摘要：【目的】青岡（Quercus" glauca）和滇青岡（Q. glaucoides）為珍貴樹種，是東亞亞熱帶常綠闊葉林的重要建群種以及典型地理替代種，具有很高的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。開發(fā)其微衛(wèi)星（simple sequence repeats，SSR）引物有助于分析其群體遺傳格局及遺傳多樣性，為2種青岡林的管理和資源開發(fā)利用提供參考，也可為跨物種間的微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)提供借鑒。【方法】分別基于3株青岡和3株滇青岡植株的簡化基因組測序數(shù)據(jù)開發(fā)SSR引物。先后采用Stacks 2.0b軟件process_radtags模型和SciRoKo 3.4軟件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾和提取。利用Primer premier 6.0軟件設(shè)計(jì)SSR引物。【結(jié)果】使用pyRAD 3.0.66軟件對序列進(jìn)行聚類，共鑒定出217個(gè)SSR位點(diǎn)，其中35%（76個(gè)）的SSR位點(diǎn)在青岡和滇青岡中均具有多態(tài)性。設(shè)計(jì)并篩選出28對SSR引物，分別在兩個(gè)青岡群體和兩個(gè)滇青岡群體（共48個(gè)個(gè)體）中進(jìn)行巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增。開發(fā)的28對SSR引物分布在青岡10條染色體上，SSR引物均在青岡和滇青岡個(gè)體中成功擴(kuò)增，擴(kuò)增率達(dá)到了90.7%。SSR分型分析結(jié)果表明，從遺傳多樣性方面看，所開發(fā)的28對引物中，共有176個(gè)等位基因；引物的等位基因數(shù)為3～13，平均為6.29個(gè)；期望雜合度為0.223～0.886，觀察雜合度為 0.159～0.830?！窘Y(jié)論】利用簡化基因組數(shù)據(jù)可以快速、高效、經(jīng)濟(jì)地開發(fā)青岡和滇青岡通用微衛(wèi)星引物，為后續(xù)2種青岡群體遺傳學(xué)研究提供基礎(chǔ)。也證明利用簡化基因組測序數(shù)據(jù)，可開發(fā)近緣物種的通用微衛(wèi)星引物。

關(guān)鍵詞：青岡； 滇青岡； 微衛(wèi)星； 簡化基因組

中圖分類號：S795"""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

文章編號：1000-2006（2024）06-0062-09

Designing of microsatellite primers for" Quercus glauca" and"" Q. glaucoides （Fagaceae） based on" RAD-seq data

OUYANG Zeyi1，2， LI Zhihui1， MOU Honglin1， JIANG Xiaolong1， CHENG Yong3， WU Jiyou3*

（1.College of Forestry， Central South University of Forestry and Technology， Changsha 410116，" China；2. Hunan Botanical Garden， Changsha 410116， China; 3. Hunan Academy of Forestry， Changsha 410004，" China）

Abstract：

【Objective】Quercus glauca" and Q. glaucoides are valuable and dominant species in the subtropical evergreen broadleaf forests of East Asia. They represent typical geographical vicarious species with significant ecological and economic importance. Therefore， the development of SSR primers for these two species can facilitate the analysis of genetic patterns and genetic diversity for the management and resource development of evergreen broadleaf forests as well as provide a reference for the development of microsatellite markers across species. 【Method】This study developed SSR primers based on RADseq data from three Q. glauca and three Q. glaucoides individuals， respectively. The sequencing data were filtered and extracted using the process_radtags model in Stacks 2.0b software and SciRoKo 3.4 software sequentially. SSR primers were designed using Primer premier V6.0 software.【Result】The sequences were clustered using pyRAD 3.0.66， identifying a total of 217 SSR loci， 35% （76） of which were polymorphic in both species. Twenty-eight SSR primer pairs were designed"" and validated in two Q. glauca populations and two Q. glaucoides populations （48 individuals in total） through nested polymerase chain reaction （PCR） amplification. The 28 SSR primer pairs are distributed across ten chromosomes of the Q. glauca genome and successfully amplified in Q. glauca and Q. glaucoides individuals， with an amplification rate of 90.7%. The SSR genotyping analysis detected a total of 176 alleles， with the number of alleles per primer ranging from 3 to 13， and an average of 6.29. The expected and observed heterozygosity of the primers ranged from 0.223 to 0.886 and from 0.159 to 0.830， respectively. 【Conclusion】The universal microsatellite primers developed in this study using RADseq data for Q. glauca and Q. glaucoides provide a basis for further population genetics studies of these species. In addition， this study demonstrates that RADseq data can be employed to rapidly， efficiently， and be used to" cost-effectively develop universal microsatellite primers for closely related species.

