)6個處理，每個處理3次重復(fù)。6個處理分別為：硝酸鈣（X）、尿素（UN）、氯化銨（NC）、硝酸銨（NN）、硫酸銨（NS）5種氮肥處理組和對照處理組（CK，不施加氮肥）。施加氮肥量為0.02mol·kg-1，處理60d后收獲植物，盆栽收樣時不同處理的李氏禾如圖1所示。

1.3植物及土壤樣品的采集、處理及測定方法

1.3.1李氏禾生長指標(biāo)及鉻含量的測定

李氏禾種植60d收獲，在收樣前測量株高和葉綠素含量。用直尺從盆栽李氏禾根部測量至李氏禾最高處作為株高；采用95%乙醇提取一分光光度法測定葉綠素含量。收獲后的李氏禾用自來水洗凈后，再用去離子水潤洗3次，將清洗后的李氏禾分成根部和地上部待用。將洗凈的李氏禾擦干放進信封置于烘箱中105℃殺青30min后，75℃烘干至恒質(zhì)量。將根、莖、葉分開用電子天平測其干質(zhì)量。

稱取烘干磨碎的李氏禾樣品0.2g，用HN03-H202消解，消解后的李氏禾采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（PerkinElmer Optima 7000 DV）測定鉻含量，并采用國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW07603，灌木枝葉）進行質(zhì)量控制，加標(biāo)回收率為90.0%-102.5%。

1.3.2李氏禾根系活力的測定

采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）法測定根系活力。稱取新鮮的李氏禾根系0.2g完全浸沒于1% TTC溶液和等量0.1mol·L-1磷酸緩沖液混合液中，37℃避光孵育1-3h后加入2mL硫酸（1mol·L-1）以終止反應(yīng)。將根系取出，擦干水分后與3-5mL乙酸乙酯一起放在研缽內(nèi)研碎，以提取出三苯基甲腙（TTF）。把紅色浸提液過濾到10mL容量瓶，用乙酸乙酯定容，在波長485nm下測定吸光度。通過TTF標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的TTF含量，即為李氏禾根系活力（TTFmg·g-1·h-1）。

1.3.3李氏禾的根系形態(tài)測定

李氏禾收獲后，將洗凈的根部剪下，用直尺測量根部長度，然后將根放進有去離子水的塑封袋中。將李氏禾根系平鋪在根系掃描系統(tǒng)（萬深LA-S植物根系分析系統(tǒng)）的樹脂平板上進行掃描，用鑷子將重疊的部分分開。測定的根系形態(tài)包括根平均直徑、總根表面積、總根長和總根體積。

1.3.4李氏禾的植物激素測定

采用固相萃?。⊿PE）和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MSIMS）對6種植物激素[順式玉米素核苷-O-糖苷（cZROG）、異戊烯腺嘌呤-7-葡糖苷（iP7G）、2-甲硫基順式玉米素核苷（2MeScZR）、N6-異戊烯腺嘌呤（IP）、異戊烯腺嘌呤-9-葡糖苷（iP9G）和反式一玉米素-9-B-葡萄糖苷（tZOG）]進行分析和測定。將稱質(zhì)量后的樣品研磨后放人10mL離心管中，加入5mL提取液（甲醇：水：甲酸=15：4：1，含0.5%二丁基羥基甲苯）漩渦混合1min、超聲振蕩30min，于-40℃下靜置60min。固相萃?。海?）活化，用3mL水和3mL甲醇洗滌萃取柱。（2）吸附，將上清液注入柱中，流速應(yīng)小于1mL·min-1。（3）淋洗，用3 mL水和10%的甲醇清洗色譜柱。（4）洗脫，1mL甲醇。洗脫液用蒸發(fā)濃縮器干燥，然后加入200uL 80%甲醇復(fù)溶，再次旋轉(zhuǎn)離心（12000r·min-1，10min）。最后用LC-MS/MS分析上清液。

標(biāo)準(zhǔn)品購自源葉生物科技有限公司。準(zhǔn)確取標(biāo)準(zhǔn)溶液（2.5ug·mL-1）0.20mL，用80%的甲醇定容至1mL配制成濃度為500ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用80%的甲醇稀釋成標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。根據(jù)不同濃度及相應(yīng)濃度下標(biāo)品的峰面積繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

