摘要：本研究以當陽鳳凰山長期定位施肥柑橘試驗基地為平臺，進行了自然生草（NG）、人工種植光葉苕子（LP）以及光葉苕子混播于自然生草（NL）等三種綠肥處理，通過植物群落調(diào)查、土壤理化性質(zhì)測定，以及qPCR和Illumina Miseq高通量測序的方法，闡明橘園土壤氨氧化微生物AOA和AOB的功能基因豐度和群落結(jié)構對不同綠肥種植處理的響應特征，并探討植物群落和土壤理化因子對它們的影響。研究結(jié)果表明：相比于NG，人工種植綠肥（LP和NL）對AOA和AOB數(shù)量的影響不一，LP降低了AOA和AOB的amoA基因拷貝數(shù)，NL降低了AOA-amoA但增加了AOB-amoA基因拷貝數(shù)；LP和NL中AOA的Ace指數(shù)和Chao指數(shù)顯著高于NG，LP中AOB的Shannon指數(shù)顯著高于NG，三個處理的B多樣性差異顯著；三種綠肥種植處理下AOA共獲得119個OTU，優(yōu)勢門和屬分別是泉古菌門和norank-Crenarchaeota，其中norank-Crenarchaeota在NG中的相對豐度顯著高于LP和NL；AOB共獲得142個OTU，優(yōu)勢門和屬分別是變形菌門和亞硝化螺菌屬，其中亞硝化螺菌屬的相對豐度在不同處理中有顯著差異，其LP中最高，為45.87％；Mantel檢驗和冗余一層次分割分析結(jié)果表明，氨氧化微生物的豐度、多樣性和組成受到綠肥種植后的植物因子（如群落高度、蓋度、多樣性、地上生物量和地下生物量、根系碳氮含量等）和土壤因子（如pH、土壤含水量、總碳、總氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和速效磷含量等）的共同影響。該研究說明在橘園種植綠肥可改變地上植物群落特征和土壤理化性質(zhì)，從而使土壤中氨氧化微生物的數(shù)量和群落結(jié)構發(fā)生變化，其中光葉苕子混播于自然生草的生草模式可明顯增加土壤氨氧化微生物量，促進土壤的硝化作用和改善果園生態(tài)環(huán)境，因此，實際應用中可優(yōu)先考慮此模式。

關鍵詞：氨氧化微生物；綠肥；功能基因；群落組成；豐度

中圖分類號：S666；S154.3 文獻標志碼：A 文章編號：1672-2043（2024）01-0122-11 doi：10.11654/jaes.2023-0446

隨著社會的不斷進步，生態(tài)果園等可持續(xù)發(fā)展理念深入人心，人們逐漸認識到清耕法不再適合農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的要求，果園覆草、果樹地膜覆蓋和果園綠肥種植等一些先進的果園管理模式開始在果園中發(fā)揮作用。在果園生境下生長，通過直接種植、翻壓施用、作物堆肥漚制后再施用等方式促進果樹生長發(fā)育的綠色植物稱為果園綠肥。果園綠肥種植可分為自然生草和人工生草，其中，自然生草是指利用當?shù)毓麍@常見雜草，經(jīng)過自然競爭和連續(xù)刈割，自然篩選出適宜當?shù)刈匀簧鷳B(tài)環(huán)境且生殖能力強的無害雜草，生長后達到覆蓋培肥果園的目的，人工生草是考慮到當?shù)毓麡淦贩N性質(zhì)、土壤、氣候條件和經(jīng)濟生態(tài)等因素后，有選擇地種植一些無害、培肥能力強或經(jīng)濟效益高的草種。果園自然生草和人工生草在改善果園生態(tài)環(huán)境，促進果實優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)等方面都已經(jīng)取得了良好的生態(tài)經(jīng)濟效益。