Keywords：Quercus glauca; Quercus glaucoides; microsatellite; RAD-seq

櫟屬（Quercus）約有450種，在北半球不同生境中廣泛分布，是溫帶落葉闊葉林及熱帶、亞熱帶常綠闊葉林的優(yōu)勢樹種[1]。國家林業(yè)和草原局的森林調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，櫟類植物的分布面積和生物量大，占中國森林的10%以上。櫟屬植物在木材供應(yīng)、環(huán)境綠化、涵養(yǎng)水源和水土保持等方面起到十分重要的作用[2]。因此，研究櫟屬的分類、種群結(jié)構(gòu)及遺傳歷史也成為諸多學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)[3]。根據(jù)最新的分類系統(tǒng)，櫟屬主要包括櫟亞屬（Subgen. Quercus）和栓皮櫟亞屬 （Subgen. Cerris）。栓皮櫟亞屬包括3個(gè)組：Sect. Cyclobalanopsis、Cerris和Ilex[1]。青岡組（Sect. Cyclobalanopsis）是栓皮櫟亞屬的基部類群，約有100種，中國西南地區(qū)是青岡組的物種多樣性中心[4]。青岡（Quercus glauca）和滇青岡（Q. glaucoides）隸屬于櫟屬青岡組（Q. sect. Cyclobalanopsis），是東亞亞熱帶常綠闊葉林重要建群種，也是中國-喜馬拉雅植物亞區(qū)和中國-日本森林亞區(qū)間的典型地理替代種[4]。滇青岡分布的海拔普遍比青岡高，在滇中高原南緣還存在小范圍的鑲嵌分布[5]。兩者在形態(tài)上極為相似，但存在有少量穩(wěn)定的分類特征[4]：如青岡的葉多為倒卵形、葉被為平伏“丁字毛”、殼斗外壁毛被較為稀疏；滇青岡葉為卵形，葉被的“丁字毛”長而卷曲，殼斗外壁具有明顯的灰黃色毛?；瘮?shù)據(jù)顯示，這2種自中新世以來就廣布于東亞亞熱帶[6-7]。這2種都具有重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值，了解、比較其遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳分化對青岡和滇青岡種質(zhì)資源的開發(fā)與利用具有重要指導(dǎo)意義。

微衛(wèi)星（microsatellite，MS）又稱簡單序列重復(fù)（simple sequnce repeat，SSR），廣泛分布于真核生物和部分原核生物的基因組中[8]。SSR遺傳標(biāo)記自20世紀(jì)90年代始，就應(yīng)用于鑒定親子關(guān)系、親緣關(guān)系以及種質(zhì)資源[9]。利用高通量測序數(shù)據(jù)是目前開發(fā)SSR引物的主要方法。簡化基因組測序數(shù)據(jù)為基因組信息缺乏物種的SSR引物開發(fā)提供了可能性[10]。此外，簡化基因組測序技術(shù)可直接利用測序序列設(shè)計(jì)SSR引物；僅需通過1次測序即可獲得數(shù)以萬計(jì)的多態(tài)性標(biāo)記，得到更多的SSR位點(diǎn)[11]。因此，基于簡化基因組測序數(shù)據(jù)開發(fā)SSR引物的方法被應(yīng)用于高等植物的SSR引物開發(fā)中，例如嶺南青岡（Q. championii）[12]、金銀花（Lonicera japonica）[13]、疣柄魔芋（Amorphophallus paeoniifolius）[14]、花錨（Halenia corniculata）[15]等植物。不過，目前的高通量測序開發(fā)SSR引物主要針對單個(gè)物種，對開發(fā)適用于不同物種的SSR通用引物的研究還較少。

本研究旨在基于簡化基因組測序數(shù)據(jù)，開發(fā)適用于青岡和滇青岡群體的SSR引物。青岡和滇青岡作為中國亞熱帶常綠闊葉林建群種，開發(fā)群體的通用SSR引物可以用于其群體遺傳格局及遺傳多樣性的探究，進(jìn)而對常綠闊葉林的管理及經(jīng)營提供參考。此外，進(jìn)一步研究對揭示中國-日本植物亞區(qū)和中國喜馬拉雅植物亞區(qū)的物種形成與演化也具有重要意義。同時(shí)，該研究也可為跨物種的SSR引物開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1. 1 建庫以及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證樣本

