摘要：為探討菟絲子對有機磷農藥敵百蟲下調小鼠睪丸膽固醇側鏈裂解酶P450scc蛋白表達是否具有緩解作用，本試驗將30只8周齡Balb/C雄性小鼠隨機分為：對照組，敵百蟲組，菟絲子組，敵百蟲加低、中、高濃度菟絲子組；連續(xù)灌胃10 d后，取睪丸組織，用蘇木精-伊紅（HE）染色、免疫組織化學和Western Blot技術檢測敵百蟲與菟絲子對小鼠睪丸組織結構和P450scc表達與定位的影響。結果表明：與對照組相比，敵百蟲組生精細胞排列混亂，間質細胞數(shù)量減少，睪酮合成相關酶P450scc的免疫組化陽性表達減弱（P<0.05），P450scc蛋白表達水平下調（P<0.0001）。菟絲子組比對照組睪丸間質細胞數(shù)量多；P450scc陽性表達增強（P<0.0001）；P450scc的蛋白表達水平上調（P<0.0001）。與敵百蟲組相比，敵百蟲加低、中、高濃度菟絲子組睪丸的

組織形態(tài)逐漸趨于對照組；且P450scc的陽性表達也逐漸增強（P<0.01，P<0.0001，P<0.0001）；蛋白表達水平也均被提高（P<0.0001）。說明菟絲子可緩解敵百蟲導致的小鼠睪丸間質細胞組織結構的損傷以及睪酮合成相關酶P450scc表達的下調。

關鍵詞：菟絲子；敵百蟲；P450scc；睪丸間質；雄性生殖毒性

水果和蔬菜上有機磷農藥的殘留被認為是導致男性因精子質量降低不育的因素之一[1-2]。其中敵百蟲（Trichlorfon，TCF）被廣泛用于防治農作物、環(huán)境害蟲及家畜體內外寄生蟲，是獸醫(yī)中較為常用的有機磷農藥[3]。先前的研究表明，有機磷農藥損傷雄性生殖可能是損傷了睪丸間質細胞，從而導致睪酮合成

障礙[4-5]。睪酮的合成起始于從膽固醇的側鏈上切除6個碳生成孕烯醇酮，該反應由細胞色素P450膽固醇側鏈裂解酶（Cytochrome P450 Cholesterol Side Chain Lyase，P450scc，又稱 CYP11A1）催化[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)，敵百蟲會顯著抑制P450scc蛋白的表達[8]，P450scc蛋白表達下降會使膽固醇的催化與轉運減少，進而導致睪酮合成減少[9]。

菟絲子（Semen Cuscutae）是一種傳統(tǒng)中藥?，F(xiàn)代藥理學研究表明，菟絲子總黃酮對生殖系統(tǒng)的調節(jié)是通過影響下丘腦-垂體-性腺軸而發(fā)揮作用[10]。有研究發(fā)現(xiàn)口服含有菟絲子的處方藥可以顯著增加精子數(shù)量和活力[11]。也有研究發(fā)現(xiàn)當睪酮水平低于機體正常水平時，菟絲子總黃酮會促進睪丸間質細胞產(chǎn)生睪酮[12]。

本試驗通過研究敵百蟲和菟絲子對雄性小鼠睪丸組織病理學變化和P450scc蛋白的表達量的影響，揭示敵百蟲和菟絲子對雄性生殖性能的作用機制，為敵百蟲對人和動物所造成的生殖損傷提供新的理論保障。

1 材料

1.1 試驗動物

健康8周齡Balb/C雄性小鼠30只，體重為22～27 g，購自山西省人民醫(yī)院實驗動物飼養(yǎng)中心。

1.2 藥品

菟絲子購自北京同仁堂健康藥業(yè)電子商務有限公司。敵百蟲購自南通江山農藥化工股份有限公司。

1.3 主要試劑

蘇木精購自北京索萊寶科技有限公司。免疫組化試劑盒與DBA顯色液購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。兔多克隆抗CYP11A1抗體與Goat Anti-Rabbit IgG均購自北京博奧森生物技術有限公司。β-actin購自武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.4 主要儀器

生物組織包埋機與生物組織包埋機冷凍臺（型號：YD-6 L智能型），浙江省金華市益迪醫(yī)療設備廠生產(chǎn)。切片機、攤片機和烤片機，上海徠卡儀器有限公司。電熱恒溫鼓風干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司。熒光倒置顯微鏡，德國徠卡顯微系統(tǒng)。

