摘 要： 旨在研究育成期代謝能（ME）攝入量對(duì)蛋雞生殖器官發(fā)育、激素水平和卵巢基因表達(dá)的影響。將720只6周齡海蘭褐蛋雞隨機(jī)分為3組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)40只雞。6～17周齡，各試驗(yàn)組飼糧粗蛋白質(zhì)水平分別為17.5%（6～12周齡）和15.5%（12～17周齡），ME水平分別為12.34、11.11（12.34×90%）和9.87（12.34×80%）MJ·kg-1（分別為對(duì)照組亦即自由采食組、90% ME限飼組和80% ME限飼組），其他營(yíng)養(yǎng)素水平相同。對(duì)照組試驗(yàn)雞自由采食，其他試驗(yàn)組蛋雞按照對(duì)照組蛋雞采食量定量飼喂。試驗(yàn)期為6～17周齡。結(jié)果表明：1）隨著育成期能量限飼強(qiáng)度增加，各試驗(yàn)組蛋雞17周齡體重、體斜長(zhǎng)和跖圍均顯著線性減少（Plt;0.001）。2）隨著育成期能量限飼強(qiáng)度增加，血清尿素氮（UN）和葡萄糖（GLU）水平均顯著線性減?。≒=0.040，P=0.044），但血漿雌二醇水平顯著線性增加（P=0.026）。3）對(duì)17周齡血液雌二醇水平差異最顯著的自由采食組（ALF17W）和80%能量限飼組（ERF17W）蛋雞卵巢基質(zhì)部進(jìn)行RNA-Seq分析，純凈序列匹配到雞參考基因組的比例均超過(guò)了94.61%，Q20和Q30的純凈序列含量分別高于97.38%和92.87%，兩組共篩選出1 299個(gè)差異基因，ERF17W中961個(gè)下調(diào)，338個(gè)上調(diào)。GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)的mRNAs參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、發(fā)育和生殖等48個(gè)顯著富集的GO條目，KEGG信號(hào)通路顯著富集在25個(gè)顯著富集的KEGG通路，其中cAMP信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、類(lèi)固醇激素生物合成和卵巢類(lèi)固醇生成等是與能量代謝或生殖相關(guān)的通路。篩選到的cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）和類(lèi)固醇生成急性調(diào)節(jié)蛋白（StAR）富集在cAMP信號(hào)通路，孕激素受體（PGR）、代謝型谷氨酸受體1（GRM 1）和細(xì)胞骨架蛋白角蛋白18（KRT 18）富集在雌激素信號(hào)通路。qRT-PCR結(jié)果顯示10個(gè)隨機(jī)選擇的差異表達(dá)基因的表達(dá)趨勢(shì)與 RNA-Seq結(jié)果一致。綜上可見(jiàn)，隨育成期ME攝入量減少，育成期末蛋雞體重、血清UN和GLU含量均顯著線性減小，但血漿雌二醇水平顯著線性增加，育成期ME攝入量可能通過(guò)調(diào)控卵巢組織StAR、CREB1、KRT18、PGR和GRM1等基因的表達(dá)，作用于cAMP信號(hào)通路和雌激素信號(hào)通路，以調(diào)控蛋雞能量代謝和雌激素生成。

關(guān)鍵詞： RNA-seq；育成期；代謝能攝入量；雌激素；卵巢；蛋雞

中圖分類(lèi)號(hào)：S831.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）11-5085-16

收稿日期：2024-01-02

基金項(xiàng)目：江蘇省種業(yè)振興揭榜掛帥項(xiàng)目（JBGS［2021］104）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-40-K01）；江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目（JATS［2023］069）

作者簡(jiǎn)介：盧 建（1985-），男，山東濟(jì)寧人，副研究員，博士，主要從事蛋雞營(yíng)養(yǎng)代謝與繁殖性能調(diào)控研究，E-mail：lujian1617@163.com

*通信作者：曲 亮，主要從事蛋雞遺傳育種研究，E-mail： liangquyz@126.com

Effects of Metabolizable Energy Intake during Rearing on Development of Reproductive

Organs， Hormone Level and Gene Expression in Ovary of Laying Hens

LU" Jian， JU" Xiaojun， WANG" Xingguo， MA" Meng， WANG" Qiang， LI" Yongfeng， DOU" Taocun，

