No difference in polyspermia index between older men（≥40 years） and younger men：a propensity score matching study

ABSTRACT：Objective To investigate the effects of advanced male age on the incidence of polyspermy fertilization.Methods The study involved data of 4210 in vitro fertilization （IVF） cycles treated in our center during Jan.2016 and Sep.2022，including 4053 patients younger than 40 years and 157 patients above 40 years.After propensity score matching，152 patients in the advance group and 421 in the young group were recruited.The baseline data and the difference in polyspermy fertilization rate were compared between the two groups.Results After propensity score matching，there were no significant differences between the two groups in terms of female age，infertility type，infertility years，infertility factors，female body mass index （BMI），male BMI，semen volume，semen pH value，sperm concentration，sperm motility，progressive motility rate，percentage of normal sperm morphology，number of fertilized eggs and number of MⅡ eggs （P＞0.05）.Among the 573 fresh IVF cycles，the rate of 3 PN cycles was 35.5%，and the incidence of polyspermy fertilization was 6.5%.There were no significant differences in the number of polyspermy fertilized eggs，transferable embryos，high-quality embryos，and blastocysts between the two groups.Conclusion Advanced male age has no significant effect on the incidence of polyspermy fertilization.

KEY WORDS：in vitro fertilization；multiple pronuclei；propensity score matching；transferable embryos；advanced male age

摘要：目的 探討男性高齡因素對多精受精發(fā)生率的影響。方法 本研究納入了南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心2016年1月—2022年9月的4210個體外受精（IVF）周期數(shù)據(jù)，按照男方的年齡進(jìn)行分組，＜40歲的年輕組患者4053例，≥40歲的高齡組患者157例。經(jīng)過傾向性評分匹配后篩選出高齡組152例患者，年輕組421例患者。比較兩組患者的基線資料以及多精受精發(fā)生率的差異。結(jié)果 經(jīng)過傾向性評分匹配后，兩組患者在女方年齡、不育類型、不育年限、不孕因素、女方身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、男方BMI、精液量、精液pH值、精子濃度、精子活力、前向運(yùn)動精子百分比、正常精子形態(tài)百分比、受精卵數(shù)、MⅡ卵子數(shù)方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；分析結(jié)果表明573個新鮮IVF周期中出現(xiàn)3原核（PN）周期的幾率為35.5%，多PN受精卵發(fā)生率為6.5%。高齡組的多精受精卵數(shù)、可移植胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、形成囊胚數(shù)與年輕組比較未見顯著差異（P＞0.05）。結(jié)論 與年輕男性相比，男性高齡（≥40歲）對卵子多精受精發(fā)生率并無明顯影響。

關(guān)鍵詞：體外受精；多原核；傾向性評分匹配；可移植胚胎；男性高齡

中圖分類號：Q492.6"" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2024.11.004

原核（pronucleus，PN）的形成和發(fā)育是受精過程的關(guān)鍵部分。經(jīng)過該過程，親本染色體補(bǔ)體合并，產(chǎn)生合子基因組。整個過程包括4個主要步驟：膜囊泡的形成[1]，核孔復(fù)合體的組裝[2]，核薄板支架的組裝[3]，以及親本原核的聚集[4]。輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）中，多于授精或卵胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）后16～18 h確認(rèn)受精。2PN的形成被認(rèn)為是正常的受精，正常受精卵的2PN通常大小相等且位于中心位置[5]，而≥3 PN的受精卵被認(rèn)為是異常受精，不適合臨床移植，造成可用于移植的胚胎數(shù)變少。

目前認(rèn)為多PN，尤其是3 PN的形成是由于多精受精或第二極體擠出失敗所致[6]。研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致多精受精的主要原因是精液濃度過高[7]、卵母細(xì)胞過熟或不成熟，高齡產(chǎn)婦或是3PN發(fā)病率高的原因之一ADDINEN.CITE.DATA[8]。而男性年齡對生育能力、胚胎發(fā)育的影響仍然沒有得到充分重視。雖然男性高齡的定義尚未達(dá)成普遍共識，但一些生殖醫(yī)學(xué)類專業(yè)協(xié)會將高齡父親定義為≥40歲[9]。目前尚缺乏男性高齡是否會影響多精受精的相關(guān)研究。本研究采用傾向性匹配評分法篩選患者并比較分析，發(fā)現(xiàn)高齡男性的多精受精指標(biāo)可能與年輕男性無顯著差異，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究回顧性分析了南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心2016年1月—2022年9月的4210個體外受精（in vitro fertilization，IVF）周期資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①第一周期；②夫妻染色體正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①女方年齡＞38歲；②需要接受ICSI治療或收集的成熟卵母細(xì)胞需要接受補(bǔ)救性ICSI治療的不孕夫妻；③患者數(shù)據(jù)有缺失值；④可用于受精的M Ⅱ卵子數(shù)＜3枚的患者；⑤接受供精I(xiàn)VF治療。按照男方年齡將患者分為年輕組（年齡＜40歲，n=4053）和高齡組（年齡≥40歲，n=157）。本研究獲得南京市婦幼保健醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 分析指標(biāo)

主要分析指標(biāo)為2PN受精卵數(shù)、3PN受精卵數(shù)、＞3PN受精卵數(shù)、≥3PN受精卵數(shù)、可移植胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、形成囊胚數(shù)。

1.3 傾向性評分匹配方法 本研究采用了傾向性評分匹配（propensity score matching，PSM）ADDINEN.CITE.DATA[10-11]，并嵌入了一個1∶n的傾向評分匹配插件，卡鉗值設(shè)置為0.02。將女方年齡、不育類型、不育年限、不孕因素、女方身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、男方BMI、精液量、精液pH值、精子濃度、精子活力、前向運(yùn)動精子百分比、正常精子形態(tài)百分比、受精卵數(shù)、M Ⅱ卵子數(shù)等納入?yún)f(xié)變量用于計(jì)算傾向性評分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不符和正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用中位數(shù)（四分位間距）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。分類變量以例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PSM前兩組患者一般資料比較

