[摘要]生物源性鈣磷灰石（BHA）因良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性，廣泛應(yīng)用于臨床骨缺損的治療中。基于臨床應(yīng)用中的骨缺損區(qū)適配原則，BHA具有尺寸多元性設(shè)計(jì)，然而不同尺寸對應(yīng)著不同的骨仿生層級，隨著尺寸變化，其具備的骨仿生層級隨之演變，并通過骨凝血免疫調(diào)控影響骨修復(fù)再生進(jìn)程，導(dǎo)致植骨結(jié)局不穩(wěn)定。本文對BHA的尺寸效應(yīng)進(jìn)行回顧，通過分析天然骨多級結(jié)構(gòu)，提出BHA尺寸引發(fā)骨仿生層級演變，仿生層級介導(dǎo)凝血免疫效應(yīng)，并基于骨仿生層級及其骨凝血免疫效應(yīng)，提出對不同尺寸BHA材料生物學(xué)效應(yīng)的新認(rèn)識及其生物學(xué)原理，為不同尺寸BHA材料的基礎(chǔ)研發(fā)和臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]生物源性鈣磷灰石；仿生層級演變；骨凝血免疫；材料尺寸效應(yīng)

[中圖分類號]R318.08[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[doi]10.7518/hxkq.2024.2024315

生物源性鈣磷灰石（biological hydroxyapatite，BHA）是由生物骨去除有機(jī)物制備的骨替代材料，其具有良好的生物相容性和骨誘導(dǎo)特性，并能夠與二氧化鈦（titanium dioxide，TiO2）相互作用產(chǎn)生一定抗菌性能，因此在臨床牙槽骨缺損的修復(fù)和再生中應(yīng)用較為廣泛。但在臨床應(yīng)用中可觀察到BHA引發(fā)異物反應(yīng)，組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)材料周圍形成纖維包膜Ⅲ，其中浸潤大量異物巨細(xì)胞，干擾骨再生，從而植骨效果不如預(yù)期，甚至植骨失敗。植骨結(jié)局與異物反應(yīng)程度息息相關(guān)，而異物反應(yīng)程度受到材料仿生層級的影響。BHA仿生層級來自生物骨的結(jié)構(gòu)和無機(jī)成分。仿生層級與尺寸高度相關(guān)，然而尺寸與植骨結(jié)局相關(guān)背后的生物學(xué)原理常被忽視，導(dǎo)致植骨結(jié)局的不穩(wěn)定。

臨床應(yīng)用的BHA尺寸從0.25～2 mm不等，BHA尺寸多元性設(shè)計(jì)主要基于其臨床應(yīng)用場景，然而不同尺寸BHA對應(yīng)著不同的骨仿生層級。Rezni-kov等提出骨組織九級結(jié)構(gòu)的概念，認(rèn)為骨骼尺寸增加的同時(shí)，其仿生層級也增加。BHA來源為生物骨，保留了骨的無機(jī)支架結(jié)構(gòu)。BHA尺寸增加時(shí)，其保留的無機(jī)支架結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜完整，仿生層級相應(yīng)提高。認(rèn)識BHA尺寸效應(yīng)引發(fā)的仿生層級演變，有利于精準(zhǔn)調(diào)控異物反應(yīng)，提升骨再生效果。仿生層級不同的BHA誘發(fā)不同的免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，大尺寸BHA顆粒植入能夠促進(jìn)組織再生微環(huán)境；而小尺寸的BHA通過核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NL-RP3）炎癥小體、白細(xì)胞介索（interleukin，IL）-ip以及其他細(xì)胞因子的分泌或代謝重編程，激活單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)，干擾骨再生。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，不同尺寸BHA通過骨仿生層級演變影響凝血通路激活、凝血因子吸附、纖維蛋白原編織等血凝塊形成過程，管控不同厚度、孔隙率、纖維直徑的纖維蛋白網(wǎng)形成，通過纖維蛋白網(wǎng)一巨噬細(xì)胞互作調(diào)控免疫反應(yīng)。根據(jù)這些研究，筆者認(rèn)為BHA尺寸改變引發(fā)的骨仿生層級演變通過血凝塊調(diào)控免疫反應(yīng)影響成骨結(jié)局。本文回顧天然骨的多級結(jié)構(gòu)，解析繼承天然骨結(jié)構(gòu)BHA尺寸引發(fā)的骨仿生層級的演變，探討B(tài)HA骨仿生層級的骨凝血免疫效應(yīng)，并基于此提出對生物材料尺寸的新分類，以及尺寸效應(yīng)對應(yīng)的仿生層級演變及其引發(fā)骨凝血免疫效應(yīng)的新理論，為研發(fā)高效成骨的組織工程材料提供了新思路。

