乳果糖是由半乳糖和果糖以β-1，4-糖苷鍵連接而成的二糖，化學(xué)式為C12H22O11，是乳糖的異構(gòu)化產(chǎn)物。市售乳果糖多為微黃色透明糖漿，具有甜味（蔗糖的60%-80%）、水溶性。此外，與乳糖相比，乳果糖具有更高的甜味和醇溶性，并且在酸熱條件下具有高穩(wěn)定性，這一特點(diǎn)可使其用作酸性食品的益生元補(bǔ)充劑。乳果糖天然存在，可在加熱牛乳過(guò)程中產(chǎn)生，但含量甚微。服用后，可不被胃酸消化分解直達(dá)小腸，經(jīng)腸道微生物發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸（主要為乙酸、丙酸、丁酸），降低腸道微生態(tài)PH，改善腸道微生態(tài)，促進(jìn)益生菌生長(zhǎng)，抑制有害菌，并且具有潤(rùn)腸通便等功效。在醫(yī)學(xué)上，乳果糖經(jīng)常被用來(lái)肝性腦病、便秘和腹瀉等疾病的治療，且安全性高，無(wú)任何負(fù)面作用。

乳果糖的制備方法主要有三類：化學(xué)異構(gòu)法、電活化技術(shù)、酶法。化學(xué)異構(gòu)法具有轉(zhuǎn)化率高、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，是目前唯一工業(yè)化的乳果糖制備方法。其原理為乳糖在強(qiáng)堿性條件下發(fā)生Lobry-de Bruyn-van Ekenstein反應(yīng)，使其結(jié)構(gòu)中的葡萄糖基團(tuán)異構(gòu)成為果糖基團(tuán)。硼酸是該法中最常用且轉(zhuǎn)化率最高的催化劑，但硼酸的大量添加也使得后續(xù)精制過(guò)程的難度急劇增加，這是限制乳果糖制備規(guī)模增加的一個(gè)重要原因。電活化技術(shù)是一種新興的乳果糖制備技術(shù)，具有安全、環(huán)保、清潔、綠色等特點(diǎn)。該反應(yīng)在施加電場(chǎng)的反應(yīng)器中進(jìn)行，施加電場(chǎng)后，陰極一端將產(chǎn)生適于乳果糖異構(gòu)的強(qiáng)堿性條件，且無(wú)需加入催化劑，降低了后續(xù)脫鹽和純化工序的難度，但仍存在于轉(zhuǎn)化率較低的問(wèn)題。酶法合成乳果糖一般條件溫和，被認(rèn)為是一種可克服化學(xué)法合成局限性和問(wèn)題的友好替代方法，糖苷水解酶和纖維二糖差向異構(gòu)酶是兩種被報(bào)道可用于制備乳果糖的兩種酶。本文綜合目前已有報(bào)道，對(duì)乳果糖酶法合成工藝研究進(jìn)展做出綜述。

1.β-半乳糖苷酶

β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase）可催化乳糖水解為半乳糖和果糖，該酶在催化乳糖水解的過(guò)程中還伴隨著轉(zhuǎn)苷反應(yīng)，生成乳果糖。β-半乳糖苷酶法是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)可用于制備乳果糖的生物酶，存在多種來(lái)源，包括嗜熱古細(xì)菌、礦硫化葉菌、黑曲霉、克魯維酵母等。其合成機(jī)理可具體解釋為β-半乳糖苷酶利用乳糖和D-果糖為底物，通過(guò)轉(zhuǎn)苷反應(yīng)，解離出1分子D-葡萄糖后的半乳糖基團(tuán)再通過(guò)縮合1分子D-果糖而形成乳果糖，最終產(chǎn)物包括乳果糖、D-葡萄糖、D-半乳糖等。20世紀(jì)70年代末，Vaheri和Kaupinnen使用脆壁酵母（Saccharomyces fragilis）來(lái)源的β-半乳糖苷酶催化乳糖的轉(zhuǎn)苷反應(yīng)，乳果糖的產(chǎn)量?jī)H為7.8g/L，得率約為3%。2009年，有研究顯示，米曲霉來(lái)源的β-半乳糖苷酶具有較高的轉(zhuǎn)苷活性，制備的乳果糖含量約為65g/L，但該法由于轉(zhuǎn)化率低和后續(xù)純化難度大等原因而無(wú)法大規(guī)模應(yīng)用。

2.β-葡糖苷酶

20世紀(jì)末，有研究發(fā)現(xiàn)來(lái)源于強(qiáng)烈熾熱球菌（Pyrococcus furiosus）的β-葡糖苷酶具有與β-半乳糖苷酶類似的轉(zhuǎn)苷活性，可催化轉(zhuǎn)苷反應(yīng)用于制備乳果糖。在隨后的研究中，研究人員又將乳果糖的產(chǎn)量提升到了15.0g/L。由此可見(jiàn)，β-葡糖苷酶雖具有轉(zhuǎn)苷特性，但其活性較低，轉(zhuǎn)化率同樣較低。因此，β-葡糖苷酶并未引起業(yè)界的廣泛關(guān)注。

