【摘要】相信大家對于結(jié)核病都不陌生，它是一種以結(jié)核分枝桿菌為病原體的慢性傳染病，以肺部結(jié)核感染最為常見，可侵及多個臟器。排菌者為其重要的傳染源，通過把含有結(jié)核菌的微粒排到空氣中形成飛沫傳播。結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)（T-SPOT.TB）是檢測結(jié)核的新技術(shù)，近年，很多醫(yī)院采用T-SPOT.TB對結(jié)核感染進(jìn)行篩查，現(xiàn)對該技術(shù)進(jìn)行簡要介紹。

【關(guān)鍵詞】結(jié)核；T細(xì)胞斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)

【中圖分類號】R52 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】2096-2665.2024.22.0145.02

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2024.22.048

結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)（T-SPOT.TB）被用于結(jié)核感染檢測、肺結(jié)核/肺外結(jié)核診斷與鑒別診斷，具有以下獨(dú)特優(yōu)勢：首先，特異性好。僅對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群敏感，而對絕大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌和卡介苗（BCG）無交叉反應(yīng)。其次，靈敏度高?；静皇苊庖吖δ艿拖碌挠绊懀诜瓮饨Y(jié)核患者中檢出率較高。最后，操作簡便、結(jié)果快速。只需簡單的血液檢測，24 h內(nèi)就可以得到報告結(jié)果。

1 T-SPOT.TB檢測的適應(yīng)證

T-SPOT.TB主要針對結(jié)核分枝桿菌潛伏感染和活動性結(jié)核病的輔助診斷。

T-SPOT.TB在活動性結(jié)核病輔助診斷中的應(yīng)用：肺結(jié)核診斷以病原學(xué)、病理學(xué)結(jié)果為確診依據(jù)。對于缺少細(xì)菌學(xué)診斷依據(jù)（如痰培養(yǎng)陰性）的活動性結(jié)核病的患者，T-SPOT.TB可起到補(bǔ)充或輔助診斷的作用。出現(xiàn)腹腔積液或胸腔積液的患者，可采用體液或組織標(biāo)本來補(bǔ)充或輔助診斷結(jié)核性胸膜炎或結(jié)核性腹膜炎。

T-SPOT.TB在結(jié)核潛伏感染輔助診斷中的應(yīng)用：結(jié)核潛伏感染（LTBI）指的是一種機(jī)體對結(jié)核分枝桿菌（MTB）抗原刺激產(chǎn)生持續(xù)的免疫應(yīng)答，但無明顯活動性結(jié)核病臨床表現(xiàn)的狀態(tài)。在實(shí)際臨床中，感染者往往沒有結(jié)核病的任何癥狀和體征，痰液等標(biāo)本的抗酸染色涂片和培養(yǎng)均為陰性，影像學(xué)檢查也正常。LTBI不具有傳染性，但機(jī)體免疫狀態(tài)發(fā)生改變后可進(jìn)展為活動性結(jié)核病。而在某些情況下，MTB可以一直呈潛伏感染而不發(fā)病，長期處于休眠狀態(tài)，但其仍具備重新致病的能力，其是否進(jìn)展為活動性結(jié)核病與患者機(jī)體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)。

2 T-SPOT.TB的檢測原理

結(jié)核分枝桿菌感染的免疫應(yīng)答反應(yīng)以細(xì)胞免疫為主，感染者的T細(xì)胞受結(jié)核抗原刺激致敏，形成活化的效應(yīng)T細(xì)胞。T-SPOT.TB運(yùn)用γ-干擾素釋放試驗(yàn)（IGRA）技術(shù)，檢測被結(jié)核分枝桿菌特異的早期分泌靶抗原6（ESAT-6）和培養(yǎng)濾液蛋白10（CFP10），分別刺激全血中的T細(xì)胞。結(jié)核感染者及既往感染者血液中的T細(xì)胞再次接收到抗原刺激，會迅速形成效應(yīng)T細(xì)胞，并分泌γ-干擾素。通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT），分泌的γ-干擾素被預(yù)包在反應(yīng)孔膜上的特異抗體捕獲，將可溶的底物溶液加入每個檢測孔中，在反應(yīng)部位被酶分解形成不溶性色素沉淀斑點(diǎn)。每一個斑點(diǎn)代表一個分泌γ-干擾素的T細(xì)胞，計數(shù)斑點(diǎn)數(shù)量可以獲得外周血中結(jié)核致敏的T細(xì)胞數(shù)量。通過檢測結(jié)核致敏的T細(xì)胞數(shù)量，輔助診斷結(jié)核感染。