1不同尺寸BHA在口腔骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用現(xiàn)狀

BHA屬于異種骨替代材料，主要由生物骨脫脂脫蛋白獲得，繼承了生物骨的無機(jī)成分，主要為鈣磷灰石（hydroxyapatite），是一種廣泛用于修復(fù)各類骨缺損的仿生材料。BHA與骨組織形成牢固的化學(xué)結(jié)合，引導(dǎo)骨再生，是臨床最常用的骨替代材料之一。

臨床使用的商品BHA多為顆?；蚍勰睿Ｒ娛惺跙HA尺寸見表1。不同的顆粒尺寸適應(yīng)不同的臨床需求。以Bio-Oss為例，在售的BHA顆粒有2種，分別是尺寸為0.25～1 mm的較小顆粒和1-2 mm的較大顆粒。其中0.25～1 mm的顆粒通常應(yīng)用于拔牙后骨萎縮的預(yù)防及拔牙窩內(nèi)牙槽嵴的保存；1～2 mm的顆粒通常應(yīng)用于牙種植前為再生牙槽嵴而進(jìn)行的骨再生手術(shù)，上頜骨骨量不足而進(jìn)行的上頜竇底提升術(shù)，種植體周圍炎的骨缺損修復(fù)和牙周治療等。

BHA應(yīng)用于引導(dǎo)骨再生時(shí)成功率大約為90％，臨床并發(fā)癥與BHA尺寸息息相關(guān)。BHA材料內(nèi)及材料間的多孔結(jié)構(gòu)有助于吞噬、吸收、血管形成以及骨再生。然而，當(dāng)BHA尺寸較小時(shí)，材料內(nèi)孔隙結(jié)構(gòu)較少，材料間互相堆疊嵌合，加上較大的鈣磷比和結(jié)晶度，降低了巨噬細(xì)胞遷移進(jìn)入和吸收BHA的速度，導(dǎo)致材料植入后吸收較慢，長期保留在體內(nèi)，阻礙骨骼的重塑，延長組織修復(fù)時(shí)間，引發(fā)軟組織裂開、BHA暴露、術(shù)后感染、骨增量不足等并發(fā)癥。當(dāng)BHA尺寸較大時(shí)，材料內(nèi)及材料間孔徑增大，為營養(yǎng)輸入和廢物排出提供良好的通道，可促進(jìn)細(xì)胞遷移和血管新生，縮短組織修復(fù)時(shí)間。Tay等研究證實(shí)，小尺寸的材料會導(dǎo)致并發(fā)癥發(fā)生率增加，其發(fā)生原因與血運(yùn)重建率降低相關(guān)，移植物出現(xiàn)感染或壞死。

2BHA尺寸引發(fā)的骨仿生層級演變

近年來，Reznikov等基于Weiner和Wagner等的工作，利用三維結(jié)構(gòu)測定、掃描電子顯微鏡觀察和切片視圖方法將有序和無序骨組織納入分級考慮，提出骨骼的九級生物結(jié)構(gòu)（表2）。

第一級結(jié)構(gòu)為骨骼的基本成分（major components），即礦物、有機(jī)物和水。礦物相主要為BHA晶體，占60％-70％，基本結(jié)構(gòu)為板狀晶體，長30～50 nm，寬20～25 nm，厚1.5-4 nm，是已知最小的生物晶體之一。有機(jī)物占20％，其中90％為I型膠原蛋白，具有獨(dú)特的三螺旋結(jié)構(gòu)，在骨骼中進(jìn)一步組裝成二維的薄片，沿著纖維的方向，一張薄片的末端和另一張薄片的頂端的三螺旋分子之間有一個(gè)間隙，結(jié)合薄片的交錯排列，使得所有間隙都沿著同一方向形成窄凹槽，這一結(jié)構(gòu)構(gòu)成原纖維（fibril），通常直徑為80～120 nm，原纖維可進(jìn)一步組裝形成長度更長、排列更有序的纖維，為高級結(jié)構(gòu)的編制奠定基礎(chǔ)。

