摘要 ［目的］響應(yīng)面法優(yōu)選巴西人參總皂苷提取工藝，為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。［方法］以莧科植物巴西人參為研究對象，采用超聲輔助低共熔溶劑法提取總皂苷，通過單因素試驗對尿素與氯化膽堿摩爾比、含水量、液料比、提取時間進(jìn)行考察，以總皂苷得率作為評價指標(biāo)，運用Box-Behnken響應(yīng)面法對巴西人參總皂苷提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。［結(jié)果］超聲輔助低共熔溶劑提取巴西人參總皂苷的最佳工藝為尿素∶氯化膽堿=1∶1、含水量38%、液料比18∶1（mL∶g）、提取時間37 min，在此條件下，總皂苷得率為6.26%。［結(jié)論］該方法提取效率高、重復(fù)性好、操作簡便，可用于巴西人參總皂苷的提取。

關(guān)鍵詞 巴西人參；低共熔溶劑；總皂苷；提取工藝；響應(yīng)面法

中圖分類號 R 284 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）22-0162-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.23.034

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Optimization of Deep Eutectic Solvents Extraction of Total Saponins from Pfaffia glomerata by Box-Behnken Response Surface Methodology

DONG Ming-ran1， LIU Jia2， XIA Nian-tong2 et al

（1.Institute of Medicinal Plant Development/Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100193;2. School of Pharmacy， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract ［Objective］ Response surface methodology was used to optimize the extraction process of total saponins from Pfaffia glomerata， providing reference for its further development and utilization.［Method］Taking amaranthaceous plant Pfaffia glomerata as the research object， total saponins were extracted using ultrasound assisted deep eutectic solvent method. Through single factor experiments， the molar ratio of urea to choline chloride， water content， liquid-solid ratio and extraction time were investigated，the total saponin yield was used as the evaluation index， and the Box-Behnken response surface methodology was used to optimize the extraction process of total saponins from Pfaffia glomerata.［Result］ The optimal process for ultrasound-assisted deep eutectic solvents extraction of total saponins from Pfaffia glomerata was established with the following parameters： urea to choline chloride ratio of 1∶1， water content of 38%， liquid-material ratio of 18∶1 （mL∶g）， and extraction time of 37 minutes. Under the conditions， the total saponin yield achieved was 6.26%. ［Conclusion］This method has high extraction efficiency， good repeatability and simple operation， and can be used for the extraction of total saponins from Pfaffia glomerata.

Key words Pfaffia glomerata;Deep eutectic solvents;Total saponins;Extraction process;Response surface methodology

巴西人參［Pfaffia glomerata（Spreng.）Pedersen］，又稱琺菲亞，莧科無柱莧屬植物，以干燥根部入藥，主要分布于南美洲熱帶雨林氣候帶，現(xiàn)在巴西、厄瓜多爾等地廣泛種植，2001年后在中國境內(nèi)成功引種^［1-2］。巴西人參是巴西戈伊亞斯地區(qū)常用的傳統(tǒng)草藥，巴西藥典中記載其廣泛應(yīng)用于各種疾病，如壯陽、傷口愈合、降血糖、抗腫瘤等^［3］?，F(xiàn)代研究表明巴西人參中主要含有三萜類及其皂苷^［4］、多糖類^［5］、甾酮及其苷類^［6］、黃酮及其苷類^［7］，還含有氨基酸、維生素等，其中皂苷類成分含量較高^［8］。