3 T-SPOT.TB結(jié)果判讀

T-SPOT.TB實(shí)驗(yàn)設(shè)有陰性對照孔、以植物血凝素（PHA）作為刺激原的陽性對照孔及ESAT-6和CFP10作為刺激原的兩個實(shí)驗(yàn)孔A和B；實(shí)驗(yàn)結(jié)果用每25萬個外周血單個核細(xì)胞中斑點(diǎn)形成細(xì)胞（SFCs）的數(shù)目來判斷陰陽性結(jié)果：一般來說，在手工放大鏡、4倍物鏡顯微鏡或USB電子放大鏡下觀察到結(jié)合在底膜上的紫色點(diǎn)，中間色深、周圍有淺色暈的點(diǎn)才是實(shí)驗(yàn)結(jié)果的斑點(diǎn)；斑點(diǎn)計數(shù)儀是根據(jù)斑點(diǎn)顏色飽和度、直徑大小和顏色梯度進(jìn)行斑點(diǎn)的判讀。根據(jù)抗原A孔或抗原B孔的斑點(diǎn)數(shù)判讀結(jié)果：當(dāng)空白對照孔斑點(diǎn)數(shù)為0～5個時且（抗原A孔或抗原B孔班點(diǎn)數(shù)）減去（空白對照孔班點(diǎn)數(shù)）≥6，為“陽性”。當(dāng)空白對照孔斑點(diǎn)數(shù)為6～10個時且（抗原A孔或抗原B孔斑點(diǎn)數(shù)）≥2X（空白對照孔班點(diǎn)數(shù)），為“陽性”。如不符合上述標(biāo)準(zhǔn)，且陽性對照孔正常時檢測結(jié)果為“陰性”。無效結(jié)果：當(dāng)陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)>10個或當(dāng)陽性對照孔斑點(diǎn)數(shù)<20個時為“不確定”結(jié)果，需要復(fù)查。陰性對照孔和陽性對照孔具有指示整體實(shí)驗(yàn)情況是否正常的作用。如果一批結(jié)果陰性對照孔有較多斑點(diǎn)，很有可能實(shí)驗(yàn)過程中存在污染；如果一批結(jié)果陽性對照孔沒有斑點(diǎn)或斑點(diǎn)較少，那需要懷疑細(xì)胞整體反應(yīng)是否異?；蛘叩?天是否出現(xiàn)操作失誤等?！盎覅^(qū)”：當(dāng)陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)為0～5個并且A或B斑點(diǎn)數(shù)減去陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)等于5～7個時，此結(jié)果被認(rèn)為是“灰區(qū)”。如果得到“灰區(qū)”結(jié)果，不能認(rèn)為是“不確定”結(jié)果，也就是說處在5、6、7個斑點(diǎn)的結(jié)果仍然是有效的結(jié)果，應(yīng)該按照我們的“結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)”來確定“陰性”或“陽性”。應(yīng)當(dāng)利用所有可利用的相關(guān)臨床信息進(jìn)行判斷，并跟其主治醫(yī)師進(jìn)行溝通后再報結(jié)果，必要時進(jìn)行復(fù)查。

陽性對照孔和陰性對照孔作為T-SPOT.TB實(shí)驗(yàn)的質(zhì)控，是判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否有效的標(biāo)準(zhǔn)，每個患者都須做陰性對照孔和陽性對照孔。陽性對照孔具有正常反應(yīng)性，說明參與反應(yīng)的細(xì)胞有正常的免疫功能，大部分人群對植物血凝素都有反應(yīng)，可能會存在少數(shù)人群對植物血凝素不敏感導(dǎo)致陽性對照孔沒有反應(yīng)或反應(yīng)弱。陰性對照孔正常則說明參與反應(yīng)的細(xì)胞在沒有外界刺激下是一個穩(wěn)定的狀態(tài)，不會有任何免疫應(yīng)答反應(yīng)，大部分人群陰性對照孔不會出斑點(diǎn)，也同樣存在少數(shù)人在沒有外界刺激的情況下細(xì)胞有反應(yīng)而釋放γ-干擾素，導(dǎo)致陰性孔出現(xiàn)較多斑點(diǎn)。

4 T-SPOT.TB的臨床意義

4.1 陽性結(jié)果

首先，臨床有典型結(jié)核癥狀，影像學(xué)等檢查支持結(jié)核病，且臨床排除其他疾病，陽性結(jié)果支持活動性結(jié)核病。其次，臨床有典型結(jié)核癥狀，但檢查手段未發(fā)現(xiàn)結(jié)核患病證據(jù)，且排除其他疾病，陽性結(jié)果支持結(jié)核分枝桿菌感染診斷，建議試驗(yàn)性抗結(jié)核治療。再次，臨床無結(jié)核癥狀及其他結(jié)核患病證據(jù)，陽性結(jié)果臨床診斷為潛伏性結(jié)核感染（LBTI），根據(jù)風(fēng)險程度決定是否用藥。最后，既往有結(jié)核病史或明確結(jié)核病證據(jù)，無結(jié)核癥狀，陽性表明曾患過結(jié)核病，不代表目前有活動性結(jié)核病。

4.2 陰性結(jié)果

首先，陰性結(jié)果代表目前機(jī)體沒有結(jié)核分枝桿菌特異抗原致敏的T淋巴細(xì)胞，即目前未感染結(jié)核分枝桿菌。臨床診斷上首先排除結(jié)核病。其次，有假陰性可能，如窗口期、免疫功能不全（HlV感染者）、特殊肺外結(jié)核（結(jié)腦）、實(shí)驗(yàn)非正常操作。