微生物介導的硝化作用是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)的關鍵環(huán)節(jié)之一，通過硝化作用能減少土壤氨的揮發(fā)，促進植物對土壤氮素的吸收利用。氨氧化反應是硝化作用的關鍵限速步驟，氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細菌（AOB）作為氨氧化反應的主要驅(qū)動者，其群落結(jié)構、生態(tài)位分異和豐度等受土壤環(huán)境因子的影響。在不同pH的土壤中，AOA和AOB對土壤硝化作用的貢獻存在極大差異，AOA在酸性土壤中更為活躍，AOB在中性和堿性土壤中是硝化作用的主要承擔者。施肥方式不同，植被類型的改變均會導致氨氧化微生物種群結(jié)構、豐度和活性發(fā)生差異。在果園生態(tài)系統(tǒng)中，不同的土壤類型、土壤條件、耕作制度等果園管理措施等都會影響土壤環(huán)境，從而影響土壤的硝化能力和氨氧化微生物的活性。果園生草復合系統(tǒng)會改變植物-微生物的資源利用體系，勢必會影響土壤氮素養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和供給情況，從而使得土壤微生物生長所需的養(yǎng)分物質(zhì)數(shù)量和質(zhì)量發(fā)生改變。研究表明，有機肥可以通過改變土壤理化性質(zhì)從而降低鹽分產(chǎn)生的負面影響。綠肥種植、刈割、腐解還可以通過影響土壤的各項理化性質(zhì)，如土壤溫度、土壤板結(jié)程度、土壤pH等，引起土壤微環(huán)境的變化，間接對土壤微生物群落產(chǎn)生影響。但果園綠肥種植后對土壤氨氧化微生物AOA和AOB的影響研究鮮見報道。識別氨氧化微生物群落在果園不同生草系統(tǒng)中的生態(tài)特征，對于豐富氮循環(huán)的認識以及果園生草管理具有重要意義。

本研究以湖北省當陽市長期定位施肥柑橘試驗基地為研究對象，選取了自然生草、光葉苕子（Vicia villosa var.glabrescens）以及光葉苕子混播自然生草等3種綠肥處理，通過對柑橘園0-20 cm耕作層土壤中土壤理化性質(zhì)、氨氧化微生物功能基因豐度及群落結(jié)構等進行分析，探究不同綠肥種植對橘園土壤氨氧化微生物的影響，從而為果園的生態(tài)管理方式方法提供一定參考。

1材料與方法

1.1試驗設計

試驗在湖北省宜昌市當陽市鳳凰山柑橘基地（30°39′48.98″N，111°48′24.82″E）進行。該地屬亞熱帶季風氣候，平均日照數(shù)1 850 h，年均氣溫16.4℃，年均降雨量936-1 048 mm，降雨多集中于夏季。試驗地海拔79 m，土壤類型為典型黃棕壤；柑橘品種為無核椪柑，樹齡15 a，行距3 mx4 m，樹勢中等，均處于盛果期。每年6月和12月施肥，施肥量為氮素410 kg·hm-2，磷素240 kg·hm-2，鉀素381 kg·hm-2，肥料分別為尿素、過磷酸鈣和硫酸鉀。該柑橘園綠肥有3種生草方式：（1）自然生草（NG）：園內(nèi)沒有種植特定草種，自然長出的各種雜草通過自然競爭和連續(xù)刈割，最后剩下適應當?shù)刈匀簧鷳B(tài)環(huán)境的草種；每年5月和9月刈割，刈割后平鋪覆蓋果園地面；（2）光葉苕子（LP）：清除自然生草后，于每年10月在果樹行間撒播光葉苕子，播種量為75 kg·hm-2，次年5月刈割，刈割后綠肥殘體直接覆蓋地面還田；（3）光葉苕子混播于自然生草中（NL）：保留自然生草，并在果樹行間撒播光葉苕子，播種量為25 kg·hm-2，于每年5月刈割，刈割后綠肥殘體直接覆蓋地面還田。與自然生草相對應，以上的LP和NL又歸為人工生草。所有生草處理于2013年開始實施。

1.2樣品采集及測定

3種生草方式分別選擇3個面積為120 m2重復小區(qū)（含10棵果樹），于2019年3月（光葉苕子初花期）在每個小區(qū)采用五點取樣法對5個1 mx1 m樣方進行植物群落調(diào)查，測定草本植物群落的蓋度（Cover）、高度（Height）和各物種的個體數(shù)量等。隨后，齊地剪取樣方中植物地上部分，烘干稱量獲取地上生物量（SB）。用直徑為7.5 cm的根鉆在樣方內(nèi)以五點取樣法鉆取0-20 cm耕層土壤根系樣品5份，混勻后裝自封袋內(nèi)，帶回實驗室過20目篩分離植物根系及土壤。用去離子水洗凈植物根系，于105℃殺青30 min，隨后調(diào)至65℃烘干至質(zhì)量恒定并稱量，以獲得地下生物量（RB）。利用粉碎機將烘干后的植物地上部分和地下部分分別磨碎、過100目篩。采用元素分析儀測定植物地上部分（STC、STN）和根系的總碳、總氮（RTC、RTN）含量。