與年輕組相比，高齡組患者男方精液量、受精卵數(shù)及女方MⅡ卵子數(shù)均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），兩組間不育類型、不育年限、不孕因素、前向運(yùn)動精子百分比方面差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

2.2 PSM后兩組患者多精受精結(jié)果比較

PSM后兩組患者IVF周期中出現(xiàn)3PN周期的幾率為35.5%，≥3PN受精卵發(fā)生率為6.5%。

兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。主要觀察指標(biāo)中高齡組的2PN受精卵數(shù)、3PN受精卵數(shù)、＞3PN受精卵數(shù)、≥3PN受精卵數(shù)、可移植胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、形成囊胚數(shù)與年輕組比較差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

3 討 論

IVF是主流輔助生殖技術(shù)之一，常導(dǎo)致≥3PN的受精卵出現(xiàn)[12]。各種研究表明，3PN人類卵母細(xì)胞很少發(fā)育成三倍體胚胎[13-14]。盡管有三倍體受精卵嬰兒出生的報(bào)道，通常這些嬰兒在出生后也難以長久存活[15]。因此，分析胚胎的染色體情況判斷是否適合移植非常重要。異常受精卵中，最常見的是3PN受精卵，其主要成因是卵母細(xì)胞基因組未能與極體分離或2個精子進(jìn)入卵母細(xì)胞，后者發(fā)生更頻繁，導(dǎo)致在IVF過程中形成5%～7%的多精子受精卵[12]。本研究的結(jié)果與上述研究相似，573個IVF周期中出現(xiàn)3PN周期的幾率為35.5%，≥3PN受精卵發(fā)生率為6.5%。

眾多證據(jù)表明受精過程存在多層安全機(jī)制以保證正常受精。已有研究報(bào)道了兩種類型的多精子阻滯機(jī)制：“卵母細(xì)胞膜阻滯”和“透明帶反應(yīng)”，它們對維持正常受精非常重要[16-17]。MIO等[18]通過使用延時(shí)攝影系統(tǒng)，成功證明了人類卵母細(xì)胞中可能存在多精子阻滯的新機(jī)制。BIANCHI等[19]發(fā)現(xiàn)一種新的蛋白質(zhì)并命名為“Juno”，它在未受精的卵子上高度表達(dá)，可以防止多精受精。由于多精子阻滯機(jī)制可以有效保證正常受精，因此3PN的發(fā)生可能在很大程度上是由卵母細(xì)胞質(zhì)量或精子異常引起的[20]。

精子質(zhì)量的逐漸下降與男性年齡的增長有關(guān)并可能導(dǎo)致其生育能力低下[21]。精子質(zhì)量的下降不僅影響常規(guī)參數(shù)，如精液量和精子活力，還與具有片段化DNA的精子比例或染色體缺陷增加有關(guān)［22-24］。有研究發(fā)現(xiàn)多精受精的發(fā)生率似乎與某些精子運(yùn)動特征有關(guān)，如頭部側(cè)向位移幅度和前向運(yùn)動精子的濃度[25]。而本研究結(jié)果顯示，高齡組（≥40歲）與年輕組（＜40歲）之間多PN受精卵差異并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。盡管將多PN進(jìn)一步分層為3PN和＞3PN，兩組的異常受精卵仍未見顯著差異，而且兩組間的可移植胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、形成囊胚數(shù)也均未見顯著差異。這表明男性年齡與精子質(zhì)量有一定的相關(guān)性，或許可以通過改變精子運(yùn)動參數(shù)來影響多精受精的發(fā)生率，但其本身可能并不是多精受精的獨(dú)立影響因素。此外，越來越多基礎(chǔ)和臨床研究的證據(jù)為磷脂酶C zeta（phospholipase C zeta，PLCζ）作為精子傳播的蛋白質(zhì)因子提供了明確的支持，該因子負(fù)責(zé)在配子融合時(shí)激活卵母細(xì)胞[26-27]。在擴(kuò)散到卵質(zhì)后，PLCζ觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣振蕩，隨后驅(qū)動一系列生物事件，包括皮質(zhì)顆粒胞吐作用，防止多精受精、極體排出、細(xì)胞骨架重排和PN的形成[26-29]。近來有研究證明，人類精子中PLCζ的比例、總水平和定位模式與年齡無關(guān)[30]。雖然衰老與精子質(zhì)量的明顯下降有關(guān)，但衰老過程似乎并沒有影響所有精子蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能，只是作用于部分目的蛋白。

在IVF過程中，多PN會影響可移植胚胎數(shù)，其發(fā)生多被認(rèn)為與卵子未成熟或過度成熟、精子濃度過高以及第二極體排出障礙有關(guān)。許多研究還證實(shí)了精子中的PLCζ是維持正常受精的關(guān)鍵物質(zhì)，在預(yù)防多精子受精方面發(fā)揮著重要作用[27-28]。但一些新近研究認(rèn)為PLCζ的表達(dá)及功能作用似乎并沒有受到年齡變化的影響[30]，這可能意味著PLCζ在預(yù)防多精子受精方面的作用并不會受到年齡的影響。而與之相呼應(yīng)的是本研究發(fā)現(xiàn)與年輕男性相比，高齡男性在多精受精方面的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這也進(jìn)一步支持了上述猜想。本研究的不足在于病歷庫原始數(shù)據(jù)存在局限性，無法將未成熟的卵子數(shù)和過度成熟的卵子數(shù)納入研究。

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