第二級結(jié)構(gòu)為礦化膠原纖維，BHA晶體結(jié)晶、充滿并填平原纖維之間的凹陷。晶體的c晶軸和膠原纖維的軸向相互平行，形成類似層狀馬賽克地磚的結(jié)構(gòu)，也是構(gòu)成骨骼的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。

第三級結(jié)構(gòu)為基于I型膠原蛋白自發(fā)組裝三螺旋結(jié)構(gòu)的纖維陣列，這些陣列直徑從小于一個(gè)微米到數(shù)個(gè)微米之間，擇優(yōu)晶向與膠原軸向平行。有序纖維陣列僅存在于有序骨組織中；在無序骨組織中，大部分纖維為單個(gè)礦化纖維，形成無序纖維陣列，晶體結(jié)構(gòu)極少具有擇優(yōu)晶向。

第四級結(jié)構(gòu)是指纖維陣列以不同方式形成不同的組合圖案，稱為陣列模式。陣列模式分為2種。1）平行模式（unidirectional pattem）：最簡單且最具備向異性的模式，將原有的纖維陣列擴(kuò)展，形成更大緯度上單一方向的陣列模式，常見于板層骨和平行纖維骨。2）扇形模式（fanning pattern）：膠原纖維陣列的方向以漸變方式變化，常見于板層骨。無序骨組織不具備陣列模式，膠原纖維以單個(gè)礦化纖維形式存在，無特定晶向，稱為無序模式（disordered pattern），纖維之間由基質(zhì)充填，常見于平行陣列模式之間或相對較厚的骨層。

第五級結(jié)構(gòu)是骨的超結(jié)構(gòu)（super structure），分為2種。1）單向膠原纖維柬（bundles）：見于有序骨組織中，纖維束直徑通常為1-3 um，纖維束內(nèi)相鄰的原纖維在67 nm重復(fù)結(jié)構(gòu)中排列基本一致，因此形成具有各向異性而又具有一定共同方向的纖維束。不同方向的纖維束以每隔一組平行束片方向相似的方式堆疊在一起，相鄰纖維束角度偏移為40°-80°。纖維束內(nèi)僅含有少量骨基質(zhì)。人類骨骼纖維柬由薄層無序骨基質(zhì)包裹，這些薄層骨基質(zhì)常見骨細(xì)胞突起。2）骨陷窩-骨小管網(wǎng)絡(luò)（lacuno-canalicular network）：見于無序骨組織中，超結(jié)構(gòu)由礦化膠原纖維與嵌入的骨陷窩，骨小管組成，骨陷窩一骨小管網(wǎng)絡(luò)內(nèi)含骨細(xì)胞及其突起，是骨細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)與膠原基質(zhì)的緊密結(jié)構(gòu)。

第六級結(jié)構(gòu)是指構(gòu)成骨骼的組織，即骨組織（material pattem）。骨組織是細(xì)胞活動的產(chǎn)物，部分還包括細(xì)胞成分。構(gòu)成骨骼的組織有3種模式。1）編織骨（woven bone）：由礦化膠原纖維束組成，纖維束無明顯的優(yōu)先方向，是一種過渡性組織類型，常在發(fā)育期間或骨折修復(fù)過程中沉積。2）平行纖維骨（parallel fibered bone）：也稱為叢狀骨，礦化纖維束方向互相平行，被薄層無序骨基質(zhì)隔開。體內(nèi)平行纖維骨被板層骨包繞。3）板層骨（lamellar bone）：最常見的骨組織，由一系列板層組成，每層厚度3～7 um不等，包含不同方向的礦化纖維束和扇形模式陣列，不同束之間由無序骨基質(zhì)填充，骨小管穿行其中并垂直于無序骨基質(zhì)邊緣穿出。