2 方法

2.1 菟絲子水提液的制備

稱取菟絲子25 g，用蒸餾水清洗3次，然后用350 mL蒸餾水浸泡菟絲子30 min；之后大火加熱至沸騰后轉為小火再加熱30 min，用紗布過濾留上清液；濾渣加150 mL蒸餾水，再次用大火加熱至沸騰后轉為小火加熱30 min，過濾留上清液；合并2次上清液濃縮至100 mL（生藥濃度為250 mg·kg-1）[13]。

2.2 試驗動物分組與給藥

將30只雄鼠置于塑料籠內并保持在標準條件下（光照與黑暗進行12h循環(huán)；（25±3）℃；35%～60%相對濕度），并供給維持飼料和水；適應5 d后隨機的均分為6組，分別為對照組，敵百蟲組（1/10 LD50，45 mg·kg-1），菟絲子組（1 800 mg·kg-1），菟絲子低（900 mg·kg-1）、中（1 800 mg·kg-1）、高（3 600 mg·kg-1）劑量治療組。給小鼠經(jīng)口連續(xù)灌胃10 d，于每日上午9∶00進行。對照組每日按體重給予等量的生理鹽水，敵百蟲加菟絲子組先給小鼠灌服敵百蟲（1/10 LD50，45 mg·kg-1），1h后灌服相應劑量的菟絲子水提液。

10 d后，二氧化碳安樂死小鼠，取小鼠睪丸組織，部分置于Bouin's固定液中，用于組織形態(tài)學觀察。部分置于液氮中，用于檢測P450scc蛋白的表達。采用免疫組織化學和Western Blot技術檢測P450scc在小鼠睪丸中的表達和定位。

2.3 睪丸組織病理學觀察

將睪丸在Bouin's固定液中固定24 h。然后將睪丸脫水透明，浸入石蠟中并制成6μm厚的切片。睪丸石蠟切片用蘇木精-伊紅（HE）染色溶液染色，并在顯微鏡下觀察并分析組織學變化。

2.4 免疫組織化學檢測睪丸組織P450scc表達

將制備好的6μm睪丸石蠟切片脫蠟，梯度酒精復水。隨后切片在檸檬酸鈉抗原修復液（98℃）中浸泡15 min左右。使用免疫組化試劑盒提供的試劑進行免疫組織化學染色，先將切片置于3%H2O2溶液中30 min左右；之后加封閉液，放入烘箱30 min滴加5%牛血清白蛋白稀釋的一抗（P450scc，1∶100）50μL，陰性用PBS代替，4℃孵育14 h；孵育完后滴加鏈霉菌抗生素，烘箱30 min；最后滴加DAB顯色液顯色。

2.5 Western Blot檢測P450scc蛋白表達水平

用含有10μL PMSF的RIPA裂解緩沖液在高通量組織研磨儀中研磨小鼠睪丸5 min（RIPA∶PMSF=

100∶1）。在4℃，11 400 r/min下離心10 min，取上清液；用蛋白質定量試劑盒（BCA法）測定蛋白濃度。加入200μg的蛋白與5×Loading buffer 混勻，用1%SDS調整濃度，沸水浴10 min變性。通過SDS-PAGE分離并電轉移到硝酸纖維素（NC）膜上，在室溫下用TBST配置的5%的脫脂牛奶封閉2h。之后，將NC膜分別在P450scc（1∶500）、β-actin（1∶2 000）的一抗中孵育，在4℃孵育14h后，用TBST洗滌NC膜，然后放入山羊抗兔IgG（1 000∶2）中孵育2 h。最后將NC膜曝光顯色。

2.6 統(tǒng)計分析

所有計算均使用統(tǒng)計學軟件GraphPad Prism 8.0進行。采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）和t檢驗確定多組間的統(tǒng)計學差異，試驗數(shù)值為“平均值±標準誤”（n=3）。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001。

3 結果

3.1 菟絲子對敵百蟲致小鼠睪丸組織病理學變化的影響

如圖1，對照組小鼠睪丸的組織結構正常，曲精小管中支持細胞和各級生精細胞均排列有序，結構清晰，管腔內充滿精子，間質細胞均勻地分布在基膜外（圖1A）。敵百蟲組生精細胞排列紊亂、脫落，生精細胞變性，個別曲精小管管腔中可見脫落的生精細胞，管腔內成熟精子變少。間質細胞較對照組明顯減少（圖1B）。菟絲子組各級生精細胞排列整齊緊密，且間質細胞明顯增多（圖1C）。與敵百蟲組的組織形態(tài)相比，敵百蟲加低（圖1D）、中（圖1E）、高（圖1F）濃度菟絲子組睪丸組織形態(tài)逐漸趨于對照組。

