摘要：為解決IHSS（國際腐植酸協(xié)會）推薦法提取剩余污泥腐植酸參數(shù)不明確和剩余污泥腐植酸提取研究中缺乏其毒性效應(yīng)評價等問題，利用響應(yīng)曲面法得到剩余污泥腐植酸提取的最佳條件，并分析了腐植酸理化特性及其對作物幼苗建成的影響。結(jié)果表明，腐植酸提取的最佳條件：堿濃度為0.19 mol·L-1，堿泥比（mL；g）為11.6，振蕩時間為3.8h，提取量為96.1 mg·g-1。相較于推薦法的腐植酸提取量增加了118％。提取所得腐植酸的元素分析顯示，0/C為0.84，H/C為0.14，C/N為4.43；傅里葉變換紅外光譜和凝膠滲透色譜分析顯示，剩余污泥腐植酸存在羧基、醇羥基和酚羥基等含氧官能團，重均分子量為8 856 Da。此外，在500 mg·L-1施用條件下，該腐植酸對大白菜和蘿卜種子發(fā)芽率和子葉光合色素含量均無顯著影響，而對大白菜種子胚根伸長具有顯著促進作用。綜上，通過優(yōu)化提取條件可顯著提高腐植酸提取量，剩余污泥腐植酸腐殖化程度與芳香化程度均較高，分子量較小，生物活性較強，且低濃度下對作物早期生長無不良影響。

關(guān)鍵詞：剩余褥泥腐植酸；提取條件；幼苗建成；種子發(fā)芽；子葉光合色素

中圖分類號：X703；S634.1；S631.1 文獻標志碼：A 文章編號：1672-2043（2024）02-0426-08 doi：10.11654/jaes.2023-0855

隨著我國城鎮(zhèn)化的快速發(fā)展，生活污水處理規(guī)模不斷擴大，導(dǎo)致大量剩余污泥產(chǎn)生。據(jù)統(tǒng)計，截止到2020年，我國每年產(chǎn)生的剩余污泥量已超過6 000萬m3。2021年6月國家發(fā)展改革委與其他部門聯(lián)合編制了《“十四五”城鎮(zhèn)污水及資源化利用發(fā)展規(guī)劃》，該規(guī)劃提出到2025年，城鎮(zhèn)污泥資源化利用水平進一步提升，要求在實現(xiàn)穩(wěn)定化和無害化的前提下，穩(wěn)步推進污泥資源化利用。

剩余污泥富集了大量有機物，以腐植酸為例，其含量一般占污泥有機物含量的10％-20％，具有良好的資源屬性。腐植酸含有羧基、酚羥基、羰基和甲氧基等含氧官能團，生物活性較強，具有促進植物根系生長以及促進植物吸收養(yǎng)分等作用，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用頗廣。目前，國內(nèi)外對剩余污泥腐植酸的提取多采用國際腐植酸協(xié)會（IHSS）推薦法，但此法僅適用于土壤腐植酸的提取。由于不同來源腐植酸的結(jié)構(gòu)、組成以及元素含量不同，因此，亟待對其提取條件進行優(yōu)化。

由于污泥成分復(fù)雜，含有重金屬等有害物質(zhì)，所以也具有一定的“污染”屬性。但已有的剩余污泥提取腐植酸研究中缺乏對其毒性效應(yīng)的綜合評價。幼苗建成（seedling establishment）是指從種子發(fā)芽開始，幼苗依賴種子貯藏物質(zhì)進行異養(yǎng)生長，當其子葉獲得光合能力，進行自養(yǎng)生長時完成的早期生長階段。通常，利用種子發(fā)芽試驗可快速評價某一物質(zhì)的植物毒性，但只反映了其對植物地下部生長的影響。然而，在種子發(fā)芽的基礎(chǔ)上，通過觀察和分析幼苗建成后期子葉的轉(zhuǎn)綠情況，可較為全面地評價某一物質(zhì)對植物地上部生長的影響，即通過幼苗建成試驗可較為全面地評價物質(zhì)的毒性效應(yīng)。目前，幼苗建成試驗在評價抗生素植物毒性、稀土元素對植物早期生長的影響和畜禽糞便堆肥產(chǎn)品腐熟度方面得到應(yīng)用。因此，利用幼苗建成試驗可較為快速且全面地評價剩余污泥腐植酸對植物早期生長的影響，為其安全利用提供數(shù)據(jù)支撐。