第七級結(jié)構(gòu)為板層骨的組織結(jié)構(gòu)基序（tissue elements），在骨重塑過程中，板層骨逐漸取代編織骨和纖維板層骨。根據(jù)骨形成的時(shí)間和位置，分為4種類型。1）環(huán)形板層基序（circumferential lamellar motif）：由一系列具有大曲率半徑的板層組成，板層與密質(zhì)骨和松質(zhì)骨的形成表面平行，主要來自骨表面的成骨細(xì)胞沉積，此類初級骨結(jié)構(gòu)會被骨單位替代。2）板層束（lamellar packets）：一種由略微不同方向的板層系列組成的集合，這種結(jié)構(gòu)特征性地出現(xiàn)在松質(zhì)骨中。相鄰的板層系列以小角度彼此截?cái)唷＿@種模式的形成是由于部分板層骨的去除，隨后通過沉積新的板層骨填補(bǔ)由此所產(chǎn)生的吸收缺陷。3）骨單位（osteons）：分為初級骨單位和次級骨單位。初級骨單位具有相同的同心板層結(jié)構(gòu)，但沒有次級骨單位的外層——沉積線，在血管周圍原位形成，在預(yù)先存在的腔隙向心填充板層骨，常見于纖維板層骨，以及大型動物皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨的界面。次級骨單位是骨重塑的產(chǎn)物，又稱為哈弗系統(tǒng)，為直徑100-200 um的圓柱狀結(jié)構(gòu)，中央管直徑30～40 um，次級骨單位被沉積線包繞，沉積線形成于吸收停止和新板層開始沉積的地方。4）纖維層狀骨（fibro-lamellar bone）：由順序形成的重復(fù)骨單元組成。在血管系統(tǒng)形成后，首先沉積的材料是初級高鈣化層，包含無優(yōu)先取向的礦化膠原纖維束、大量的基質(zhì)物質(zhì)和許多小孔，其次是在初級高鈣化層的兩側(cè)沉積厚層平行纖維骨，最后剩余空腔被板層骨填充。

第八級結(jié)構(gòu)為密質(zhì)骨或松質(zhì)骨。在結(jié)構(gòu)上，密質(zhì)骨和松質(zhì)骨都是由板層骨組成的，兩者區(qū)別之一是密質(zhì)骨中重復(fù)的單向纖維束組顯示出各種交替的方向，而松質(zhì)骨中兩個(gè)單向纖維束組之一大致地與單個(gè)松質(zhì)骨小梁的長軸對齊，松質(zhì)骨形成的多孔結(jié)構(gòu)孔隙直徑分布于0.1～3.5 mm；區(qū)別之二是密質(zhì)骨比松質(zhì)骨含有更多的礦物質(zhì)。

第九級結(jié)構(gòu)是指完整骨骼組織，包括密質(zhì)骨和松質(zhì)骨。

基于上述骨組織的多級結(jié)構(gòu)，尺寸影響骨仿生層級的完整程度，從而引發(fā)仿生層級演變。類推至BHA材料，BHA成分參與維持骨骼的微觀陣列和宏觀孔隙，隨著尺寸增加，BHA仿生層級增加，因此筆者提出尺寸改變引發(fā)BHA仿生層級演變。基于骨骼九級結(jié)構(gòu)特征及市售常見尺寸分類，將BHA尺寸分為3種類型（表3）。1）直徑小于0.2 mm：無法保留完整骨單位，僅保留生物骨的第一至第六級結(jié)構(gòu)，因其制備過程產(chǎn)生更多斷面，增加了材料比表面積，因此具有占比最多的納米至微米級微孔；2）直徑介于0.2～1 mm：保留完整骨單位，保留尺寸小于等于1 mm松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)，即保留生物骨的第一至第七級結(jié)構(gòu)和部分第八級結(jié)構(gòu)，其比表面積和微孔占比居中；3）直徑大于1 mm：保留尺寸大于1 mm的松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)，即保留生物骨的第一至第七級結(jié)構(gòu)和大部分第八級結(jié)構(gòu)，其比表面積和微孔占比最低。

值得注意的是，BHA的仿生層級影響免疫反應(yīng)，從而影響成骨結(jié)局。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，不同仿生層級BHA通過與凝血系統(tǒng)相互作用，進(jìn)而調(diào)控免疫反應(yīng)，影響成骨結(jié)局，因此提出“骨凝血免疫”調(diào)控效應(yīng)（osteo-coagulo-immunomo-dulation effect），下文將淺析BHA仿生層級介導(dǎo)的骨凝血免疫效應(yīng)。