HU" Yuping， GUO" Jun， SHAO" Dan， TONG" Haibing， QU" Liang*

（Jiangsu Institute of Poultry Sciences， Yangzhou 225125，" China）

Abstract：" This experiment was conducted to evaluate the effects of metabolizable energy （ME） intake during rearing on the growth and development of reproductive organ， hormone level and gene expression in ovary of laying hens. A total of 720 6-week-old Hyline-Brown laying hens were allocated equally to three groups with six replicates of 40 hens each， and were fed one of three diets that were nutritionally equal with the exception of ME levels. From 6 to 17 weeks of age， the crude protein （CP） levels in diet were 17.5% （6-12 weeks） and 15.5% （12-17 weeks）， respectively， and the ME levels in diet were 12.34， 11.11 （12.34×90%） and 9.87（12.34×80%） MJ·kg-1 （control group， also called ad libitum feeding group， 90% energy-restricted feeding group， and 80% energy-restricted feeding group）， respectively. The hens in control group were fed ad libitum， and the daily amount of feed in experimental groups was restricted to the absolute quantity of the diet consumed by hens in control group. The results showed as follows： 1） Body weight， body slope length and shank circumference of hens at 17 weeks of age decreased linearly （Plt;0.001） with increasing levels of energy restriction. 2） The serum UN and GLU content decreased linearly （P=0.040 and 0.044， respectively）， while the plasma oestradiol concentrations increased linearly （P=0.026）. 3）The ovary stroma of hens in the ad libitum feeding group （ALF17W） and 80% energy-restricted feeding group （ERF17W） with significant differences （Plt;0.05） in plasma oestradiol concentrations were used to screen the novel mRNA implemented by the RNA-seq. The proportion of pure reads matching to chicken reference genome was more than 94.61%， and the content of Q20 and Q30 was more than 97.38% and 92.87%， respectively. A total of 1 299 differential genes were screened in ALF17W and ERF17W， of which 961 were down-regulated and 338 were up-regulated in ERF17W. The GO functional enrichment analysis found that differentially expressed mRNAs were involved in 48 GO terms such as cell proliferation， development， and reproduction. The KEGG pathway were significantly enriched in 25 pathways， among these pathways， the cAMP signaling pathway， estrogen signaling pathway， steroid hormone biosynthesis and ovarian steroidogenesis pathway were related to energy metabolism or reproduction. The screened cAMP response element-binding protein （CREB） and steroid-producing acute regulatory protein （StAR） are enriched in the cAMP signaling pathway， and progesterone receptor （PGR）， metabotropic glutamate receptor 1 （GRM1） and cytoskeletal keratin （KRT18） are enriched in the estrogen signaling pathway， they may be the potential target genes of ME intake regulating estrogen production in laying hens. The qRT-PCR results showed that the expression trends of 10 randomly selected differentially expressed genes were consistent with the RNA-Seq results. The above results showed that the body weight， serum UN and GLU decreased linearly with the decrease of ME intake during the rearing period， but plasma oestradiol level increased linearly. It is suggested that ME intake during the rearing period may regulate the expression of StAR， CREB1， KRT18， PGR and GRM1 genes in ovarian tissues， and act on the cAMP and estrogen signaling pathways to regulate the production of estrogen in laying hens.