本研究綜合考慮提取條件中各因素對腐植酸提取量的影響，參考IHSS推薦法并利用Box-Behnken法設(shè)計試驗，確定剩余污泥腐植酸的最佳提取條件。此外，對提取所得腐植酸進行了理化特性研究，利用植物毒性測試中常用作物大白菜和蘿卜的幼苗建成試驗，以種子相對發(fā)芽率、胚根相對長度和子葉相對光合色素含量為評價指標，對其生物效應(yīng)進行了快速且全面的評價。本研究可為剩余污泥腐植酸的提取和應(yīng)用提供參考。

1材料與方法

1.1剩余污泥來源與性質(zhì)

本研究使用的剩余污泥樣品采集于山西省太原市某污水處理廠，于4℃條件下保存待用。剩余污泥含水率為80.5％±0.2％，pH為7.7±0.1，總固體（TS）為（195±2）mg·L-1，可溶性化學(xué)需氧量（SCOD）為（4 689±13）mg·L-1，總化學(xué)需氧量（TCOD）為（67 678±1 142）mg·L-1，揮發(fā)性固體（VS）為50.9％±0.3％，總腐植酸含量為17.0％±0.7％。

1.2試驗方法

1.2.1響應(yīng)曲面試驗設(shè)計

剩余污泥經(jīng)表面活性劑聯(lián)合超聲波預(yù)處理后進行腐植酸提取試驗。參考IHSS推薦法，將預(yù)處理后的剩余污泥中加入0.1 mol·L-1 HCl溶液并振蕩反應(yīng)1 h，離心去除上清液，得到沉淀。然后加入NaOH溶液振蕩離心后去除沉淀，得到上清液并測定腐植酸含量。再根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理以及參照提取試驗結(jié)果確定的條件范圍，選擇堿濃度（X1）、堿泥比（X2）與振蕩時間（X3）為剩余污泥腐植酸提取量的3個顯著影響因子，以腐植酸提取量為響應(yīng)值，采用三因子三水平的響應(yīng)曲面法進行優(yōu)化試驗。通過分析多變量二元回歸方程確定腐植酸提取優(yōu)化的最佳參數(shù)。試驗參數(shù)設(shè)計見表1。

1.2.2利用作物早期生長試驗對剩余污泥腐植酸植物毒性進行評價

根據(jù)前期預(yù)試驗結(jié)果，試驗共設(shè)置500 mg·L-1和1 000 mg·L-1腐植酸溶液處理，去離子水為對照（未添加腐植酸），每個處理均設(shè)3個重復(fù)。分別取大白菜種子30顆和蘿卜種子20顆，置于墊有一張定性濾紙的方形培養(yǎng)皿（10 cmx10 cm）中，加入去離子水或腐植酸溶液4 mL后置于培養(yǎng)箱中，于25℃條件下黑暗培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)后計算種子相對發(fā)芽率。然后每個培養(yǎng)皿保留一半數(shù)量大小相近的種子，分別補加2 mL去離子水或腐植酸溶液后繼續(xù)于25℃條件下黑暗培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)后計算種子胚根相對根長。黑暗培養(yǎng)完成后補加2 mL去離子水或腐植酸溶液，設(shè)置光照強度為6 000 1x，光照培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)后測定子葉相對光合色素含量。

1.3分析方法

含水率、揮發(fā)性固體VS、總固體TS采用重量法測定，可溶性化學(xué)需氧量SCOD和總化學(xué)需氧量TCOD采用快速消解分光光度法（HJ/T 399-2007）測定，pH利用pH儀測定（CJ/T 221-2005），總腐植酸含量采用GB/T 11957-2001測定。

稱取約1 mg干燥的腐植酸置于元素分析儀（Unicube，德國Elementar公司）中測定分析C、H、O、N元素的含量，并根據(jù)含量分析O/C、H/C和C/N原子比；傅里葉變換紅外光譜測定由傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet lS5，美國Thermo公司）測定，測定之前去除樣品水分，取2 mg干燥樣品與200 mg KBr混合，壓成薄片后進行分析，掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為1 cm-1；凝膠滲透色譜由凝膠滲透色譜儀（1525，美國Waters公司）測定，分析條件為色譜柱BioSep-SEC-S2000（5 um硅膠載體，300 mmx7.8 mm）及同系列的保護柱（30 mmx7.8 mm），色譜柱溫度為40℃，流動相為四氫呋喃，流速為1.0 mL·min-1。