3 BHA仿生層級介導(dǎo)的骨凝血免疫效應(yīng)

材料植入體內(nèi)后與血液接觸，材料的形態(tài)、化學(xué)組成、物理性質(zhì)和其他屬性通過影響凝血成分的組織，如纖維蛋白網(wǎng)、血小板、紅細(xì)胞和補(bǔ)體，形成不同的材料，血凝塊復(fù)合體。BHA保留了骨結(jié)構(gòu)和微孔結(jié)構(gòu)，能夠吸收纖維蛋白原和凝血因子。本團(tuán)隊(duì)前期研究證實(shí)，材料尺寸的大小和形狀可以影響材料吸附的纖維蛋白原的構(gòu)象，為纖維蛋白原和纖維蛋白吸附提供位置，從而影響凝血過程；纖維蛋白網(wǎng)能夠?qū)ι锏V化膠原基質(zhì)（biomineralized collagen matrix，BCM）產(chǎn)生的關(guān)鍵免疫調(diào)節(jié)因子羧甲基殼聚糖/無定形磷酸鈣納米復(fù)合物產(chǎn)生吸附作用并為之提供物理屏障，在BCM材料植入后快速形成BCM-血凝塊復(fù)合體。然而，具有微孔結(jié)構(gòu)的BHA材料容易釋放Ca2+并吸收凝血因子，導(dǎo)致凝血時(shí)間延長和纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)稀疏。較小的孔徑可以顯著加速水的吸收，促進(jìn)血小板黏附和活化、血漿蛋白黏附，從而在凝血級聯(lián)接觸激活途徑中起重要作用。另外，當(dāng)孔徑較小時(shí)，由于對纖維蛋白原的吸附能力較差，纖維蛋白無法吸附新的蛋白引導(dǎo)纖維蛋白網(wǎng)延長。Ferrza等在尺寸為20 nm的材料上發(fā)現(xiàn)血小板激活跡象，表現(xiàn)為擴(kuò)散形態(tài)和突出的絲狀偽足，以及血小板活化依賴性顆粒表面膜蛋白的表達(dá)。BHA可以改變血液成分以及血液與材料表面之間的相互作用，從而影響紅細(xì)胞形態(tài)、蛋白質(zhì)吸附和凝血酶生成等關(guān)鍵步驟。Han等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)BHA尺寸達(dá)到納米級別時(shí)，能夠黏附在紅細(xì)胞膜上，導(dǎo)致細(xì)胞膜表面形成凹陷，顯著提高材料對紅細(xì)胞吸附能力。較大的孔徑會導(dǎo)致紅細(xì)胞局部膜強(qiáng)烈變形，出現(xiàn)孔形成、顆粒內(nèi)化，最終導(dǎo)致溶血?？紫对黾恿酥Ъ鼙砻娓喙δ芑鶊F(tuán)的暴露，從而增強(qiáng)一級結(jié)構(gòu)固有的凝血信號。Rouahi等測試了微孔鈣磷灰石和非微孔鈣磷灰石對補(bǔ)體蛋白的吸附，結(jié)果表明，吸附在微孔鈣磷灰石上的蛋白質(zhì)比非微孔鈣磷灰石上的蛋白質(zhì)多10倍，微孔級BHA表面可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的吸附，并促進(jìn)人體骨細(xì)胞的黏附和增殖。在納米結(jié)構(gòu)表面的補(bǔ)體激活研究中，F(xiàn)erraz等發(fā)現(xiàn)，材料的尺寸可影響補(bǔ)體的級聯(lián)識別。在孔徑為20砌的表面上血液的活化明顯低于孔徑為200 nm的表面上的活化。其原因是當(dāng)全血與更大孔徑的材料接觸后，補(bǔ)體可溶性成分的值更高，蛋白質(zhì)更容易吸附。