Key words： RNA-seq; rearing period; ME intake; estrogen; ovary; laying hens

*Corresponding author： QU Liang，E-mail： liangquyz@126.com

育成期和開(kāi)產(chǎn)前階段是蛋雞體型、肌肉和生殖器官等發(fā)育的主要階段［1］，開(kāi)產(chǎn)時(shí)（性成熟）體重、群體均勻度和生殖器官發(fā)育狀況是影響蛋雞整個(gè)飼養(yǎng)期的產(chǎn)蛋性能的主要因素［2］。育成期代謝能（ME）攝入量直接影響家禽體重、體組成等體成熟指標(biāo)［3］，進(jìn)而影響生殖器官發(fā)育和性成熟［4］。因此，系統(tǒng)研究育成期ME攝入量對(duì)蛋雞生長(zhǎng)發(fā)育、生殖器官發(fā)育、雌激素水平和卵巢基因表達(dá)的影響具有重要意義。有關(guān)育成期能量限飼對(duì)蛋雞脂質(zhì)代謝、生殖器官發(fā)育、激素水平和卵巢差異基因等影響的研究報(bào)道相對(duì)較少。在肉種雞上，限飼技術(shù)被用于控制肉種雞體重、改善群體均勻度、減少異常排卵、提升產(chǎn)蛋性能［5-6］。在蛋雞上，限飼多集中在研究其對(duì)開(kāi)產(chǎn)日齡和產(chǎn)蛋性能的影響［7］。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，自由采食狀況下育成期飼糧ME水平顯著影響育成期末蛋雞體重、卵巢基質(zhì)和小黃卵泡等發(fā)育，但對(duì)開(kāi)產(chǎn)時(shí)蛋雞生殖器官發(fā)育狀況無(wú)顯著影響［8］。在地方特色蛋雞上的研究發(fā)現(xiàn)，育成期適度限制ME攝入量能夠延遲如皋黃雞18、20、22和24周齡的生殖器官發(fā)育和性成熟，但ME限飼改善了性成熟過(guò)程中群體均勻度，增加了產(chǎn)蛋期平均蛋重和蛋重超過(guò)40g的蛋數(shù)，對(duì)產(chǎn)蛋初期（21周齡）體重、18～52周齡的產(chǎn)蛋性能、52周齡的受精率和孵化率無(wú)不良影響［9］。在海蘭褐蛋雞上的研究也發(fā)現(xiàn)，育成期適度限制ME攝入量能夠延遲生殖器官發(fā)育和性成熟，但限飼減小了個(gè)體開(kāi)產(chǎn)日齡和個(gè)體產(chǎn)蛋數(shù)的變異系數(shù)，增加了20～72周齡蛋雞日只蛋重、產(chǎn)蛋數(shù)和蛋重超過(guò)60 g的蛋數(shù)［10］?？梢?jiàn)，這種通過(guò)減少育成期ME攝入量延遲生殖器官發(fā)育的方式可能增加了生殖器官的發(fā)育時(shí)間，使生殖器官發(fā)育更加充分，進(jìn)而改善個(gè)體產(chǎn)蛋的均勻度和產(chǎn)蛋性能。然而，通過(guò)減少育成期ME攝入量調(diào)控生殖器官發(fā)育時(shí)，是否引起了蛋雞雌激素生成的變化，以及卵巢基質(zhì)部的基因表達(dá)量是否有變化，這些調(diào)控機(jī)制仍不清楚。因此，本試驗(yàn)以海蘭褐蛋雞為研究對(duì)象，通過(guò)等量飼喂不同ME水平飼糧控制育成期（6～17周齡）蛋雞的ME攝入量，研究其對(duì)蛋雞體重、體尺、血液生化指標(biāo)和激素水平的影響，并基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究育成期ME攝入量調(diào)控蛋雞激素水平的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路，為科學(xué)應(yīng)用蛋雞育成期精準(zhǔn)飼喂技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)選用體況良好、體重接近的6周齡海蘭褐母雞720只，平均體重為376.8 g±43.3 g。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將720只母雞隨機(jī)分為3組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)40只，各試驗(yàn)組蛋雞體重?zé)o顯著差異。育成期試驗(yàn)飼糧粗蛋白質(zhì)（CP）水平分別為17.5%（6～12周齡）及15.5%（12～17周齡），ME水平分別為12.34、11.11（12.34×90%）和9.87（12.34×80%）MJ·kg-1（分別為對(duì)照組、90%能量限飼組和80%能量限飼組），其他營(yíng)養(yǎng)素水平相同。6～17周齡，對(duì)照組試驗(yàn)雞自由采食，其它試驗(yàn)組蛋雞按照對(duì)照組蛋雞采食量定量飼喂。

1.3 試驗(yàn)飼糧與飼養(yǎng)管理

參照《海蘭褐飼養(yǎng)管理手冊(cè)》（HY-LINE INTERNATIONAL，2022版）配制試驗(yàn)飼糧，飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。試驗(yàn)雞在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所試驗(yàn)雞舍飼養(yǎng)，采用《海蘭褐飼養(yǎng)管理手冊(cè)》推薦的光照程序。試驗(yàn)雞三層個(gè)體階梯籠飼養(yǎng)，自由飲水。各重復(fù)間在料槽上插入擋板，防止試驗(yàn)雞采食其它重復(fù)蛋雞試驗(yàn)飼糧。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 體重測(cè)定