土壤樣品采集：用土鉆采集上述樣方中0-20 cm土層，混勻后分為三部分。一部分新鮮土樣用于以下指標測定：土壤容重（BD）（環(huán)刀法）、含水量（SWC）（鋁盒烘干法）、pH[玻璃電極法（水土比2.5：1）]、銨態(tài)氮（AN）（靛酚藍比色法）、硝態(tài)氮（NN）（紫外分光光度法）、可溶性有機碳（DOC）『總有機碳分析儀測定離心（水土比5：1）過濾后的濾液]、可溶性有機氮（DON）[可溶性總氮（TDN）減去AN、NN氮的差]、TDN（堿性過硫酸鉀-紫外分光光度法）、土壤微生物量碳氮（MBC、MBN）（氯仿熏蒸-硫酸鉀浸提法）；一部分樣品自然風干后，仔細挑除土壤中混入的植物殘根和石塊等雜物，磨碎，采用碳氮元素分析儀測定總碳（TC）和總氮（TN），采用濃硫酸消解-鉬娣抗比色法測定總磷（TP），通過0.5 mol·L-1碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定速效磷（AP），用濃硫酸消煮-原子吸收火焰光度法測定全鉀（AK）；一部分土壤于無菌密封袋中保存，放入液氮內(nèi)冰凍3 mm再放置于冰盒帶回實驗室，轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱中保存，用于后續(xù)微生物分析。

根據(jù)PowerSoil DNA isolation試劑盒（MoBio Lab-oratories Inc.San Diego，CA，USA）操作步驟，從0.5 g、-80℃土壤中提取土壤總DNA，并用酶標儀檢測土壤DNA數(shù)量和質(zhì)量；使用2％的瓊脂糖凝膠電泳的方法測定土壤DNA的完整性。

AOA單端序列分析中兩種引物分別為amoAF（5’-STAATGGTCTGGCTTAGACG-3’）和amoAR（5’-GCGGCCATCCATCTGTATGT-3’），PCR產(chǎn)物長度在600 bp左右；AOB單端序列分析中兩種引物分別為bamoAIF（5’-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3’）和bamoA2R（5’- CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3’）.PCR產(chǎn)物長度490 bp左右。采用SYBR Green法進行熒光定量PCR測定AOA和AOB的amoA基因豐度：使用上述引物以及實時熒光定量PCR儀（CFX96，bio-rad，USA）對AOA和AOB的amoA基因進行擴增，反應體系和反應程序見表1。擴增完成后，取3uL AOA和AOB amoA的PCR擴增產(chǎn)物，用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測其大小和質(zhì)量。定量PCR以包含目的基因且拷貝數(shù)已知的質(zhì)粒為標準模板，按10倍梯度稀釋制作標準曲線，標準模板和待測樣品均設3個重復，以3個重復的均值作為最終結(jié)果，PCR的效率為84.5％-87.3％，R2為0.991-0.997.

微生物的Illumina Miseq高通量測序：對氨氧化微生物的AOA和AOB amoA基因的PCR擴增產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳鑒定和分離條帶后再使用試劑盒NanoDrop2000 （NanoDrop Technologies，Wilming-ton，USA）進行膠純化和檢測定量。稀釋至同一濃度后，采用上海美吉生物Illumina Miseq測序儀對AOA和AOB amoA進行雙末端（paired-end）測序。測序序列根據(jù)overlap關系采用Flash 1.2.1軟件進行pair-end雙端序列拼接，隨后用QIIME 1.9.1軟件對不同樣本的測序的原始序列進行質(zhì)控篩選和嵌合體檢驗，去除掉小于50 bp和出現(xiàn)錯誤的序列，使用UCHIME進行降噪和嵌合體清除。9個樣本分別獲得415 425條AOA和422 813條AOB amoA基因的優(yōu)化序列。利用USEARCH11軟件的Uparse算法在97％的相似度下對操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTU）的代表序列進行聚類分析。采用RDP classifier 2.1貝葉斯算法在功能基因組資源數(shù)據(jù)庫（Func-tional Genomics Resources，F(xiàn)GR）中對97％相似水平的AOA和AOB amoA基因的OTU代表序列進行分類學注釋。利用Mothur 1.30.2按最小樣本序列數(shù)對各樣本進行抽平分析后，各樣本分別得到29 640條AOA amoA基因序列和30 417條AOB amoA序列。