材料接觸血液后激活血小板、纖維蛋白網(wǎng)等形成的材料，血凝塊復(fù)合物，能夠與免疫系統(tǒng)相作用，通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞黏附、趨化因子分泌來影響局部免疫微環(huán)境。控制BHA材料的尺寸可以影響凝血要素，如纖維蛋白、血小板、紅細(xì)胞、補(bǔ)體的形成狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)隨后的免疫反應(yīng)。凝血因子是可溶性纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為不溶性纖維蛋白的關(guān)鍵催化劑，可通過調(diào)節(jié)血凝塊纖維蛋白膜調(diào)控生物材料介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。對于血凝塊支架成分纖維蛋白網(wǎng)，本課題組研究發(fā)現(xiàn)，小尺寸BHA（直徑lt;0.2 mm）能夠吸附較多的凝血因子，形成更薄的纖維蛋白膜，從而在黏附-細(xì)胞骨架。自噬的潛在信號通路影響下提升巨噬細(xì)胞促炎癥和纖維化，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，小尺寸BHA形成的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)會導(dǎo)致更強(qiáng)的局部炎癥反應(yīng)和纖維包裹形成。Garg等舊研究發(fā)現(xiàn)，大尺寸材料能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型分化，繼而M2型巨噬細(xì)胞釋放成骨細(xì)胞因子，促進(jìn)新骨形成。BCM材料植入體內(nèi)后能夠通過屏障以及血液浸潤形成BCM-血凝塊復(fù)合體，從而減輕異物反應(yīng)和炎癥浸潤，優(yōu)化其生物相容性和血管化。當(dāng)材料孔隙大于9 nm時(shí)，游離纖維蛋白原能夠聚集形成鏈狀纖維，通過細(xì)胞黏附-細(xì)胞骨架組裝，炎癥反應(yīng)的潛在信號通路抑制巨噬細(xì)胞M1的極化，減少巨噬細(xì)胞引發(fā)的炎癥。Ooi等研究發(fā)現(xiàn)，BHA植入引發(fā)的炎癥反應(yīng)，始于血漿蛋白在生物材料表面上的吸附，引發(fā)血液凝固及血小板和免疫細(xì)胞到達(dá)該部位。納米級多孔鈣磷灰石的溶血率低于5％，在黏附于鈣磷灰石的血小板上未觀察劉活化和形態(tài)變化，具有高度血液相容性。Wang等研究表明，BHA納米顆粒容易與蛋白質(zhì)結(jié)合形成蛋白質(zhì)，顆粒復(fù)合物，與紅細(xì)胞相互作用，并被巨噬細(xì)胞或成纖維細(xì)胞吞噬沉積在局部組織中，導(dǎo)致纖維狀局部假包膜的形成。

基于以上研究結(jié)果，筆者認(rèn)為BHA尺寸引發(fā)的仿生層級演變，通過與血凝塊纖維蛋白網(wǎng)、血小板、紅細(xì)胞、補(bǔ)體系統(tǒng)等成分互作，形成不同材料一血凝塊復(fù)合體，介導(dǎo)免疫細(xì)胞激活、分化及細(xì)胞因子釋放等免疫功能，調(diào)控功能細(xì)胞修復(fù)進(jìn)程，進(jìn)而影響骨修復(fù)效果。

4基于骨凝血免疫效應(yīng)的BHA仿生層級演變總結(jié)

參考天然骨的九級結(jié)構(gòu)，結(jié)合BHA骨仿生層級及其骨凝血免疫效應(yīng)，筆者進(jìn)一步解析BHA不同仿生層級介導(dǎo)的骨凝血免疫效應(yīng)，詮釋生物尺寸的內(nèi)涵（圖1）。

一級結(jié)構(gòu)是鈣磷灰石晶體（圖2）。其晶體結(jié)構(gòu)、堆積面和離子活性都會影響凝血系統(tǒng)的活性。纖維狀和板狀鈣磷灰石單晶的（100）面選擇性地吸附酸性蛋白質(zhì)，而（001）面選擇性地吸附堿性蛋白質(zhì)。研究表明，僅有一級結(jié)構(gòu)的鈣磷灰石不引起紅細(xì)胞溶解，也不引起血小板活化，不同長徑比的鈣磷灰石納米顆粒對紅細(xì)胞溶解、血小板活化的影響均無差異，對內(nèi)外源性凝血系統(tǒng)的影響也無差異。此外，當(dāng)BHA在組織中聚集時(shí)，晶體表面會形成水合層，水合層中含有可置換的離子和蛋白質(zhì)，進(jìn)而調(diào)控血漿凝血相關(guān)離子和蛋白質(zhì)的濃度，影響材料-血凝塊復(fù)合體。