每天記錄雞只健康狀況。試驗(yàn)期第6和17周齡末，禁食12 h后對(duì)每只試驗(yàn)雞稱重。以重復(fù)為單位統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)雞體重，并計(jì)算各重復(fù)體重變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）作為群體均勻度評(píng)價(jià)指標(biāo)。

CV=（標(biāo)準(zhǔn)差/平均體重）×100%

1.4.2 體尺測(cè)定

17周齡末，測(cè)定所有試驗(yàn)雞個(gè)體體斜長(zhǎng)、跖長(zhǎng)和跖圍，體斜長(zhǎng)、跖長(zhǎng)和跖圍分別由專人測(cè)定，測(cè)定方法參考《家禽生產(chǎn)性能名詞術(shù)語(yǔ)和度量計(jì)算方法》（中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 823—2020）。體斜長(zhǎng)為肩關(guān)節(jié)至同側(cè)坐骨結(jié)節(jié)間的距離，用皮尺沿體表測(cè)定；跖長(zhǎng)為跖骨上關(guān)節(jié)至第三四趾間的直線距離，用電子數(shù)顯卡尺測(cè)定；跖圍為跖中部的周長(zhǎng)，先用棉線繞跖骨中部1周，然后用直尺測(cè)定棉線長(zhǎng)度。

1.4.3 血液生化指標(biāo)和激素水平測(cè)定

第17周齡末，隨機(jī)從每重復(fù)選取2只雞翅靜脈采血，血樣分別置于促凝管和EDTA抗凝管，離心后收集上清（血清、血漿）保存待測(cè)。

采用全自動(dòng)生化分析儀（Uni-Cel DxC 800 Sychron，Beckman Coulter，美國(guó)）測(cè)定血清葡萄糖（GLU）、尿素氮（UN）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、游離脂肪酸（UREA）含量、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）。采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（ELISA）檢測(cè)血漿中雌二醇和孕酮的含量，試劑盒購(gòu)于南京奧青生物技術(shù)有限公司。

1.4.4 肝生化指標(biāo)測(cè)定

試驗(yàn)雞采血后頸部放血致死。分離肝組織，滅菌生理鹽水沖洗，統(tǒng)一位置取樣，置于液氮中，后轉(zhuǎn)移至-70 ℃超低溫冰箱保存。測(cè)樣時(shí)，樣品融化后保持4 ℃，加入一定量的 PBS（pH為 7.4），將樣品充分勻漿，離心后收集上清。采用試劑盒測(cè)定肝組織TC、TG、UREA、HDL和LDL含量，試劑盒購(gòu)自南京奧青生物技術(shù)有限公司。

1.4.5 生殖器官發(fā)育測(cè)定

分離生殖器官，測(cè)量輸卵管長(zhǎng)度，并計(jì)算其與體重的比值；稱量輸卵管、卵巢基質(zhì)、排卵前卵泡（直徑gt;8 mm）、小黃卵泡（直徑4～8 mm）和大白卵泡（直徑2～4 mm）等臟器重量并計(jì)算各器官與體重的比值，并統(tǒng)計(jì)排卵前卵泡、小黃卵泡、大白卵泡數(shù)量。

1.4.6 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

分離卵巢基質(zhì)部后，各試驗(yàn)組分別取4個(gè)樣品，置于液氮中，后轉(zhuǎn)移至-70 ℃超低溫冰箱保存。根據(jù)血液雌激素水平測(cè)定結(jié)果，選取血液雌二醇水平差異最顯著的自由采食組（ALF17W）和80%ME限飼組（ERF17W）蛋雞的樣品，用于轉(zhuǎn)錄組分析和RNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)。

采用TRIzol法提取卵巢基質(zhì)部組織RNA，用Nanodrop-2000微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度，檢測(cè)合格后，合成雙鏈cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并再次使用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物，最終獲得文庫(kù)，Illumina HiSeqTM 4000平臺(tái)上機(jī)測(cè)序。