1.4數(shù)據(jù)處理與分析

利用Excel軟件對數(shù)據(jù)進行處理，結(jié)果以平均值±標準差的形式表示。采用SPSS 19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，利用LSD法比較結(jié)果之間的差異，顯著性設(shè)為Plt;0.05。采用Origin 2021軟件制圖。

2結(jié)果與討論

2.1剩余污泥腐植酸提取響應(yīng)優(yōu)化結(jié)果

2.1.1剩余污泥腐植酸提取響應(yīng)曲面試驗的設(shè)計與結(jié)果

表2為響應(yīng)曲面試驗的設(shè)計與結(jié)果，對表中的數(shù)據(jù)進行多元二次回歸方程的擬合，得到回歸模型的方程為Y=94.8-5.1X1-4.5 X2-6.7 X3+2.5 X1X2-2.1X1X3+1.3X2X3-21.4X12-13.8X22-18.9X32?；貧w模型的R2=0.982 9，說明該回歸模型相關(guān)性良好。Adj R2=0.961 0，Pred R2=0.795 9，二者之差小于0.2，因此，該回歸模型的準確度和精確度較高。

響應(yīng)曲面試驗的方差分析見表3?；貧w模型的F值為44.76，P值lt;0.000 1，說明模型擬合良好。而方差分析結(jié)果中，P值和F值反映了各因子對響應(yīng)值的影響程度，F(xiàn)值越大，P值越小，各因子對響應(yīng)值的影響越顯著。因此各因子均與腐植酸提取量之間存在極顯著的線性關(guān)系，提取條件的影響程度為振蕩時間（P=0.001 4）gt;堿濃度（P=0.005 9》堿泥比（P=0.011 2）。

2.1.2響應(yīng)曲面試驗最佳條件

利用回歸模型得到的剩余污泥腐植酸提取最優(yōu)條件：堿濃度為0.19 mol·L-1、堿泥比（mL：g）為11.6、振蕩時間為3.8 h，預(yù)測得到的最大腐植酸提取量為96.1 mg·g-1。進行驗證試驗后發(fā)現(xiàn)回歸模型的預(yù)測值偏差小于5％，說明回歸模型擬合度較好。根據(jù)表2可知，當振蕩時間一定時，腐植酸提取量隨著堿濃度和堿泥比的提升出現(xiàn)先增加后減小的趨勢。當堿泥比一定時，腐植酸提取量也出現(xiàn)先增加后減小的趨勢。當堿濃度一定時，在一定范圍內(nèi)，振蕩時間和堿泥比不斷增加，腐植酸提取量也出現(xiàn)先增加后減小的趨勢。這可能是由于隨著時間的延長，腐植酸不斷地溶解至溶液中，當達到溶解飽和時，會被重新吸附至剩余污泥表面。也有研究者認為，隨著堿泥比和堿濃度的提升，溶解至液相中的腐植酸進一步分解為小分子的水溶性提取物和二氧化碳。

2.2剩余污泥腐植酸表征

2.2.1元素分析

為了分析腐植酸元素組成與結(jié)構(gòu)，對其進行了元素分析，結(jié)果見表4。剩余污泥腐植酸主要由C、H、O和N元素組成，其中C含量為37.74％，H含量為5.26％，O含量為31.80％，N含量為8.51％，C含量最多，H含量最少。本研究所得剩余污泥腐植酸與表4中其他研究所得腐植酸的元素含量相差較小。腐檀酸樣品的O/C原子比可鑒別羧基等含氧官能團的含量。本研究腐植酸的O/C為0.84，高于張靜靜、李有康等和劉超超等研究中剩余污泥腐植酸的O／C，與其他剩余污泥腐檀酸的O/C類似，說明本研究腐植酸存在較多的含氧官能團。H/C原子比是比較樣品腐殖質(zhì)芳香度的有效定性參數(shù)。本研究腐植酸的H/C為0.14，接近其他剩余污泥腐植酸的H/C，由此可見，本研究腐植酸可能含有較多數(shù)量的芳香基團，芳香化程度較高。C/N可揭示腐植酸的腐殖化程度。本研究剩余污泥腐植酸的C/N最低，為4.43，證明其腐殖化程度較高，形成絡(luò)合物的穩(wěn)定性也較高。這可能是由于有機物在本研究剩余污泥的來源中占比較高，并且二級處理工藝中的微生物活性高，分解了剩余污泥中的有機質(zhì)，釋放出大量的小分子有機化合物，包括了腐植酸前體物質(zhì)，從而促進了剩余污泥腐植酸的腐殖化。