儀器：液相色譜Waters Acquity UPLC，質(zhì)譜ABSCIEX 5500 Qtrap-MS。

色譜柱：Acquity UPLC HSS T3（1.8um，2.1mmX100mm）。

1.3.5土壤理化性質(zhì)測定

土壤pH值采用水土比2.5：1（V/m）提取，pH計測定；有機質(zhì)用重鉻酸鉀加熱法測定；銨態(tài)氮用氯化鉀浸提，流動注射分析儀（荷蘭SKALAR SAN++）測定；速效磷用碳酸氫鈉一分光光度法測定；速效鉀用乙酸銨浸提法測定。

1.3.6土壤鉻含量和鉻形態(tài)的測定

土壤總鉻含量測定采用HN03-H202消解法，土壤鉻質(zhì)量控制用國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW07404，土壤），加標(biāo)回收率為89.8%-101.0%。施肥種植后的土壤鉻賦存形態(tài)采用BCR四步連續(xù)提取法測定。消解和提取后的鉻含量用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（PerkinElmer Optima 7000 DV）測定。

1.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析方法

富集系數(shù)（BCF）=李氏禾地上部鉻含量（mg·kg-1）／土壤總鉻含量（mg·kg-1）

修復(fù)效率（土壤鉻去除率）=（修復(fù)前土壤總鉻含量一修復(fù)后土壤總鉻含量）／修復(fù)前土壤總鉻含量×100%

使用Microsoft Excel 2019和SPSS 26對數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計學(xué)分析。植物生長指標(biāo)及修復(fù)效率采用單因素方差分析（ANOVA），通過最小顯著差數(shù)法（LSD）進行顯著性檢驗（Plt;0.05）。植物激素含量采用t檢驗（Student'st-test）分析顯著差異性。使用Origin 2021繪制柱狀圖，使用R4.1.3中R包“Heatmap”進行相關(guān)性分析并繪制熱圖。

2結(jié)果與分析

2.1施加不同形態(tài)氮肥對李氏禾生長的影響

如圖2（a）所示，施加不同形態(tài)氮肥對李氏禾各部位生物量均有顯著性提高，其中施加硫酸銨的李氏禾生物量最大，相比于對照，地上部生物量增加了1.98倍、根部干質(zhì)量增加了88.3% （Plt;0.05）。如圖2（b）所示，施加不同形態(tài)氮肥后李氏禾株高均有顯著增長。圖2（c）為施加不同形態(tài)氮肥對李氏禾葉綠素含量的影響，除了施加尿素外，施加其他形態(tài)氮肥的李氏禾的葉綠素含量比對照增加35%-50%，說明施加氮肥有利于提高葉綠素含量，促進李氏禾生長。2.2施加不同形態(tài)氮肥對李氏禾根系特征的影響

施加不同形態(tài)氮肥對李氏禾的根系特征影響不同。由圖3（a）可以看出，施加氮肥對李氏禾根系伸長均有促進作用，根長增長的大小順序為尿素gt;硝酸銨gt;硫酸銨gt;硝酸鈣gt;氯化銨gt;對照。如圖3（b）所示，施加硝酸鈣和硝酸銨的總根長有顯著增加，分別比對照增加22.0%和59.4%，根據(jù)根系掃描圖顯示，應(yīng)該是側(cè)根發(fā)育比較多，從而使總根長有顯著增加。如圖3（c）和圖3（d）所示，施加不同形態(tài)氮肥后，硝酸銨處理的李氏禾總根表面積和總根體積增長最顯著，總根表面積為對照的2.15倍，總根體積比對照增長99.5%。如圖3（e）所示，施加不同形態(tài)氮肥有利于李氏禾根平均直徑增大，其中施加硫酸銨比對照增長50%。如圖3（f）所示，與對照相比，除了施加氯化銨外，施加其他形態(tài)氮肥的李氏禾根系活力均有提高，其中施加硫酸銨的李氏禾根系活力最高，比對照增加1.08倍。