1.3數(shù)據(jù)分析

植物的群落多樣性利用豐富度指數(shù)（Rp）、Shan-non-Wiener多樣性指數(shù)（Sp）和均勻度Pielou指數(shù)（Ep）等進行測度。計算公式如下：

在OTU水平上，土壤氨氧化微生物群落的a多樣性使用Chao、Ace、Simpson和Shannon指數(shù)進行評估，利用Mothur 1.30.2進行這些a多樣性指數(shù)的計算；利用非度量多維尺度（Non-metric Multidimensional scaling，NMDS）分析不同處理間氨氧化微生物的B多樣性，其對不同樣本間的差異程度，是通過點與點間的距離體現(xiàn)的，最終可獲得樣本的空間定位點圖。韋恩分析（Venn）用于統(tǒng)計不同處理間樣本中共有和獨有的OTU數(shù)目；分別在門（phylum）和屬（genus）分類水平上統(tǒng)計各樣本的群落組成。

不同處理間的土壤氨氧化微生物的基因拷貝數(shù)、a多樣性、門和屬相對豐度的差異性均在SPSS中采用One-way ANOVA方法進行分析。不同處理組間的B多樣性差異程度是否顯著通過PERMANOVA分析實現(xiàn)；通過Mantel檢驗分析確定植物和土壤因素對氨氧化微生物基因豐度、多樣性和群落組成的影響；冗余分析-層次分割法（RDA-HP）將層次分割法（hierar-chical partitioning，HP）引入到冗余分析（redundant analysis，RDA）中，可以為各解釋變量分配單獨效應，并為共線性解釋變量的相對重要性提供定量指標，用來確定環(huán)境因子對氨氧化微生物群落結(jié)構的影響及貢獻率。使用R 4.2.2軟件進行Mantel檢驗（linkET包）、Venn（ VennDiagram包）、NMDS（vegen包）和RDA-HP（rdacca.hp包）分析。

2結(jié)果與分析

2.1綠肥種植對氨氧化微生物豐度的影響

不同綠肥種植模式下土壤氨氧化微生物的AOA-amoA和AOB-am，oA基因拷貝數(shù)的變化如圖1所示，NG、LP、NL的AOA-amoA拷貝數(shù)分別為2.40x10、1.42x10、1.20x10 copies·g-1干土；與NG相比，人工生草的兩種處理均有顯著性變化，LP和NL顯著降低了土壤AOA的豐度（Plt;0.05），而LP和NL兩種人工生草之間AOA的豐度無顯著性差異。NG、LP、NL的AOB-amoA拷貝數(shù)分別為1.28×10、0.82×10、4.63x10 copies·g-1干土；與NG相比，AOB豐度在LP中顯著下降，而在NL中顯著增加。兩種氨氧化微生物總的豐度則表現(xiàn)為NLgt;NGgt;LP，且不同處理間差異顯著，這說明生草種類的不同會顯著影響土壤氨氧化微生物AOA和AOB的數(shù)量。

2.2綠肥種植對氨氧化微生物多樣性的影響

不同綠肥種植下土壤氨氧化微生物群落的a多樣性結(jié)果顯示，自然生草NG處理下AOA的Ace（85.60）、Chao（79.63）和Simpson（0.39）指數(shù)均較高，其中Ace和Chao指數(shù)顯著高于人工生草LP和NL（Plt;0.05，表2），但三種處理間的Simpson和Shannon指數(shù)均沒有顯著差異。AOB的Ace（60.14）和Chao（55.75）指數(shù)在NL中較高，但不同處理間無顯著差異；Shan-non指數(shù)在LP中最高（2.33），且顯著高于NG，但Simpson指數(shù)（1.76）顯著低于NG（Plt;0.05，表2）。