低共熔溶劑（deep eutectic solvents，DES）是一種由氫鍵結(jié)合形成的綠色環(huán)保、制備簡單、可生物降解、可回收利用的新型溶劑，具有熔點低、毒性低、密度大、溶解性良好等特性^［9］，近年來受到廣泛關(guān)注，可應(yīng)用于環(huán)境保護(hù)、中藥有效成分的提取^［10］、分離^［11］等方面，前景廣闊。目前提取巴西人參皂苷類成分大多采用甲醇^［12］、乙醇^［13］等有機(jī)溶劑，而采用超聲輔助DES法提取巴西人參中大量總皂苷鮮有研究。因此，該研究首先比較了不同的低共熔溶劑體系提取巴西人參總皂苷的能力，再通過單因素試驗考察，設(shè)計響應(yīng)面試驗方案，對提取工藝進(jìn)一步篩選優(yōu)化，最終確定最優(yōu)提取工藝，獲得高含量高質(zhì)量的巴西人參總皂苷提取物，為下一步藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究以及巴西人參相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)和資源利用提供一定的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試材。巴西人參購于寧波琺菲亞食品有限公司，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所李海濤研究員鑒定為莧科植物巴西人參［Pfaffia glomerata （Spreng.） Pedersen］的干燥根，采用高速粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過3號標(biāo)準(zhǔn)篩（50目，孔徑0.3 mm），得到巴西人參細(xì)粉，備用。

1.1.2 試劑。總皂苷檢測試劑盒，購于南京集測生物科技有限公司；氯化膽堿（純度≥98%）、尿素（純度≥99%），均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；高氯酸，購于天津市鑫源化工有限公司；冰醋酸，購于天津市永大化學(xué)試劑有限公司；甲醇，購于天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；所用試劑均為分析純；水為純化水。

1.1.3 儀器與設(shè)備。Cary 100型變溫紫外分光光度計（安捷倫科技有限公司）；HH-S6A型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；JNB-30002型電子天平（寧波群安實驗儀器有限公司）；JHBE-50T型閃式提取器（上海釩幟精密儀器設(shè)備有限公司）；98-1-B型電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；KQ-500DE型超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司，功率600 W，頻率40 kHz）。

1.2 試驗方法

1.2.1 DES制備。DES制備采用加熱攪拌法，氯化膽堿氫鍵受體（HBA）與尿素氫鍵供體（HBD）以一定的摩爾比混合，加熱至80 ℃，連續(xù)攪拌，二者由固體熔融形成穩(wěn)定、均一、透明的液體，再向體系中加入體積分?jǐn)?shù)20%的蒸餾水，即得DES，室溫下存儲備用。溶液依次編號DES1～4，HBD與HBA的摩爾比見表1。

1.2.2 巴西人參總皂苷提取。

1.2.2.1

DES溶液提取。稱取巴西人參細(xì)粉20 g，加入600 mL含水量30%的DES溶液，30 ℃超聲提取40 min，8層紗布過濾后，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 對照提取試驗。以體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇為溶劑進(jìn)行對照提取試驗。

熱回流：稱取巴西人參細(xì)粉20 g，加入400 mL 70%乙醇，加熱回流提取1 h，8層紗布過濾，收集濾液；向濾渣中加入200 mL 70%乙醇，繼續(xù)加熱回流提取1 h，8層紗布過濾，合并2次濾液，保存?zhèn)溆谩?/p>

閃式提?。悍Q取巴西人參細(xì)粉20 g，加入400 mL 70%乙醇，閃式提取6 000 r/min，提取45 s，8層紗布過濾，收集濾液，保存?zhèn)溆谩?/p>

超聲提取：稱取巴西人參細(xì)粉20 g，加入400 mL 70%乙醇，超聲提取40 min，8層紗布過濾，收集濾液，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3

總皂苷含量測定。根據(jù)試劑盒說明，配制濃度為1 mg/mL 的人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品母液。分別移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品母液置于6個1 mL容量瓶中，加入甲醇定容，混勻，得到不同濃度梯度的人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別移取0.2 mL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液、0.2 mL 檢測試劑、0.8 mL高氯酸置于5 mL離心管中，55 ℃水浴20 min。精密移取反應(yīng)液200 μL置于5 mL離心管中，加入1 mL冰醋酸，充分混勻，589 nm下測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（y）、總皂苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為y=0.680 5x-0.005 3（R2=0.998 2）。