3.纖維二糖差向異構(gòu)酶

纖維二糖差向異構(gòu)酶在厭氧瘤胃細(xì)菌白色瘤胃細(xì)菌（Ruminococcus albus）的培養(yǎng)液中被首次發(fā)現(xiàn)，隨研究的深入，多種來(lái)源的纖維二糖差向異構(gòu)酶被發(fā)現(xiàn)，包括溶纖維真細(xì)菌（Eubacterium cellulosolvens）、脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis）等。纖維二糖差向異構(gòu)酶具有差向異構(gòu)作用，可以β-1，4-糖苷鍵連接的纖維二糖、乳糖、D-葡萄糖等為催化底物，并作用于該類低聚糖的還原末端，生成差向異構(gòu)體，同時(shí)又能將醛糖異構(gòu)化為酮糖。研究報(bào)道，纖維二糖差向異構(gòu)酶可以乳糖為唯一底物制備乳果糖，在適當(dāng)條件下可將乳果糖轉(zhuǎn)化率提升至58%，乳果糖濃度高達(dá)406g/L，并且該體系中添加硼酸可將乳果糖轉(zhuǎn)化率進(jìn)一步提升至88%，此時(shí)反應(yīng)體系中乳果糖濃度為616g/L。由此可見(jiàn)，纖維二糖差向異構(gòu)酶是目前已有報(bào)道中最為高效合成乳果糖的酶，其轉(zhuǎn)化率可與化學(xué)方法相當(dāng)。與此同時(shí)，纖維二糖差向異構(gòu)酶還具有安全性高、無(wú)須添加多余底物、產(chǎn)物精制較為便捷等特點(diǎn)。因此，該酶具有工業(yè)化應(yīng)用潛力。但纖維二糖差向異構(gòu)酶同樣具有弊端，即當(dāng)溫度升高至80℃時(shí)，該酶表現(xiàn)出熱穩(wěn)定性差等特點(diǎn)，這一弊端也局限了其大規(guī)模應(yīng)用。

此外，使用纖維二糖差向異構(gòu)酶還可能會(huì)導(dǎo)致副產(chǎn)物依匹乳糖含量過(guò)高的問(wèn)題，而各國(guó)藥典和法律法規(guī)等則對(duì)其含量做出嚴(yán)格限制。因此，通過(guò)蛋白質(zhì)工程對(duì)纖維二糖差向異構(gòu)酶進(jìn)行改造以降低依匹乳糖產(chǎn)量是一可行思路，也愈加吸引各國(guó)學(xué)者的目光。Shen等使用定向進(jìn)化并對(duì)突變體進(jìn)行篩選后得到了不產(chǎn)生依匹乳糖的五位突變體。Park等首先分析了纖維二糖差向異構(gòu)酶酶活性中心與甘露糖基團(tuán)C-2的相互作用原理，隨后選擇兩個(gè)關(guān)鍵的殘基位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變，得到新的突變體，使用該突變體制備乳果糖可得到43.5%的轉(zhuǎn)化率。Shen等則對(duì)纖維二糖差向異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，雙位點(diǎn)突變可使酶在高溫下的活性半衰期提高4倍，最適反應(yīng)溫度提高7.5℃，底物催化效率提升29%。目前，相關(guān)研究尚不完善，但蛋白質(zhì)工程極具潛力，是一個(gè)較好的突破方向。

4.酶固定化技術(shù)

酶的催化過(guò)程具有高效和專一等特點(diǎn)，但部分酶離開(kāi)特定環(huán)境往往產(chǎn)生穩(wěn)定性差和不可重復(fù)利用等不利于生產(chǎn)的現(xiàn)象。因此，酶固定化技術(shù)愈加吸引人們的關(guān)注。酶固定化技術(shù)起源于20世紀(jì)初。1916年，Nelson等發(fā)現(xiàn)蔗糖酶可吸附在氧化鋁和焦炭上，并且仍然可以發(fā)揮催化作用。1969年，日本田邊制藥公司將米曲霉源氨基酰化酶固定化，并且在L-蛋氨酸生產(chǎn)中得到成功應(yīng)用。這也是世界首例工業(yè)化應(yīng)用的固定化酶。1971年，國(guó)際酶工程第一屆會(huì)議提出固定化酶概念，即經(jīng)過(guò)物理或化學(xué)方法處理，使得酶限定在某些固定的區(qū)域，保持其催化活性，并且可重復(fù)利用的酶。