2.2.2紅外譜圖分析

腐植酸作用效果受其官能團種類的影響，其可促進植物生長過程中對養(yǎng)分的吸收，也可調(diào)控作物生長環(huán)境。為了確定剩余污泥腐檀酸的結(jié)構(gòu)和官能團信息，本研究進行了傅里葉變換紅外光譜分析。剩余污泥腐植酸的傅里葉變換紅外光譜見圖1。如圖所不，在4 000-400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)，出現(xiàn)了8個腐植酸特征吸收峰。在3 371 cm-1波數(shù)附近的峰代表酚羥基和醇羥基-OH的振動；2 927 cm-1波數(shù)附近的峰歸因于脂肪烷烴結(jié)構(gòu)中-CH的伸縮振動；2 361 cm-1波數(shù)出現(xiàn)較小的峰，這是羧基的-OH和-H伸縮振動導(dǎo)致的；1 657 cm-1波數(shù)出現(xiàn)的峰也是羧基的特征峰，這是羧基中的C=O伸縮振動引起的；1 541cm-1波數(shù)附近的峰通常被認為是芳香共軛雙鍵引起的；1 232 cm-1波數(shù)附近的峰則歸因于酚、醚或醇的C-O伸縮和-OH的變形振動；1 057 cm-1和564 cm-1波數(shù)附近的峰歸因于脂肪醇、醚、硫醇基的伸縮振動以及磺基、硫醇基等含硫化合物的伸縮振動。以上結(jié)果說明，剩余污泥腐植酸存在較多含氧官能團，生物活性較高。

2.2.3凝膠滲透色譜分析

腐植酸相對分子質(zhì)量越小，其生物活性越強。為了確定剩余污泥腐植酸的相對分子質(zhì)量，判斷其生物活性，本研究利用凝膠滲透色譜法對其進行了分析，剩余污泥腐植酸的相對分子質(zhì)量分布如圖2所示。由圖2可知，剩余污泥腐植酸的1g Mw主要分布在3.0-4.5之間，與之對應(yīng)的相對分子質(zhì)量分布在1-32 kDa之間。剩余污泥腐植酸的Mw（重均分子量）為9 kDa，Mn（數(shù)均分子量）為4 kDa，相較于張靜靜研究中剩余污泥腐植酸的相對分子質(zhì)量（Mw=27 kDa，Mn=25 kDa）和李有康等研究中剩余污泥腐植酸的相對分子質(zhì)量（30-50 kDa）以及堆肥腐植酸的相對分子質(zhì)量（Mw=14-17 kDa）和森林土壤腐植酸的相對分子質(zhì)量（Mw=42 kDa），本研究中腐植酸的相對分子質(zhì)量較小，具有較強的生物活性。

2.3剩余污泥腐植酸的植物毒性評價

2.3.1種子發(fā)芽

不同濃度腐植酸溶液對大白菜、蘿卜種子發(fā)芽率的影響如表5所示。由表5可知，不同濃度下大白菜種子發(fā)芽率分別為96.7％、90.0％和84.4％。與0 mg·L-1相比，500 mg·L-1腐植酸處理的大白菜種子發(fā)芽情況并無顯著性差異（Pgt;0.05），而1 000 mg·L-l腐植酸處理的大白菜種子的發(fā)芽情況卻存在顯著性差異（Plt;0.05）。這可能是因為水分是種子發(fā)芽的先決條件，當腐植酸溶液濃度較低時，在種子本身的抗逆性作用下，抑制水分吸收的效果不明顯，而當腐植酸溶液濃度提高后，其電導(dǎo)率也隨之上升，鹽濃度的增加抑制了種子對水分的吸收。在此情況下，種子本身的代謝反應(yīng)難以抵抗高濃度溶液的影響，導(dǎo)致發(fā)芽率降低。而三個處理的蘿卜種子發(fā)芽情況均無顯著性差異（Pgt;0.05），發(fā)芽率分別為90.0％、90.0％和80.0％。這可能是由于蘿卜的種皮較厚，可阻礙高濃度腐植酸溶液對其產(chǎn)生的負面影響，亦或者是蘿卜種子本身的抗逆性較強，可削弱高濃度腐植酸溶液對其產(chǎn)生的影響。