2.3施加硫酸銨和尿素對李氏禾葉片植物激素的影響

選取施加不同形態(tài)氮肥后生物量相差最大的硫酸銨和尿素處理，來測定李氏禾葉片中的植物激素。圖4為測定的6種植物激素的結(jié)果，其中硫酸銨的cZROG和iP7G高于尿素，且cZROG存在顯著差異，硫酸銨的IP、iP9G、tZOG均顯著低于尿素，而兩種氮肥的2MeScZR無顯著差異。綜上推測，cZROG和iP7G可能是調(diào)控李氏禾生長的關(guān)鍵植物激素，導(dǎo)致施加硫酸銨與尿素之間的李氏禾生物量差異顯著。

2.4施加不同形態(tài)氮肥對土壤鉻含量和形態(tài)及土壤pH的影響

施加不同形態(tài)氮肥種植李氏禾60 d后的土壤鉻含量如圖5（a）所示，與對照相比，施加氮肥種植李氏禾后的土壤鉻含量均有所降低。圖5（b）為種植后土壤鉻賦存形態(tài)占比變化，與對照相比，土壤鉻弱酸提取態(tài)、可還原態(tài)和可氧化態(tài)占比有所下降，土壤鉻殘渣態(tài)占比較高。如圖5（c）所示，與對照相比，施加硝酸鈣、氯化銨、硝酸銨、硫酸銨的土壤pH值均有所下降，只有施加尿素的土壤pH值顯著上升，與對照相比增長10.0%，

2.5施加不同形態(tài)氮肥對李氏禾鉻修復(fù)效率的影響

李氏禾鉻含量如圖6（a）所示，與對照相比，施加硝酸鈣、尿素、硝酸銨、硫酸銨的李氏禾葉鉻含量和根鉻含量均有顯著增加，地上部鉻含量分別比對照組增加10.3%、23.4%、18.7%、36.8%，說明施加氮肥有利于提高李氏禾對鉻的吸收。圖6（b）為李氏禾鉻累積量，施加不同形態(tài)氮肥有利于提高李氏禾鉻累積量，其中，施加硫酸銨的李氏禾鉻累積量最高，地上部和根鉻累積量分別達到941.4ug·pot-1和1239.3ug·pot-1。施加不同形態(tài)氮肥對李氏禾BCF均存在顯著性影響，如圖6（c）所示，與對照相比，氯化銨的BCF降低10.2%，硝酸鈣、尿素、硝酸銨、硫酸銨分別增加了16.6%、27.2%、22.2%、46.2%。土壤中鉻的去除率如圖6（d）所示，施加氮肥的李氏禾的土壤鉻去除率均有顯著性提高，為對照組的3.23-5.56倍。

2.6李氏禾生理機制和土壤參數(shù)與李氏禾鉻修復(fù)效率的相關(guān)性

采用Pearson相關(guān)分析評估各參數(shù)對李氏禾鉻修復(fù)效率的影響，結(jié)果如圖7所示。土壤鉻弱酸提取態(tài)、可還原態(tài)、可氧化態(tài)和土壤總鉻含量均與土壤鉻去除率存在顯著負(fù)相關(guān)。李氏禾株高、葉綠素含量、地上部干質(zhì)量、根干質(zhì)量、根平均直徑、總根表面積、總根體積、根系活力均與根鉻含量、地上部鉻累積量、根鉻累積量、土壤鉻去除率存在顯著正相關(guān)，其中，地上部干質(zhì)量、根平均直徑、根系活力還與李氏禾鉻含量、鉻累積量、富集系數(shù)、土壤鉻去除率存在極顯著相關(guān)性。殘渣態(tài)鉻和李氏禾總根長與李氏禾鉻修復(fù)效率均無顯著相關(guān)性。