3.2 菟絲子對敵百蟲致小鼠睪丸組織P450scc陽性表達的影響

如圖2，免疫組織化學結果表明P450scc主要在睪丸間質細胞中表達。與對照組相比，P450scc表達水平在敵百蟲組顯著降低（P<0.01），在菟絲子組明顯上升（P<0.05）。與敵百蟲組相比，敵百蟲加低濃度菟絲子組的表達明顯升高（P<0.01），中、高濃度菟絲子組的表達極顯著升高（P<0.0001）。

3.3 菟絲子對敵百蟲致小鼠睪丸組織P450scc蛋白表達的影響

如圖3，通過WB檢測P450scc的蛋白表達水平。與對照組相比，敵百蟲組蛋白表達明顯下降（P<0.0001），菟絲子組蛋白的表達顯著上升（P<0.0001）。與敵百蟲組相比，敵百蟲加低、中、高濃度菟絲子組蛋白的表達顯著升高（P<0.0001）。

4 討論

不孕不育癥影響了全球約15%的育齡夫婦，其中約半數(shù)是由男性因素造成的[14]。精子濃度和活力低被認為是男性不育的主要原因之一[15]，而有機磷農藥會引起精子濃度及質量下降[16]，因此有機磷農藥引起的生殖毒性一直受到研究人員的密切關注。睪丸間質細胞主要功能為合成睪酮，睪酮具有維持生精的作用。男性生殖的健康與正常的精子發(fā)生與睪酮等類固醇激素密切相關[17-18]。為了進一步研究菟絲子緩解敵百蟲暴露小鼠生殖損傷的機制，本研究重點關注了睪酮生成相關酶P450scc，P450scc的表達降低會導致膽固醇的催化和轉運減少，從而使類固醇激素合成受阻。

有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠暴露于敵百蟲后可使睪丸組織的生精細胞數(shù)量減少曲精小管受損[19]，在本研究中45 mg·kg-1（1/10 LD50）敵百蟲也會引起生精細胞變性和排列混亂。先前的研究表明，敵百蟲暴露后，膽固醇側鏈裂解酶P450scc的mRNA及蛋白表達降低[3]，從而導致睪酮合成障礙，這與本研究結果一致，提示45 mg·kg-1（1/10 LD50）敵百蟲對睪酮合成途徑中的酶有一定的抑制作用。

菟絲子可以促進大鼠睪丸間質細胞睪酮的分泌[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)1 800 mg·kg-1菟絲子會使間質細胞數(shù)量增多，還可以提高P450scc蛋白的表達。由此可推測，菟絲子對正常小鼠的生殖也有促進作用，可能是通過提升P450scc對膽固醇的催化作用而使睪酮含量升高。

本研究觀察到使用菟絲子（1 800 mg·kg-1、3 600 mg·kg-1）對敵百蟲（45 mg·kg-1）導致的睪丸結構損傷有明顯的緩解作用，生精細胞排列趨于緊密，表明菟絲子可以改善敵百蟲引起的睪丸組織結構的病理損傷。暴露于45 mg·kg-1敵百蟲的小鼠睪丸P450scc蛋白表達水平在補充菟絲子后顯著升高，3 600 mg·kg-1菟絲子緩解作用最為明顯。據(jù)此推測，敵百蟲通過損傷睪丸間質細胞，抑制膽固醇側鏈裂解酶P450scc蛋白的表達，導致睪酮合成障礙，使精子密度降低；補充1 800 mg·kg-1和3 600 mg·kg-1的菟絲子可以有效緩解敵百蟲對睪丸間質細胞結構的損傷和對P450scc蛋白表達下降的影響。

綜上，敵百蟲破壞了小鼠睪丸的正常組織結構，下調了類固醇合成相關酶P450scc的表達水平；菟絲子能夠使睪丸間質細胞增多，上調P450scc表達水平；菟絲子可以緩解敵百蟲引起的睪丸病理變化，并上調P450scc表達水平，其中，3 600 mg·kg-1的作用較好。這提示菟絲子和敵百蟲可能均是通過影響睪丸間質細胞和P450scc而對睪酮合成產(chǎn)生影響。

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