1.4.7 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

使用fastp對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，過(guò)濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)后得到純凈序列。使用bowtie 2程序?qū)⒏哔|(zhì)量的純凈序列與雞核糖體序列比對(duì)，評(píng)估核糖體RNA的去除效果。使用Tophat 2程序?qū)⑷コ颂求wRNA后的純凈序列與雞參考基因組（版本：Ensembl_release100）比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果進(jìn)一步評(píng)估測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量，將比對(duì)上的序列進(jìn)行后續(xù)分析。采用FPKM作為衡量基因表達(dá)水平的指標(biāo)。使用edgeR軟件對(duì)mRNA的表達(dá)量進(jìn)行差異分析，利用P值與差異倍數(shù)（fold change）來(lái)篩選差異表達(dá)基因，篩選條件為Plt;0.05且FCgt;2.0。

使用OmicShare軟件對(duì)靶基因進(jìn)行注釋和分類(lèi)。采用超幾何分布對(duì)差異表達(dá) mRNA的靶基因進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書(shū)（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號(hào)通路富集分析。顯著條件為Plt;0.05。

1.4.8 測(cè)序結(jié)果qRT-PCR驗(yàn)證

從差異表達(dá)基因中隨機(jī)選擇10個(gè)參與能量代謝或雌激素生成的基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。根據(jù)GenBank的基因序列，利用primer premier 5軟件設(shè)計(jì)引物，各引物序列見(jiàn)表2。以卵巢基質(zhì)部總RNA為模板，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取出的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。熒光定量PCR采用SYBR Green Ι法，參照ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix（Q411-02）試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以GAPDH基因作為內(nèi)參基因進(jìn)行數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理。每次反應(yīng)均設(shè)空白樣品為陰性對(duì)照，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。定量的結(jié)果采用2－ΔΔCt法進(jìn)行處理，分析自由采食組、能量限飼組卵巢基質(zhì)mRNAs相對(duì)表達(dá)量。將80%能量限飼組的表達(dá)分析設(shè)為參照組，ΔΔCt=ΔCt（自由采食組）-ΔCt（80%能量限飼組）。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

表型數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0軟件中的單因子方差分析（one-way ANOVA）檢測(cè)組間差異顯著性。以重復(fù)為試驗(yàn)數(shù)據(jù)單元。差異顯著時(shí)，用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。ME攝入量的劑量效應(yīng)用正交多項(xiàng)式中的線性和二次多項(xiàng)式進(jìn)行比較。Plt;0.05表示差異顯著。

采用edgeR軟件對(duì)mRNA的表達(dá)量進(jìn)行差異分析，利用P值與FC來(lái)篩選差異表達(dá)基因，Plt;0.05且FCgt;2.0表示差異顯著。采用超幾何分布對(duì)差異表達(dá) mRNA的靶基因進(jìn)行GO功能和KEGG信號(hào)通路富集分析，Plt;0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 育成期ME攝入量對(duì)6～17周齡蛋雞生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知，隨著育成期能量限飼強(qiáng)度增加，各試驗(yàn)組蛋雞17周齡體重、體斜長(zhǎng)和跖圍均顯著線性減少（Plt;0.001），17周齡跖長(zhǎng)呈先增加后減小的二次曲線趨勢(shì)（P=0.051）。

2.2 育成期ME攝入量對(duì)17周齡蛋雞血液和肝組織生化指標(biāo)的影響

由表4可知，隨著育成期能量限飼強(qiáng)度增加，血清GLU和UN含量均顯著線性減?。≒=0.040，P=0.044）。育成期ME攝入量對(duì)血清TC、TG、UREA、HDL、LDL水平均無(wú)顯著影響（Pgt;0.05）。

由表5可知，育成期ME攝入量對(duì)肝組織TC、TG、UREA、HDL和LDL水平均無(wú)顯著影響（Pgt;0.05）。

2.3 育成期ME攝入量對(duì)17周齡蛋雞生殖器官發(fā)育和激素水平的影響

由表6可知，各試驗(yàn)組蛋雞17周齡等級(jí)卵泡主要為大白卵泡和少量小黃卵泡，未見(jiàn)排卵前卵泡，各試驗(yàn)組蛋雞大白卵泡和小黃卵泡的數(shù)量、重量及指數(shù)相比較均不顯著（Pgt;0.05），各試驗(yàn)組蛋雞輸卵管長(zhǎng)度、長(zhǎng)度體重比、重量及指數(shù)相比較差異均不顯著（Pgt;0.05），但卵巢基質(zhì)部重量和指數(shù)均隨能量限飼強(qiáng)度增加呈先增加后減小的二次曲線（P= 0.012，P=0.024）。