基于NMDS分析，當stresslt;0.1時，可認為是一個好的排序，當stresslt;0.05時，則排序具有很好的代表性，因此在NG、LP和NL組間樣本中的AOA和AOB在NMDS1、NMDS2的方向上都較好地區(qū)分開來，具有較高的B多樣性（圖2）。AOA的Stress為0.01，且PERMANOVA分析的P=0.005，表明不同綠肥種植處理的AOA群落組間區(qū)分度較高，對其B多樣性的影響顯著。同時，AOB的Stress為0.052，三種綠肥處理位于NMDS排序軸的不同象限（圖2 AOB），且PER-MANOVA分析的P=0.005，組間也能很好地區(qū)分開來，說明不同綠肥種植對土壤AOB群落B多樣性的影響也較為顯著。

2.3橘園綠肥種植對氨氧化微生物群落組成的影響

不同綠肥種植處理下AOA-amoA基因共獲得119個OTU，三個處理共有的OTU數(shù)目為26個，占總OTU數(shù)目的21.85％，特有的OTU數(shù)目表現(xiàn)為NGgt;LPgt;NL（圖3 AOA）。AOA分類出的門主要有泉古菌門（Crenarchaeota）、奇古菌門（Thaumarchaea）和norank-Archaea，其中泉古菌門在橘園土壤中的相對豐度最高（圖4），為55.32％-83.22％，但不同處理之間無顯著性差異（Pgt;0.05）；奇古菌門在LP中的相對豐度顯著高于其他處理。AOA分類出的屬主要有norank-Crenarchaeota、亞硝化球菌屬（Nitrososphaera）和norank-Thaumarchaeota，其中norank-Crenarchaeota優(yōu)勢明顯，在NG、LP和NL三個處理中的相對豐度分別為83.22％、71.18％和55.32％，且NG中顯著高于LP、NL；奇古菌門的亞硝化球菌屬在LP中的相對豐度顯著高于其他處理。

不同綠肥種植處理下AOB-amoA基因共獲得142個OTU，共有的OTU數(shù)目為17個，占總OTU數(shù)目的11.97％，特有的OTU數(shù)目表現(xiàn)為NGgt;NLgt;LP（圖3AOB）。AOB的優(yōu)勢門是變形菌門（Proteobacteria），其在NG、LP和NL中的相對豐度分別為68.28％、90.74％和79.36％（圖4），各處理間無顯著差異（Pgt;0.05）。AOB分類出的屬主要有亞硝化螺菌屬（Nitro-sospira）、亞硝化弧菌屬（Nitrosovibrio）、亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas），其中亞硝化螺菌屬為優(yōu)勢屬，其在NG和LP中相對豐度分別為21.2％和45.87％，但在NL中僅有7％，顯著低于NG和LP（圖4）?？梢?，不同種綠肥處理均對土壤氨氧化微生物群落組成有顯著影響，但不同種綠肥種植對不同的特定菌屬影響差異較大。

2.4影響橘園土壤氨氧化微生物群落變化的主要因素

將不同綠肥種植下土壤氨氧化微生物的豐度和多樣性指數(shù)數(shù)與各項植物和土壤因子進行Mantel test分析，結(jié)果如圖5所示。AOA-amoA基因豐度與Cov-er、Height、Rp、SB、RB、RTN、TC、TN等極顯著相關（Plt;0.01），與Sp、Ep、RTN、AP、AK、MBC等顯著相關（Plt;0.05）；AOA的多樣性指數(shù)與諸多植物因子，如Cover、Height、Rp、Sp、Ep、SB、RB、RTC、RTN等，土壤因子如SWC、TC、TN、AP等顯著相關（Plt;0.05）；AOA的群落組成（門和屬）與Height、STN、TC、TN、NN等顯著相關（Plt;0.05）。AOB-amoA基因豐度與Height、Rp、RB、RTC、RTN、pH、TC、TN、NN、AP等顯著相關（Plt;0.05）；AOB的多樣性指數(shù)與土壤BD顯著相關（Plt;0.05）；AOB的群落組成（門和屬）與植物群落的Ep、土壤的pH，DOC、AN、TP和AK呈顯著相關關系（Plt;0.05）。

從圖5中還可看出環(huán)境因子的相關關系：植物因子，如Cover或Height與植物群落的植物生物量（SB、RB）顯著正相關，Cover與植物多樣性指數(shù)顯著負相關，植物生物量與其碳氮含量（如RTC、RTN）亦相關性明顯。此外，土壤因子如pH與氮磷含量（如AN、NN、AP）相關性顯著（Plt;0.05）。