選擇青岡和滇青岡各3株樣本進(jìn)行SSR引物設(shè)計(jì)。為獲得更多的遺傳變異信息，6株樣本來自不同群體。滇青岡3株樣本分別來自云南省晉寧區(qū)、巧家縣和廣南縣群體；青岡3株樣本來自浙江省遂昌縣、江西省吉安市和西藏自治區(qū)察隅縣群體。另選擇青岡和滇青岡2個(gè)群體，每群體12單株對設(shè)計(jì)的SSR引物進(jìn)行驗(yàn)證。滇青岡群體來自廣西壯族自治區(qū)隆林縣和云南省元謀縣；青岡群體采自于江西省鉛山縣和日本埼玉縣。樣本采集地地理信息見表1。

1.2 簡化基因組測序數(shù)據(jù)

使用DNeasy植物組織試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）對二氧化硅干燥后的樣本葉片進(jìn)行總DNA提取。利用限制性內(nèi)切酶Taq I（5′-T | CGA-3′）和Mse I（5′-T | TAA-3′）對提純后的總DNA進(jìn)行酶切，構(gòu)建雙酶切測序基因分型（ddGBS）文庫。利用Illumina NovaSeq 6000基因測序儀（美國）對長度為400～600 bp的片段進(jìn)行測序，測序模式為雙端150 bp（PE150）。

1.3 通用引物設(shè)計(jì)

為獲得高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)，采用Stacks 2.0b軟件process_radtags模型對原始Reads進(jìn)行過濾[16]。采用SciRoKo 3.4軟件[17]提取包含SSR序列的Reads。采用pyRAD 3.0.66軟件[18]對提取的reads進(jìn)行聚類，個(gè)體內(nèi)部和個(gè)體之間聚類時(shí)的堿基相似性閾值設(shè)為70%，每個(gè)聚類的最大插入缺失堿基數(shù)設(shè)為30。使用覆蓋深度大于3個(gè)序列的聚類進(jìn)行進(jìn)一步分析。為了避免某些個(gè)體的PCR擴(kuò)增失敗，去除SSR側(cè)翼序列中的轉(zhuǎn)換/顛換變異等位點(diǎn)。為確保側(cè)翼序列中有足夠的堿基用于引物設(shè)計(jì)，僅保留SSR重復(fù)區(qū)位于26～129 bp、重復(fù)區(qū)等位基因數(shù)≥2的位點(diǎn)用于引物設(shè)計(jì)。利用Primer premier 6.0[19]軟件設(shè)計(jì)SSR引物，設(shè)計(jì)好的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。為了獲得設(shè)計(jì)引物在染色體上的分布，使用BLAST將設(shè)計(jì)好的引物序列比對至青岡基因組上。

1.4 實(shí)驗(yàn)與分析驗(yàn)證

對待實(shí)驗(yàn)的正向引物5′ 端添加通用接頭序列M13（序列為TGTAAAACGACGGCCAGT）[20]。以提取的總DNA為模板，使用帶 M13 接頭的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用添加帶熒光標(biāo)記的M13引物對第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2次擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增體系如下：

第1輪PCR擴(kuò)增體系為20 μL：2×Power Taq PCR MasterMix 10 μL、正向F引物（10 μmol/L） 1 μL、反向R引物（10 μmol/L） 1 μL、植物樣本DNA 模板2 μL、ddH2O 6 μL。

以第1輪PCR產(chǎn)物為模板，繼續(xù)第2輪PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為2 μL：Taq 酶（5 U/μL） 0.4 μL、10×PCR buffer 0.1 μL、帶熒光標(biāo)記的M13引物（10 ng/μL） 0.5 μL、ddH2O 1.0 μL。

PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 45 s， 57 ℃（第2輪PCR反應(yīng)的退火溫度為57.1 ℃）退火45 s， 72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。

PCR擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，由生物公司使用自動(dòng)測序儀ABI 3730（美國，應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）測定產(chǎn)物長度。每個(gè)SSR標(biāo)記的等位基因長度使用Genemarker 2.2.0軟件進(jìn)行基因分型[21]。分別由GenAlEx 6[22]和Cernicalin 1.30[23]計(jì)算每對引物和4個(gè)群體的遺傳多樣性，包括等位基因數(shù)（NA）、期望雜合度（He）和觀察雜合度（Ho）。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于簡化基因組的青岡和滇青岡SSR位點(diǎn)開發(fā)