2.3.2種子胚根伸長

觀察不同濃度腐植酸溶液條件下作物種子根長的發(fā)育情況，可進一步評估其植物毒性，圖3為不同濃度腐植酸溶液對大白菜、蘿卜種子根長的影響，由圖3（a）可知，500 mg·L-1與1 000 mg·L-1腐植酸溶液對大白菜的根長發(fā)育有良好的促進作用，相對根長分別為126.1％和140.6％。這是因為適量的腐植酸能夠提高植物ATP酶的活性，從而刺激種子胚根伸長。此外，凝膠滲透色譜分析顯示，本研究腐植酸分子量較小，而小分子量腐植酸對促進作物根系生長有重要作用，故對大白菜種子胚根伸長具有一定促進作用。而從圖3（b）可知，當腐植酸溶液濃度大于1 000mg·L-1時，其對蘿卜的根長生長具有抑制作用（Plt;0.05），相對根長從100.7％降低至79.2％。這可能是由于蘿卜種子顆粒較大并且腐植酸溶液濃度過大時，培養(yǎng)皿中的水分不足以供給蘿卜種子的需求，而小顆粒的大白菜種子在培養(yǎng)皿中能夠進一步生長。

2.3.3作物子葉光合色素

光合色素是作物進行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。通過測定作物子葉光合色素的含量可評估腐植酸溶液對作物的脅迫作用。圖4（a）與圖4（b）分別為不同濃度腐植酸溶液對大白菜、蘿卜子葉光合色素含量的影響。由圖4可知，與O相比，500 mg·L-1和1 000 mg·L-1腐植酸溶液對大白菜光合色素含量的影響無著性差異，相對葉綠素a含量分別為104.2％和101.9％，相對葉綠素b含量分別為96.0％和102.7％，相對類胡蘿卜素含量為99.0％和101.4％。蘿卜子葉也有相同的影響，相對葉綠素a含量分別為103.3％和104.5％，相對葉綠素b含量分別為93.0％和108.0％，相對類胡蘿卜素含量為104.9％和101.6％。葉綠體是植物幼苗進行光合作用的場所。作為重要的細胞器之一，雖然它被細胞壁與細胞膜層層保護，但是在重金屬和鹽分等非生物脅迫下，葉綠體結(jié)構(gòu)會遭到破壞，影響光合色素的合成。而劉彩娟等發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下，黃腐酸可維持葉綠體的超微結(jié)構(gòu)，增加葉綠素含量。本研究中不同濃度腐植酸對大白菜和蘿卜子葉光合色素含量均無顯著影響，這可能是由于腐植酸中的營養(yǎng)元素會促進子葉生長，可抵消高濃度腐植酸對其產(chǎn)生的不利影響。

3結(jié)論

（1）通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化了腐植酸的提取條件，提取量相較于國際腐植酸協(xié)會推薦法增加了118％；在種子發(fā)芽試驗的基礎(chǔ)上，通過幼苗建成試驗全面評價了腐植酸對植物早期生長的影響。

（2）腐植酸提取的最佳條件為堿濃度0.19 mol·L-1、堿泥比（mL：g）11.6、振蕩時間3.8 h。預(yù)測得到的最大腐植酸提取量為96.1 mg·g-1。3個因子對腐植酸提取量的影響程度為振蕩時間gt;堿濃度gt;堿泥比。

（3）剩余污泥腐植酸的O/C為0.84，H/C為0.14，C/N為4.43，芳香化程度與腐殖化程度較高，含有豐富的含氧官能團，且相對分子質(zhì)量較小，具有較高的生物活性。

（4）剩余污泥腐植酸在低濃度時會促進大白菜種子胚根伸長，而在高濃度時對大白菜種子發(fā)芽以及蘿卜種子胚根伸長有一定抑制作用。腐植酸對大白菜和蘿卜子葉光合色素含量均無顯著影響。