由圖1可知，血漿雌二醇水平隨著育成期能量限飼強(qiáng)度增加顯著線性增加（P=0.026），育成期能量限飼對(duì)血漿孕酮水平無(wú)顯著影響（Pgt;0.05）。

2.4 卵巢基質(zhì)部轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量分析

由表7可知，對(duì)8個(gè)cDNA文庫(kù)測(cè)序共獲得了607 413 360條序列和605 275 266條高質(zhì)量的純凈序列，純凈序列在原始序列中占比高于99.62%，說(shuō)明低質(zhì)量序列較少，測(cè)序效果較好，平均GC含量為48.45%，堿基分布符合理論分布比例；原始序列平均堿基數(shù)為11.39 Gb，純凈序列平均堿基數(shù)為11.30 Gb，即99.22％的原始序列達(dá)到質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。Q20和Q30的純凈序列含量分別高于97.38%和92.87%，表明測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果可靠，可進(jìn)一步分析。將純凈序列與雞核糖體序列比對(duì)，99.76%以上的純凈序列未比對(duì)到核糖體上，去除比對(duì)上的序列后可進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)錄組分析。

2.5 參考基因組比對(duì)分析

將各樣品純凈序列去重后的唯一序列與雞參考基因組對(duì)比（表8），純凈序列匹配到雞參考基因組的比例均超過(guò)了94.61%，4.77%～5.39%的reads未匹配到基因組的任何位置，92.65%～93.31%的純凈序列匹配到唯一基因組位置，1.87%～2.01%的純凈序列匹配到多個(gè)基因組位點(diǎn)。

2.6 基因表達(dá)分析

由圖2可知，17周齡8個(gè)樣本共檢測(cè)出18 699個(gè)表達(dá)的基因，其中ALF17W組蛋雞卵巢基質(zhì)部檢測(cè)到18 432個(gè)基因，ERF17W組檢測(cè)到18 239個(gè)基因，ALF17W組和ERF17W組同時(shí)檢測(cè)出17 972個(gè)基因，單獨(dú)檢到的基因數(shù)分別為460和267個(gè)。

2.7 差異表達(dá)基因篩選

由圖3可知，ALF17W與ERF17W共篩選出1 299個(gè)差異基因，其中ERF17W組338個(gè)上調(diào)，961個(gè)下調(diào)。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類(lèi)分析，根據(jù)差異基因表達(dá)量計(jì)算樣品間的距離和樣品間的相關(guān)性，同一組的四個(gè)樣品聚在同一簇中。

2.8 差異表達(dá)基因功能分析

2.8.1 GO功能富集分析

對(duì)ALF17W組和ERF17W組差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)48個(gè)顯著富集的GO條目（Plt;0.05），主要富集在生物調(diào)節(jié)（Biological regulation）、多細(xì)胞生物過(guò)程（Multicellular organismal process）、細(xì)胞增殖（Cell proliferation）、發(fā)育（Development）、生殖（Reproduction）等條目（圖4），其中與能量代謝或繁殖性能相關(guān)的基因有cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）、類(lèi)固醇生成急性調(diào)節(jié)蛋白（StAR）、孕激素受體（PGR）、代謝型谷氨酸受體1（GRM 1）和細(xì)胞骨架蛋白角蛋白（KRT18）等5個(gè)候選基因。

2.8.2 KEGG信號(hào)通路富集分析

對(duì)ALF17W組和ERF17W組差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析（圖5），發(fā)現(xiàn)25個(gè)顯著富集的KEGG通路（Plt;0.05），其中富集最為顯著的前20個(gè)信號(hào)通路主要包括ECM受體相互作用（ECM-receptor "interaction）、cAMP信號(hào)通路（cAMP signaling pathway）、雌激素信號(hào)通路（Estrogen signaling pathway）等（表9），這些通路與能量代謝或繁殖性能相關(guān)，可能是育成期ME攝入量調(diào)控蛋雞雌激素生成的潛在通路。