6個(gè)選定樣本的原始測序序列范圍為850萬～940萬條，過濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，序列范圍為770萬～840萬條。提取出含有SSR位點(diǎn)的序列，對樣本進(jìn)行聚類，并篩選出同源序列后，每個(gè)樣本中的基因座數(shù)量為20 415～33 170。在對所有樣本進(jìn)行樣本間聚類，結(jié)果共獲得1 808個(gè)位點(diǎn)（一致位點(diǎn)，表2）。使用Python腳本，對轉(zhuǎn)換/顛換序列進(jìn)行過濾，讀取位于前25或129 bp的SSR重復(fù)序列以及單堿基重復(fù)SSR，最終獲得217個(gè)位點(diǎn)。利用Primer premier 6.0設(shè)計(jì)了58對引物，篩選出28對引物（表3）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。這28對引物位于青岡基因組12條染色體中的10條上，其中2號、5號、6號和7號染色體包含SSR位點(diǎn)最多（均5個(gè)），9號和11號沒有SSR位點(diǎn)分布（圖1）。

2.2 青岡和滇青岡SSR通用引物分析

利用設(shè)計(jì)的28對通用引物對4個(gè)群體的48個(gè)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在兩輪PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測（以引物GS209為例，Marker均為1 000 bp，如圖2所示），檢測合格的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳分型。

根據(jù)熒光信號，采用Genemarker V2.2.0軟件對分型結(jié)果進(jìn)行讀取，以GS209引物為例，結(jié)果見圖3。

對SSR分型結(jié)果進(jìn)行讀取和校對后，統(tǒng)計(jì)4個(gè)采集地各 12 個(gè)樣本的擴(kuò)增成功率?？傮w上，所設(shè)計(jì)的28對引物在48個(gè)樣本中均具有很高的擴(kuò)增率（圖4）。其中，引物GS185、GS186和GS209的擴(kuò)增率在所有群體中都達(dá)到了100%， GS2、GS3、GS15、GS19、GS28、GS33、GS35、GS88、GS150、GS169和GS216共11對引物的擴(kuò)增率在3個(gè)群體中達(dá)到100%。從群體方面來看，云南地區(qū)的成功率均值為 83.64%，日本地區(qū)的為 91.96%，廣西地區(qū)為 93.75%，江西地區(qū)為93.46%，平均擴(kuò)增率為 90.7%（附表1，nldxb.njfu.edu.cn）。由此表明，這28對通用引物可以用于青岡和滇青岡跨物種的擴(kuò)增。

青岡和滇青岡的SSR引物多態(tài)性結(jié)果顯示，基序的堿基數(shù)量在2～6均有分布，其中2堿基重復(fù)的基序最多，有12個(gè)；其次是3堿基重復(fù)的基序有9個(gè)；4堿基重復(fù)的基序最少，僅有1個(gè)。重復(fù)次數(shù)總體上隨基序的堿基數(shù)的增多而減少。在所開發(fā)的28對引物中，共有176個(gè)等位基因，每個(gè)引物的等位基因數(shù)為3～13個(gè)，平均等位基因數(shù)為6.29個(gè)；期望雜合度范圍為0.223～0.886，觀察雜合度范圍在0.159～0.830，具體結(jié)果見表4。

等位基因數(shù)是反映群體遺傳變異大小的指標(biāo)之一。簡化基因組建庫樣本的等位基因數(shù)共有93個(gè)，每個(gè)引物的等位基因數(shù)為2～5個(gè)，平均為3.32個(gè)。

與實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)據(jù)相比，引物GS19、GS33、GS74、GS88和GS169所開發(fā)出的5個(gè)位點(diǎn)的簡化基因組建庫6個(gè)樣本的等位基因數(shù)（NAa）與實(shí)驗(yàn)樣本等位基因數(shù)（NAb）一致， GS2、GS3、GS15等引物所開發(fā)出的共計(jì)13個(gè)位點(diǎn)的NAa與 NAb基本一致（相差3個(gè)等位基因及以內(nèi)）（圖5）。說明這些位點(diǎn)的簡化基因組數(shù)據(jù)不僅可用于SSR引物開發(fā)，還可用于引物的等位點(diǎn)數(shù)大致評估，并避免了實(shí)驗(yàn)的繁瑣。同時(shí)，GS6、GS28、GS35、GS83和GS171這5個(gè)位點(diǎn)的NAa與 NAb差別很大（≥ 6），說明該位點(diǎn)的簡化基因組數(shù)據(jù)較少，未能檢測出大部分變異，故在引物篩選的時(shí)候需選擇更大的樣本。