精密移取0.2 mL提取液、0.2 mL檢測試劑、0.8 mL高氯酸置于5 mL離心管中，55 ℃水浴20 min。精密移取反應(yīng)液200 μL置于5 mL離心管中，加入1 mL冰醋酸，充分混勻，589 nm下測定吸光度。總皂苷得率計算方法如下：

總皂苷得率=ρ×V×nm×100%

式中：ρ為測定的巴西人參總皂苷質(zhì)量濃度（mg/mL）；V為提取液體積（mL）；n為稀釋倍數(shù)；m為巴西人參細(xì)粉質(zhì)量（g）。

1.2.4 單因素試驗。按照“1.2.2”項下巴西人參總皂苷提取工藝，以總皂苷得率為評價指標(biāo)，分別以不同尿素與氯化膽堿摩爾比（1∶2、1∶1、2∶1、4∶1）、含水量（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%）、液料比［10∶1、20∶1、30∶1、40∶1（mL∶g）］、提取時間（20、30、40、50、60 min）進(jìn)行單因素試驗，以此確定各因素的最適條件和優(yōu)化范圍。

1.2.5

響應(yīng)面試驗?；趩我蛩卦囼灲Y(jié)果，以含水量、液料比、提取時間為自變量，總皂苷得率（Y）為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗，利用GraphPad Prism 9.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 尿素與氯化膽堿摩爾比篩選。從圖1可以看出，隨著尿素與氯化膽堿體系摩爾比的增大，巴西人參總皂苷得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在摩爾比為1∶1 時得率最高，隨著摩爾比增大，巴西人參總皂苷得率有所降低，這是因為尿素作為氫鍵供體的比例升高會導(dǎo)致氯化膽堿作為氫鍵受體的比例降低，氫鍵結(jié)合強(qiáng)度逐漸減弱，致使活性成分與溶劑間的作用減弱，提取總皂苷能力下降。因此，確定DES體系中尿素與氯化膽堿摩爾比1∶1為最佳比例。

2.1.2

含水量對巴西人參總皂苷得率的影響。含水量對DES體系黏性和極性有較大影響^［14］。由圖2可知，隨著DES體系含水量增大，巴西人參總皂苷得率呈先上升后下降的趨勢；在含水量40%時得率最高，但隨著含水量繼續(xù)增大，總皂苷得率反而下降，這是因為水分極大影響DES體系黏性，改變?nèi)軇O性，促進(jìn)皂苷成分溶解，但含水量過高則會破壞氫鍵間相互作用，導(dǎo)致DES體系不穩(wěn)定，提取總皂苷能力下降。因此，選擇含水量30%、40%、50%作為響應(yīng)面優(yōu)化試驗的3個水平。

2.1.3

液料比對巴西人參總皂苷得率的影響。由圖3可知，巴西人參總皂苷得率隨著液料比的增大而提高，當(dāng)液料比為20∶1 時，總皂苷得率達(dá)到最高值，隨著液料比繼續(xù)增加，總皂苷得率逐漸下降，可能是由于提取溶劑較少時，巴西人參活性成分無法充分溶出，提取溶劑過多時，部分雜質(zhì)也被溶出，導(dǎo)致巴西人參總皂苷的溶解度降低。因此，選擇液料比為10∶1、20∶1、30∶1進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗。

2.1.4

提取時間對巴西人參總皂苷得率的影響。由圖4可知，提取時間對巴西人參總皂苷得率影響相對較小。超聲提取20 min后，巴西人參總皂苷得率較低，提取40 min后，巴西人參總皂苷得率較高，但隨著提取時間延長，長時間超聲作用會導(dǎo)致DES體系黏度降低，電導(dǎo)率改變，提取得率降低。因此，選擇提取時間30、40、50 min進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗。