2.9 差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，從ALF17W與ERF17W組測(cè)序結(jié)果中分別隨機(jī)選取10個(gè)參與能量代謝或雌激素生成的差異表達(dá)的mRNAs（ADIPOQ、APOA1、CD36、COL3A1、CREB1、FABP5、MGST2、PLTP、RAC2和StAR），進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。如圖6所示，qRT-PCR結(jié)果與測(cè)序結(jié)果高度一致，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組分析獲得的差異表達(dá)基因是準(zhǔn)確的。

3 討 論

3.1 育成期ME攝入量對(duì)蛋雞體重、體重CV和體尺的影響

6～17周齡，各組試驗(yàn)雞等量飼喂，除ME水平外，各組試驗(yàn)飼糧其它營(yíng)養(yǎng)素水平均相同，因此，各組試驗(yàn)雞其它營(yíng)養(yǎng)素?cái)z入量均相同，各試驗(yàn)組處理差異實(shí)際上是6～17周齡試驗(yàn)雞ME攝入量的差異。本試驗(yàn)中，隨著育成期ME攝入量的減少，試驗(yàn)雞17周齡體重、體斜長(zhǎng)、跖圍均顯著線性減小，表明ME限飼組蛋雞的ME攝入量顯著影響了蛋雞的生長(zhǎng)，延遲了蛋雞的體成熟。有關(guān)育成期ME攝入量對(duì)蛋雞生長(zhǎng)發(fā)育影響的研究報(bào)道相對(duì)較少，對(duì)蛋雞體尺的影響研究未見(jiàn)報(bào)道，在肉雞上有研究表明，與自由采食組肉雞相比，限飼期結(jié)束時(shí)限飼組肉雞體重顯著下降，但這種差異在轉(zhuǎn)換為自由采食1周后消失［11］。Butzen等［12］研究發(fā)現(xiàn)，與自由采食組相比，8～16日齡限飼20%組肉雞16日齡體重顯著下降，但限飼對(duì)35日齡的肉雞體重?zé)o顯著影響。Urdaneta-Rincon和Leeson［13］研究發(fā)現(xiàn)，14至17、20、23、26或29日齡，限飼10%均能顯著影響肉雞公雞35日齡體重，但對(duì)42和49日齡體重?zé)o顯著影響。Novel等［14］研究發(fā)現(xiàn)，與自由采食組相比，14～21日齡限飼50%組肉雞公、母雞42日齡體重均顯著下降，但14～21日齡限飼25% 對(duì)35日齡體重?zé)o顯著影響。Lu等［4］研究育成期ME限飼及預(yù)產(chǎn)期轉(zhuǎn)換成自由采食對(duì)如皋黃雞后備母雞生長(zhǎng)發(fā)育影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)，8～18周齡能量限飼顯著影響18周齡蛋雞體重，但轉(zhuǎn)換成預(yù)產(chǎn)料自由采食3周后，體重與未限飼組蛋雞相比較差異不顯著。以上研究均說(shuō)明限飼會(huì)影響限飼期末家禽的生長(zhǎng)發(fā)育，這種影響可能持續(xù)到轉(zhuǎn)換為自由采食后，影響的周期可能與蛋雞品種和限飼強(qiáng)度（限飼量和限飼周期）密切相關(guān)。本研究中，試驗(yàn)雞17周齡體重、體斜長(zhǎng)和跖圍均顯著減小，本試驗(yàn)選用的試驗(yàn)動(dòng)物為海蘭褐蛋雞，限飼周期為6～17周齡，限飼量分別為自由采食組的90%和80%，這些試驗(yàn)因素與以上研究均不相同。