二級結(jié)構(gòu)是指去除膠原纖維后剩余的孔隙，這些孔隙通常較小，可稱為微孔，具有物質(zhì)傳輸擴(kuò)散效率高、表面積大、活性位點(diǎn)分散等特點(diǎn)，可提高支架的通透性，提供更多的蛋白質(zhì)吸附位點(diǎn)，從而增強(qiáng)表面凝血因子、纖維蛋白原、血小板和其他凝血啟動信號。與此同時(shí)，微孔誘導(dǎo)的毛細(xì)管力也可以將細(xì)胞錨定在材料表面，使細(xì)胞變形并將其吸入互連微孔中，即使微孔小于細(xì)胞。細(xì)胞還通過膜受體在其表面吸附更多的成骨相關(guān)蛋白，從而與微孔支架相互作用，以改善成骨相關(guān)功能（如附著、增殖、分化、生物礦化等）。孔隙可增加支架表面更多官能團(tuán)的暴露，進(jìn)一步增強(qiáng)初級結(jié)構(gòu)固有的凝血信號。

三級結(jié)構(gòu)是指二級結(jié)構(gòu)按一定順序排列形成的單層骨小梁結(jié)構(gòu)。三級結(jié)構(gòu)繼承了二級結(jié)構(gòu)的凝血活性，結(jié)合大孔結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步增加血小板分散活性和凝血因子吸附面積，促進(jìn)凝血效果。此外，當(dāng)作為填充材料時(shí)，彼此之間接觸緊密使其可以很好地適配不同形態(tài)的骨缺損。然而，由于材料之間非穩(wěn)定連接，在受到外力擠壓或牽拉時(shí)會發(fā)生位移，無法保證穩(wěn)定的成骨空間支持作用。

四級結(jié)構(gòu)是指由三級結(jié)構(gòu)形成的單層大孔結(jié)構(gòu)。在生物材料中，直徑大于100 um的孔隙被稱為大孔，其是BHA在骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)中發(fā)揮作用的關(guān)鍵。這種大孔材料模擬了骨小梁結(jié)構(gòu)，進(jìn)而引導(dǎo)了類似骨松質(zhì)的形成過程。同時(shí)，大孔也確保了細(xì)胞滲透、血管向內(nèi)生長和營養(yǎng)擴(kuò)散，進(jìn)而促進(jìn)骨再生以及組織向內(nèi)生長，并將營養(yǎng)物質(zhì)輸送到再生組織的中心。大孔徑能夠創(chuàng)造有利的局部條件，促進(jìn)碳酸鹽磷灰石成核和生長。另外，相互貫通的孔徑越大，其骨傳導(dǎo)性能越強(qiáng)。大孔還能確保血凝塊與材料之間的嵌合，通過表面大孔為血凝塊提供基本支架，形成機(jī)械嵌合，進(jìn)一步穩(wěn)定血凝塊。

五級結(jié)構(gòu)為類似于天然骨組織的多層級多孔結(jié)構(gòu)，不僅可以作為骨缺損的支撐，還可以作為運(yùn)輸通道。多孔結(jié)構(gòu)為間質(zhì)流體的流動提供了足夠的空間，有利于血漿蛋白的循環(huán)，并為骨細(xì)胞的黏附、增殖、分化提供了機(jī)械支持和適宜的環(huán)境，表現(xiàn)出良好的骨誘導(dǎo)性。血液滲入五級結(jié)構(gòu)后凝固，結(jié)合血凝塊收縮產(chǎn)生機(jī)械鎖力，使內(nèi)部血腫難以脫離材料，從而提高血凝塊的穩(wěn)定性，為細(xì)胞附著提供了更大的比表面積，促進(jìn)了成骨細(xì)胞的黏附以及血液和營養(yǎng)物質(zhì)的交換。同時(shí)，不同孔隙的多層結(jié)構(gòu)還能進(jìn)一步調(diào)節(jié)局部血凝塊結(jié)構(gòu)。例如，直徑較大的孔隙可以富集纖維蛋白原形成外源性細(xì)胞核，并通過減少橫向聚集程度產(chǎn)生更細(xì)的纖維，促進(jìn)細(xì)胞骨架組裝、抑制炎癥反應(yīng)和快速激活凝血途徑州。