RDA-HP分別分析了氨氧化微生物AOA和AOB群落分布與植物和土壤因子的關系，由于RDA對環(huán)境因子數(shù)量的限制性，結(jié)合Mantel test分析進行篩選因子后，針對AOA和AOB群落的RDA模型均具有顯著性（Plt;0.05）。在分析影響AOA群落結(jié)構的RDA模型中，有Height、RB、swc、pH、AN、TC、TN和NN等7個因子進入RDA-HP分析中，這些因子的總貢獻率達99.3％，其中前兩軸（RDA1和RDA2）的貢獻率就達到了93.7％（圖6 AOA）。這些因子中，SWC、pH和TN對AOA的分布和數(shù)量均具有顯著性影響（Plt;0.05），其貢獻率均超過17％；Thaumarchaeota、Nitrososphaera主要受pH和NN的影響norank-Thaumarchaeota受TN和SWC影響較大，而norank-Archaea主要受TC和RB的影響。Ep、RB、pH、AN、NN和AP等6個因子進入影響AOA群落結(jié)構的RDA-HP模型中，總貢獻率達98.6％，其中，AP、NN和pH對AOB的分布和數(shù)量具有顯著影響（Plt;0.05），貢獻率分別為26.95％、24.75％和21.22％；Proteobacteria和Nitrosospira受pH和AP的影響較大，RB、Ep和AN對Nitrosovibrio的分布起主要作用。

3討論

3.1種植綠肥種類對氨氧化微生物的影響

綠肥種植對于微生物多樣性的影響依賴于植物凋落腐解物質(zhì)的數(shù)量和質(zhì)量、環(huán)境條件、土壤特性和植物類型的綜合作用。不同植物種類會通過其有機質(zhì)的輸入、對硝化潛勢和土壤環(huán)境因子的影響，改變氨氧化微生物的多樣性和群落組成。不同綠肥種類的種植也導致了植物輸入不同，其對土壤養(yǎng)分的影響不同，從而對AOA和AOB的豐度產(chǎn)生不同影響。本研究中，含豆科綠肥的種植顯著增加了植物的高度和地上及地下植物生物量，且土壤TC、TN含量顯著高于NG。NL中，除了豆科綠肥外，還有多種自然生草的存在，植物群落物種多樣性和生物量高，增加了有機質(zhì)向土壤的輸入，從而使得其氨氧化微生物的豐度較高。此外，NL含有豆科綠肥，其自身氮含量充足，較其他植物種類的氮含量高（如STN和RTN），刈割還田后提供了土壤更多的有效態(tài)氮，底物充足是影響AOA和AOB數(shù)量和多樣性的一個關鍵因素。豆科綠肥的根系分泌物和根瘤也會對微生物產(chǎn)生一定的影響，它們自身的固氮作用會導致吸收土壤中速效的銨態(tài)氮減少，并向土壤中釋放更穩(wěn)定的有機氮素，因此，豆科綠肥對土壤氨氧化微生物作用的影響不同于其他有機肥和無機氮肥。

3.2影響氨氧化微生物的植物和土壤因素

果園綠肥種植能有效改善園區(qū)地溫和氣溫，提高土壤保水能力，改善土壤理化性質(zhì)，影響土壤微生物的生長條件。氨氧化微生物AOA和AOB有著不同的生態(tài)位，環(huán)境因子的變化，如植被、pH、有機質(zhì)含量、AN的可利用性等對不同氨氧化微生物類群有特異的選擇性。本研究中，影響AOA和AOB群落組成、豐度和多樣性的植物因素主要有植物群落的蓋度、高度、物種多樣性、地上生物量和地下生物量、植株的碳氮含量等，這些植物因素均會顯著影響凋落腐解物質(zhì)的數(shù)量和質(zhì)量、根系分泌物的種類和含量，從而影響向土壤中輸入的碳源和氮源，進而改變AOA和AOB的類群和數(shù)量。