3 討 論

設(shè)計(jì)出足夠數(shù)量的SSR標(biāo)記是物種親緣關(guān)系鑒定、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析及保護(hù)生物學(xué)研究等方面的基礎(chǔ)。近年來，簡化基因組測序已被較多地應(yīng)用于SSR引物的開發(fā)。本研究開發(fā)的青岡和滇青岡28對通用SSR引物驗(yàn)證結(jié)果顯示，引物都能成功擴(kuò)增并有多態(tài)性，引物平均等位位點(diǎn)為6.29。與先前基于簡化基因組測序數(shù)據(jù)在其他植物SSR引物開發(fā)相比，本研究結(jié)果具有較高的成功率。如，蘭進(jìn)茂等[24]基于簡化基因組測序開發(fā)了華蟹甲（Sinacalia tangutica）的SSR引物，在設(shè)計(jì)的200對引物中，只篩選出了20對（10%）的多態(tài)性引物；李慧等[13]開發(fā)了金銀花的SSR引物，288對引物在12個(gè)金銀花樣本中驗(yàn)證顯示72對（25%）引物具有多態(tài)性；Gao等[14]開發(fā)了疣柄魔芋的SSR引物，90對引物在31個(gè)個(gè)體中驗(yàn)證顯示23對（25%）引物有多態(tài)性；寧馨等[12]開發(fā)了嶺南青岡的SSR引物，25對引物在36個(gè)樣本中驗(yàn)證顯示17對（68%）引物具有多態(tài)性，引物平均等位位點(diǎn)為6.2。本研究能更高效地開發(fā)SSR引物的主要原因?yàn)橐镩_發(fā)時(shí)使用了個(gè)體間比對。通過3個(gè)青岡和2個(gè)滇青岡樣本間的比對，能直觀地篩選出存在變異的SSR位點(diǎn)及側(cè)翼序列保守的位點(diǎn)，這極大地減少了實(shí)驗(yàn)室篩選變異SSR位點(diǎn)的工作量。華蟹甲、金銀花和疣柄魔芋的SSR引物開發(fā)都未進(jìn)行個(gè)體間的比對，顯示出較低的篩選效率（lt;30%），而嶺南青岡和本研究的青岡和滇青岡SSR引物開發(fā)則進(jìn)行了個(gè)體間的比對，顯著提高了篩選效率（gt;65%）。

總的來說，基于簡化基因組測序開發(fā)SSR引物與其他方法相比有一定優(yōu)勢。首先，與傳統(tǒng)的磁珠吸附方法相比，基于簡化基因組開發(fā)SSR引物的方法能獲得更多類型的SSR，且篩選變異SSR位點(diǎn)的工作量也更少。其次，近緣種篩選法和數(shù)據(jù)庫搜索法雖然省略了SSR文庫構(gòu)建、篩選以及測序等步驟，但這兩種方法的不足是已知物種SSR引物比較有限，同時(shí)由于SSR位點(diǎn)的側(cè)翼序列也存在一定變異，SSR引物的種間通用性較差。第三，利用轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)SSR引物的方法最大的不足是數(shù)據(jù)量與實(shí)驗(yàn)量大，并且變異信息相對較少。由于轉(zhuǎn)錄組序列位于基因的編碼區(qū)，通常具有很高的保守性，為了獲得足夠的遺傳變異信息需要進(jìn)行大批量的實(shí)驗(yàn)篩選，而簡化基因組序列是基于全基因組DNA序列，覆蓋范圍更廣，并且具有更高的遺傳變異。同時(shí)，本研究使用了2個(gè)物種各3個(gè)樣本進(jìn)行樣本間的聚類，能有效提高篩選出具有多態(tài)性的SSR引物的概率，減少了SSR引物后期篩選實(shí)驗(yàn)的工作量。此外，轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)引物對實(shí)驗(yàn)材料的保存要求較高，而簡化基因組數(shù)據(jù)獲取的材料僅用硅膠干燥保存即可，這為珍貴物種的引物開發(fā)提供了便利。最后，傳統(tǒng)的單酶切簡化基因組測序數(shù)據(jù)存在著數(shù)據(jù)利用率低、可用于分析的序列數(shù)量少、基因座精度低的缺點(diǎn)，本研究采用了改進(jìn)的雙酶切簡化基因組測序技術(shù)，不但可提升測序效率，還可降低實(shí)驗(yàn)所需花費(fèi)。