在生理凝血過程中，組織因子、膠原蛋白和細(xì)胞碎片等內(nèi)在有機(jī)物質(zhì)會激活內(nèi)源性和外源性凝血途徑，單純BHA成分無法替代有機(jī)物的骨凝血免疫效應(yīng)，因此引入六級結(jié)構(gòu)的概念，即在BHA支架內(nèi)部或表面引入具有凝結(jié)活性的生物基質(zhì)成分，以實(shí)現(xiàn)BHA在仿生層級的躍遷。生物骨中最常見的基質(zhì)成分包括膠原蛋白、透明質(zhì)酸、彈性蛋白等，因此常見的生物源性基質(zhì)化合物，如殼聚糖、膠原蛋白、明膠、合成生物大分子、脫細(xì)胞基質(zhì)材料、絲蛋白等，是實(shí)現(xiàn)BHA六級結(jié)構(gòu)構(gòu)建的優(yōu)良備選材料。將生物基質(zhì)添加于材料表面，能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞黏附，促進(jìn)細(xì)胞增殖，維持細(xì)胞的分化功能，改良BHA機(jī)械和物理化學(xué)性能，使其在臨床應(yīng)用中能夠維持并模擬天然骨組織的獨(dú)特環(huán)境和結(jié)構(gòu)。

僅有BHA和有機(jī)基質(zhì)的六級結(jié)構(gòu)與天然骨仍有差距，單純BHA支架由于缺少生物活性因子而不具有骨誘導(dǎo)性。材料的骨誘導(dǎo)特性源自細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)，如膠原蛋白、骨黏連蛋白、骨橋蛋白、骨唾液酸蛋白和骨形態(tài)發(fā)生蛋白。天然骨富含紅細(xì)胞、血小板、補(bǔ)體、間充質(zhì)干細(xì)胞、免疫細(xì)胞、囊泡、細(xì)胞因子、凝血因子等生物活性組分，為其骨凝血免疫效應(yīng)提供直接參與組分，因此基于六級結(jié)構(gòu)，七級結(jié)構(gòu)還應(yīng)具有生物活性組分，主動參與凝血免疫功能。

基于此BHA生物尺寸與仿生層級新認(rèn)識，單純BHA尺寸演變僅能恢復(fù)一至五級結(jié)構(gòu)，通過自身晶體特征、微觀陣列和宏觀結(jié)構(gòu)調(diào)控骨凝血免疫效應(yīng)，通過有機(jī)物和生物活性因子引入，才能進(jìn)一步提升BHA仿生層級，豐富其生物尺寸，實(shí)現(xiàn)主動的骨凝血免疫調(diào)控效應(yīng)。本文將BHA尺寸與仿生層級及凝血免疫之間的關(guān)系進(jìn)行了總結(jié)（表4）。

5結(jié)論

作為臨床應(yīng)用最成熟的骨替代材料之一，BHA具有尺寸多元性以應(yīng)對臨床應(yīng)用場景。本文通過剖析天然骨尺寸介導(dǎo)的仿生層級演變，類推至多元尺寸BHA攜帶不同仿生層級信息，結(jié)合材料與血凝塊互作影響免疫反應(yīng)的基本原理，提出了基于骨凝血免疫效應(yīng)的BHA生物尺寸新認(rèn)識，并闡述了其尺寸引發(fā)的仿生層級演變及其介導(dǎo)的骨凝血免疫效應(yīng)，為BHA材料研發(fā)促進(jìn)骨再生提供了新思路，為骨組織工程材料構(gòu)建提供了指引。未來仍需進(jìn)一步深入研究BHA的尺寸效應(yīng)，平衡臨床應(yīng)用與成骨機(jī)理，探索實(shí)現(xiàn)最佳成骨效果的“黃金尺寸”。

致謝：感謝中山大學(xué)附屬口腔醫(yī)院韓宗蒲、郭心瑜、揚(yáng)睿涵、梁齡予、蘇鈺承擔(dān)資料收集工作，鄒陽、武詩語、單正杰、蘇夢溪承擔(dān)文獻(xiàn)整理工作！

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。