固定化酶在穩(wěn)定性（pH穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性）、重復(fù)利用性、產(chǎn)物后續(xù)處理以及經(jīng)濟(jì)性方面具有無(wú)可比擬的優(yōu)越性。目前，酶的固定化技術(shù)由傳統(tǒng)的吸附法、共價(jià)結(jié)合法、包埋法、交聯(lián)法等向新型載體固定化技術(shù)（輻射處理固定法、光化學(xué)固定法、等離子體固定法和電化學(xué)聚合固定法）、無(wú)載體固定化酶技術(shù)（交聯(lián)溶解酶（CLDEs）、交聯(lián)酶晶體（CLECs）、交聯(lián)酶聚集體（CLEAs）和交聯(lián)噴霧干燥酶（CLSDs）以及定向固定化技術(shù)方向發(fā)展，而固定化酶載體隨著固定化技術(shù)研究的深入由傳統(tǒng)的物理吸附載體、共價(jià)連接載體、截留載體以及膠囊包埋載體等向磁性載體、納米材料載體、環(huán)境敏感性載體以及導(dǎo)電載體等新型載體材料方向發(fā)展。Wang等將纖維二糖差向異構(gòu)酶固定于Duolite A568樹(shù)脂上，經(jīng)吸附和交聯(lián)等完成固定，性能表征結(jié)果顯示，該固定化酶在50℃條件下，其活力可維持12h不受損失；在70℃條件下，反應(yīng)15批次仍然可以保留90%酶活?？梢?jiàn)，該固定化酶具有一定的應(yīng)用價(jià)值。此外，還可采用固定化細(xì)胞技術(shù)。Gu等使用枯草芽孢桿菌作為固定化載體，負(fù)載量1.47mg/1011個(gè)芽孢，負(fù)載率為79.4%，并使用該固定化酶進(jìn)行乳果糖的制備，產(chǎn)量可達(dá)395g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到56.4%，生產(chǎn)強(qiáng)度98.75g/（L·h），反復(fù)使用8 批次后可保留70%酶活。

結(jié)語(yǔ)

乳果糖具有多種優(yōu)異的生理功能特性，已經(jīng)在臨床醫(yī)藥行業(yè)、食品行業(yè)和動(dòng)物飼料行業(yè)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。目前，乳果糖的年世界產(chǎn)量超過(guò)60000t，荷蘭蘇威公司和日本森永乳業(yè)公司是兩大乳果糖生產(chǎn)企業(yè)。自乳果糖問(wèn)世以來(lái)，乳果糖在人們?nèi)粘Ｉ钪械膽?yīng)用越來(lái)越廣泛，這也對(duì)乳果糖的制備技術(shù)提出更高要求，各國(guó)學(xué)者和企業(yè)也在不斷推陳出新，旨在建立更安全、更環(huán)保、更高效、更節(jié)能的乳果糖制備技術(shù)體系。

目前，對(duì)乳果糖制備生產(chǎn)的研究主要集中于生產(chǎn)工藝、純化精制、功能研究以及高酶活性微生物篩選等方面。在工藝上，目前的關(guān)注點(diǎn)主要集中在提高酶的使用壽命和穩(wěn)定性以及后續(xù)精制純化過(guò)程。對(duì)于提高酶的使用壽命和穩(wěn)定性方面，固定化酶技術(shù)是一個(gè)主要的發(fā)展趨勢(shì)。在精制純化方面，目前的生產(chǎn)工藝往往導(dǎo)致產(chǎn)品中副產(chǎn)物或底物等含量過(guò)高，包括蔗糖、葡萄糖、乳糖和依匹乳糖等。這些物質(zhì)在理化性質(zhì)等方面和乳果糖存在一定的相似性，因此也導(dǎo)致了分離純化過(guò)程的難度和成本增加，極大地限制了乳果糖產(chǎn)業(yè)化和工業(yè)化的發(fā)展。色譜分離技術(shù)是當(dāng)前主要的分離純化技術(shù)，在進(jìn)行色譜分離純化前，首先應(yīng)考慮除去多量的乳糖，否則將產(chǎn)生乳糖結(jié)晶析出堵塞色譜柱的問(wèn)題。因此，業(yè)界人員也將目光投向了結(jié)晶乳果糖上。而結(jié)晶乳果糖制備難度較大，成本高等特點(diǎn)也成為了一個(gè)制約因素。在產(chǎn)酶微生物篩選方面，酶活力高、穩(wěn)定性高、產(chǎn)率高是微生物篩選上的目標(biāo)?？蒲腥藛T不僅對(duì)微生物來(lái)源方面進(jìn)行研究，同時(shí)還進(jìn)行了對(duì)現(xiàn)有菌株的誘變篩選以及基因工程菌株的構(gòu)建等方面的研究。

綜上，乳果糖的酶法制備還存在諸多技術(shù)難題與制約因素。酶法轉(zhuǎn)化作為一種可克服化學(xué)合成局限性和問(wèn)題的友好替代方法，在我國(guó)存在極大的應(yīng)用空間和市場(chǎng)潛力，但與此同時(shí)，乳果糖生產(chǎn)制備領(lǐng)域需要解決的問(wèn)題和填補(bǔ)的空白還有很多，仍需廣大科研人員持續(xù)關(guān)注和深入研究。