在土壤因素中，有研究表明，當pHlt;6.2，NH3會轉(zhuǎn)化成NH-N，導致反應底物減少，AOB類微生物的代謝活性會降低，生長會受到抑制。試驗柑橘園地處湖北宜昌，試驗前長期過量施肥，土壤酸化較嚴重，本研究中土壤pH值為5.63-6.66，其中NG和LP處理的土壤pH低于6，AOA占優(yōu)勢，這與其他研究中的酸性土壤中AOA占優(yōu)勢地位的研究結(jié)果一致，而NL處理的pH超過6.2，AOB則成為了優(yōu)勢菌群。另外，大量研究證明，氨氧化微生物的群落結(jié)構與土壤理化性質(zhì)直接相關，AOA和AOB的amoA基因?qū)κ┓实拳h(huán)境因子較其他功能基因更具敏感性。相對于AOB，AOA偏向于含氧量較低的環(huán)境，并對土壤板結(jié)的環(huán)境有更強的適應性，因此AOA比AOB可能更適應于受人為干擾較大的橘園土壤環(huán)境。此外，SWC會通過影響土壤的通氣性，改變有機氮的礦化強度，影響反應底物含量來影響土壤硝化作用；TP或AP是評價土壤肥力的重要指標，會對氨氧化微生物的豐度產(chǎn)生影響；AN是橘園土壤有效態(tài)氮的主要類型，在氨氧化過程中作為底物會被氨氧化微生物消耗一部分，而NN作為硝化作用的主要產(chǎn)物，含量會隨著硝化作用的增強而增加；這些因素都對AOA或AOB的豐度和群落結(jié)構產(chǎn)生了影響。

盡管不同綠肥種植處理間土壤氨氧化微生物的a多樣性僅部分指數(shù)表現(xiàn)出顯著性差異，但總體上AOA的多樣性要高于AOB，這是因為AOB主要集中在Nitrosospira、Nitrosovibrio、Nitrosomon，a等幾個屬，而AOA的多樣性和棲居范圍都會勝于AOB。AOA的amoA基因豐度和多樣性指數(shù)與植物群落的高度、蓋度、生物量，以及土壤SWC、TC、TN等密切相關，主要門屬的分布受SWC、pH和TN的顯著影響（合計貢獻率gt;50％）；而AOB的amoA基因豐度和多樣性指數(shù)與植物群落的高度、生物量以及土壤的pH、TC、NN和AP等顯著相關，主要門屬分布受pH、NN和AP的顯著影響（合計貢獻率gt;70％）。這些結(jié)果表明，植物和土壤因素共同影響著氨氧化微生物AOA和AOB的種類和分布，且土壤因素比植物因素的貢獻更大。本研究中，不同綠肥種植的橘園土壤中AOA的優(yōu)勢菌屬有Nitrososphaera，AOB的優(yōu)勢菌為Nitrosospira，這與很多土壤環(huán)境中相似，如Nitrososphaera是高氮環(huán)境中AOA的優(yōu)勢菌屬，在相對低氮的環(huán)境中AOB的優(yōu)勢菌屬為Nitrosospira。作為AOA和AOB的優(yōu)勢菌，Nitrososphaera和Nitrosospira的分布與AOA和AOB的群落結(jié)構分布有一致的規(guī)律。本研究中，這兩類菌屬均偏好AN和AP較高的環(huán)境，說明養(yǎng)分較高的環(huán)境更適合它們生長。

4結(jié)論

（1）相比于自然生草，人工種植綠肥的AOA數(shù)量均顯著降低，但光葉苕子混播于自然生草的模式極大增加了AOB數(shù)量，從而使得該處理中氨氧化微生物的豐度顯著高于自然生草或單獨種植光葉苕子處理。

（2）3種綠肥種植對氨氧化微生物群落的a多樣性影響較小，但B多樣性差異明顯；AOA多樣性與植物的蓋度、高度、物種多樣性、地上生物量和地下生物量、根系碳氮含量，以及土壤的含水量、總碳含量和總氮含量、速效磷含量等顯著相關，AOB多樣性與土壤容重顯著相關。

（3）3種綠肥種植處理下AOA的優(yōu)勢門和屬分別是泉古菌門和norank-Crenarchaeota，土壤含水量、pH和總氮含量對AOA主要類群的分布和數(shù)量具有顯著性影響；AOB的優(yōu)勢門和屬分別是變形菌門和亞硝化螺菌屬，其中亞硝化螺菌屬的相對豐度在不同處理中有顯著差異；土壤速效磷、硝態(tài)氮含量和pH對AOB主要類群的分布和數(shù)量具有顯著影響。

（4）果園種植綠肥可改變土壤理化性質(zhì)從而使土壤中氨氧化微生物的數(shù)量和種類發(fā)生變化，保留行間自然生草，并于其中種植豆科綠肥可以促進土壤硝化作用和改善果園牛態(tài)環(huán)境。