但同時(shí)，利用簡化基因組開發(fā)引物也有一些不足。首先，雖然簡化基因組測序一次可以獲得數(shù)以萬計(jì)帶有SSR位點(diǎn)的片段，但是經(jīng)過過濾、篩選后，一致性位點(diǎn)在本研究中僅有1 808個(gè)，最終能用于設(shè)計(jì)引物的片段更是僅有217個(gè)。其原因可能是受到了限制性內(nèi)切酶的選擇、測序片段長度、引物設(shè)計(jì)的要求所限制。其次，對于超大的植物基因組（基因組大小超過10G），如牡丹（Paeonia suffruticosa）[25]等，為了獲取足夠的一致性位點(diǎn)，需要測大量的原始數(shù)據(jù)，這對計(jì)算機(jī)性能等方面要求較高。最后，隨著測序的迅速發(fā)展，大量全基因組的公布為開發(fā)引物提供便利，可以直接搜索并下載序列用于引物開發(fā)，省去了建庫、測序的麻煩，而且還能獲得更全的SSR位點(diǎn)信息。

基于以上存在的問題，為了更高效地開發(fā)引物，在簡化基因組測序過程仍需要注意以下2點(diǎn)：①根據(jù)基因組大小選擇合適的限制性核酸內(nèi)切酶。例如，針對小基因組，需要更多的含有SSR片段的序列設(shè)計(jì)引物，因此選擇酶切位點(diǎn)識別序列更短的酶進(jìn)行酶切，如雙堿基、三堿基酶切位點(diǎn)，具有廣譜性，在基因組上的分布范圍更廣，酶切后能獲得更多的原始序列；與之相反，若需開發(fā)超大基因組的SSR引物，則選擇如六堿基這樣的酶切位點(diǎn)識別序列更長的酶進(jìn)行酶切，以減少原始序列，節(jié)省計(jì)算資源。②選擇更長的測序模式。Illumina MiSeq小型測序儀經(jīng)過不斷優(yōu)化與更新，可以一次進(jìn)行250 bp（PE250）甚至300 bp（PE300）的讀取。采用該方法可以獲得更長的讀取，從而獲得更多的可用于設(shè)計(jì)引物的序列。

綜上所述，簡化基因組測序雖然在一些特殊情況下存在不足，但該技術(shù)有不需要物種的基因組信息、測序材料易保存、能以極低的價(jià)格獲得大量均勻分布于基因組上的變異位點(diǎn)等優(yōu)勢，仍然可以進(jìn)行一些近緣物種的SSR引物開發(fā)，能為雜交漸滲類群（例如櫟屬植物）的種群演化歷史等研究打下基礎(chǔ)，為開展群體遺傳學(xué)分析提供參考。

青岡和滇青岡作為東亞亞熱帶常綠闊葉林重要建群種以及典型地理替代種具有很高的研究價(jià)值。本研究分別基于3個(gè)青岡和3個(gè)滇青岡植株的簡化基因組數(shù)據(jù)，首先設(shè)計(jì)出28對SSR引物，然后分別在2個(gè)青岡群體和2個(gè)滇青岡群體（共48個(gè)個(gè)體）當(dāng)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，擴(kuò)增率達(dá)到了90.7%，說明該28對引物均能作為2種青岡的通用引物。從遺傳多樣性方面來看，在本研究所開發(fā)出的28對SSR引物中，共有176個(gè)等位基因；引物的等位基因數(shù)為3～13，平均為6.29個(gè)；引物的期望雜合度為0.223～0.886，觀察雜合度為 0.159～0.830。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，利用簡化基因組測序數(shù)據(jù)，不僅可以高效、省時(shí)省力地開發(fā)引物，還可以開發(fā)近緣物種的通用引物，能為后續(xù)青岡和滇青岡的種群研究打下基礎(chǔ)，同時(shí)也可為跨物種間的標(biāo)記開發(fā)提供借鑒。

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（責(zé)任編輯 吳祝華）