2.2 響應(yīng)面試驗

2.2.1

響應(yīng)面試驗結(jié)果與方差分析。分析響應(yīng)面試驗結(jié)果（表2），得到巴西人參總皂苷提取得率方程為Y=6.46-0.150A-0.085B-0.088C+0.120AB-0.085AC+0.030BC-0.46A2-0.43B2-0.14C2。

方差分析結(jié)果（表3）表明，該多元函數(shù)回歸方程 P=0.002 0極顯著，失擬項 P=0.050 3 不顯著，R2=0.937 1，CV=2.50%，表明上述巴西人參總皂苷提取得率方程相關(guān)性強(qiáng)、可信度高，預(yù)測值與實際值之間高度擬合，可用于巴西人參總皂苷提取工藝優(yōu)化分析。根據(jù)P值可以得出，二次項A2、B2對巴西人參總皂苷得率具有極顯著的影響（P＜0.01）；一次項A對巴西人參總皂苷得率有顯著的影響（P＜0.05）；一次項B、C，二次項C2和交互項 AB、AC、BC 對巴西人參總皂苷得率的影響不顯著（P＞0.05）。根據(jù)F值可以判斷各因素影響程度為A（含水量）＞C（提取時間）＞B（液料比）。

從圖5可以看出，含水量與液料比交互作用對得率的影響呈拋物面，當(dāng)其中一個因素不變時，得率隨另一因素增加先上升后下降；通過對比發(fā)現(xiàn)，液料比對得率影響更顯著，曲面波動幅度較大。圖6顯示含水量與提取時間交互作用中，等高線呈橢圓形，表明兩因素交互對得率的影響顯著；總皂苷得率隨含水量和提取時間的增加均呈現(xiàn)先增后減的變化趨勢。圖7顯示液料比與提取時間交互作用中，等高線趨于圓形，說明液料比與提取時間的交互作用對巴西人參總皂苷得率的影響不顯著，與方差分析結(jié)果一致。

2.2.2

最佳工藝驗證試驗。通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗回歸模型擬合出巴西人參總皂苷的最佳提取條件為含水量38.48%、液料比18.70∶1、提取時間37.11 min，此條件下巴西人參總皂苷得率預(yù)測值為6.49%?？紤]實際操作可行性，將提取條件調(diào)整為含水量38%、液料比18∶1、提取時間37 min，并進(jìn)行條件驗證，得出巴西人參總皂苷得率實際值為6.26%，接近預(yù)測值，表明該試驗回歸模型準(zhǔn)確，可用于巴西人參總皂苷提取工藝優(yōu)化。

2.3 不同提取方法效果比較

選擇乙醇超聲提取法、乙醇閃式提取法和乙醇熱回流提取法，與超聲輔助DES提取法進(jìn)行對比。從圖8可以看出，超聲輔助DES提取法得到的巴西人參總皂苷得率明顯高于其他3種方法。

3 結(jié)論

以巴西人參總皂苷得率為評價指標(biāo)，在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面法確定超聲輔助DES法提取巴西人參總皂苷的最佳工藝為尿素∶氯化膽堿1∶1、含水量38%、液料比18∶1（mL∶g）、超聲提取37 min，在此條件下，總皂苷得率為6.26%。各因素對巴西人參總皂苷得率影響程度從大到小為含水量、提取時間、液料比。不同提取方法對比結(jié)果表明，采用超聲輔助DES法提取巴西人參總皂苷

得率較高，提取效果優(yōu)于單獨使用超聲、熱回流、閃式提取。

該試驗工藝不僅可以明顯提升巴西人參總皂苷的提取效率與得率，還減少了原材料的浪費，實現(xiàn)資源利用的最大化，為促進(jìn)巴西人參資源的綜合利用、開發(fā)巴西人參系列產(chǎn)品提供了重要的數(shù)據(jù)支撐和方法學(xué)依據(jù)，也為其他天然活性成分的綠色提取提供技術(shù)參考。

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