3討論

3.1施加不同形態(tài)氮肥對李氏禾地上部生長和根系發(fā)育的影響

植物葉片光合作用是植物體內(nèi)能量傳遞和物質(zhì)累積的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，而氮直接參與了光合色素的合成。本試驗發(fā)現(xiàn)施加不同形態(tài)氮肥對李氏禾葉綠素含量影響存在差異（圖2），其中，施加銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的李氏禾葉綠素含量和生物量均高于酰胺氮，這可能是硝態(tài)氮和銨態(tài)氮可以被李氏禾直接吸收利用，而酰胺氮需要轉(zhuǎn)化為無機氮才能被李氏禾利用，導(dǎo)致李氏禾對氮肥吸收效率不同，影響了李氏禾葉綠素合成，對李氏禾生物量產(chǎn)生差異影響。植物內(nèi)源激素對植物的生長發(fā)育也有調(diào)控作用，李氏禾葉片植物激素含量結(jié)果表明（圖4），施加硫酸銨的李氏禾葉片cZ-ROG和iP7G高于施加尿素，這可能是因為調(diào)控李氏禾生長的關(guān)鍵植物激素是cZROG和iP7G，所以施加硫酸銨的李氏禾生物量顯著高于尿素。此外，本課題組研究還發(fā)現(xiàn)合理的刈割頻率、刈割高度和刈割時間也能提高李氏禾修復(fù)效率，刈割后的李氏禾再生有較大的氮需求。合理的施用硫酸銨可能加快李氏禾再生，兩者結(jié)合會進一步提高李氏禾對鉻污染的修復(fù)效率。

本試驗發(fā)現(xiàn)施加不同形態(tài)氮肥對李氏禾根系形態(tài)發(fā)育和根系活力影響不同（圖3），施加硝酸銨的總根長、根表面積和根體積最大，分別為557.89cm、131.47cm2和4.01cm3；施加硫酸銨的根直徑和根系活力最大，分別為0.75mm和0.08TTFmg·g-1·h-1。這與前人研究發(fā)現(xiàn)的硝態(tài)氮有利于植物根的伸長，銨態(tài)氮有利于根的加粗，銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的聯(lián)用會促進植物側(cè)根發(fā)育和根伸長的結(jié)果相似。

3.2施加不同形態(tài)氮肥對李氏禾鉻富集能力的影響

植物主要通過根部吸收重金屬，所以根系形態(tài)的變化會影響植物吸收重金屬的能力。本試驗中施加不同形態(tài)氮肥下李氏禾根系形態(tài)有所改變，從而影響了李氏禾對鉻的吸收，其中，施加硫酸銨的李氏禾鉻含量最高，地上部和根部分別為205.9mg·kg-1和514.3mg·kg-1。值得注意的是，通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)（圖7）：與李氏禾總根表面積和總根體積相比，根平均直徑與李氏禾鉻含量相關(guān)性更強，這可能是因為植物根平均直徑相較于總根表面積對土壤孔隙度的影響更大，根平均直徑越大所產(chǎn)生的孔隙越大，從而更有利于土壤鉻的遷移轉(zhuǎn)化，提高李氏禾對鉻的吸收。此外，植物對土壤中重金屬的吸收與土壤中重金屬的生物有效性有關(guān)，提高重金屬活性可以促進超富集植物對重金屬的吸收，提高植物累積量，這是植物修復(fù)發(fā)展的一個新方向。重金屬的弱酸提取態(tài)和可還原態(tài)易被植物吸收，可氧化態(tài)和殘渣態(tài)較穩(wěn)定，但可氧化態(tài)在酸性條件下可以被還原，且還原后更有利于植物吸收。本試驗中，與對照相比，施加不同形態(tài)氮肥種植李氏禾后的土壤鉻弱酸提取態(tài)、可還原態(tài)和可氧化態(tài)含量顯著下降（圖5），這可能是施肥后土壤中鉻活性提高，李氏禾對鉻吸收有所增加。綜上，植物重金屬含量和土壤重金屬含量會影響植物富集能力，施加不同形態(tài)氮肥提高李氏禾鉻含量和土壤鉻去除率后，有利于提高李氏禾的富集系數(shù)，其中施加硫酸銨的李氏禾富集系數(shù)最高，為對照的1.45倍。富集系數(shù)的提高意味著相同質(zhì)量的李氏禾可以富集更多土壤中的鉻，使李氏禾土壤鉻修復(fù)效率得到提高。

4結(jié)論

（1）施加不同形態(tài)氮肥有利于促進李氏禾生長，提高葉綠素含量、生物量和根系活力，并改變其根系形態(tài)指標(biāo)。

（2）施加不同形態(tài)氮肥對土壤鉻賦存形態(tài)、李氏禾根系形態(tài)和根系活力的改變有利于提高李氏禾鉻吸收量和土壤中鉻去除率。其中，施加硫酸銨的李氏禾修復(fù)效果最顯著，其富集系數(shù)較對照組提高47.9%，土壤鉻去除率為對照的5.56倍。