3.2 育成期ME攝入量對(duì)蛋雞血液和肝組織生化指標(biāo)的影響

本試驗(yàn)中，隨育成期ME攝入量的減少，試驗(yàn)雞17周齡血清GLU和UN含量均顯著線性減小。GLU是能量代謝的最終產(chǎn)物，說(shuō)明6～17周齡ME限飼造成ME攝入量的減少，進(jìn)而其代謝產(chǎn)物（血液GLU）顯著降低。血液UN是反應(yīng)機(jī)體對(duì)飼糧粗蛋白質(zhì)利用效率的指標(biāo)，本研究中血液UN含量降低表明限飼組蛋雞提高了機(jī)體對(duì)飼糧CP的利用效率［15］，本試驗(yàn)中限飼組蛋雞ME攝入量可能太低，導(dǎo)致細(xì)胞能量?jī)?chǔ)備不足，細(xì)胞加快氨基酸分解，通過(guò)轉(zhuǎn)氨基作用為機(jī)體供能。有關(guān)限飼對(duì)蛋雞血液和肝臟生化指標(biāo)的研究未見(jiàn)報(bào)道，但自由采食情況下，有研究表明飼糧ME水平顯著影響蛋雞血清TG、UN、HDL等水平，但研究結(jié)果并不一致［15］。這可能與試驗(yàn)雞品種、日齡、飼糧組成和ME設(shè)置梯度等不同有關(guān)。本試驗(yàn)中，ME限飼組蛋雞的ME攝入量不能滿足機(jī)體生長(zhǎng)需要，因此血液中能量代謝產(chǎn)物顯著降低，進(jìn)一步的，機(jī)體可能提高粗蛋白質(zhì)的利用效率，增加粗蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)氨基作用進(jìn)行能量補(bǔ)充。

3.3 育成期ME攝入量對(duì)蛋雞生殖器官發(fā)育和激素水平的影響

育成期ME攝入量可用于調(diào)控性成熟時(shí)間及卵泡和輸卵管等生殖器官的發(fā)育速度［10］。將6周齡～開(kāi)產(chǎn)能量攝入量限制到自由采食的2/3，可使春季飼養(yǎng)的白來(lái)航蛋雞性成熟延遲3周［7］。7～15周齡和7周齡～開(kāi)產(chǎn)限飼均能延遲肉種雞（Hybro G）開(kāi)產(chǎn)日齡［16］。8～18周齡86%能量限飼延遲了如皋黃雞18、20、22和24周齡的生殖器官發(fā)育，對(duì)26和28周齡無(wú)顯著影響，試驗(yàn)雞開(kāi)產(chǎn)日齡、5%產(chǎn)蛋率日齡和50%產(chǎn)蛋率日齡分別被延遲了4.2、8.9和5.5 d［4］。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)雞17周齡等級(jí)卵泡主要為大白卵泡和少量小黃卵泡，未見(jiàn)排卵前卵泡，各試驗(yàn)組蛋雞卵泡和輸卵管發(fā)育指標(biāo)均差異不顯著，僅卵巢基質(zhì)部重量和指數(shù)隨能量限飼強(qiáng)度增加呈先增加后減小的二次曲線。說(shuō)明17周齡時(shí)，蛋雞生殖器官仍處于快速發(fā)育時(shí)期，育成期ME攝入量對(duì)生殖器官發(fā)育的影響可能并未完全顯現(xiàn)出來(lái)。理論上，育成期至開(kāi)產(chǎn)，蛋雞體重首先開(kāi)始快速增加，先達(dá)到體成熟，增重開(kāi)始減慢，輸卵管和卵巢等生殖器官開(kāi)始快速發(fā)育［17］，逐漸達(dá)到性成熟。

但是，本研究表明，隨著育成期ME攝入量的減少，17周齡蛋雞血液雌二醇水平顯著線性增加，說(shuō)明限飼組蛋雞可能通過(guò)生理調(diào)節(jié)分泌了更多的雌二醇激素，以促進(jìn)生殖器官發(fā)育，且限飼組蛋雞雌激素分泌的顯著增加發(fā)生在體重仍顯著小于對(duì)照組的時(shí)間點(diǎn)（17周齡）。為初步探明育成期ME攝入量調(diào)控雌二醇分泌的機(jī)制，本試驗(yàn)進(jìn)一步研究了血液雌二醇水平差異顯著組蛋雞卵巢基質(zhì)部的差異表達(dá)基因和信號(hào)通路。

3.4 育成期ME攝入量對(duì)蛋雞卵巢基因表達(dá)的影響

對(duì)能量限飼后（17周齡）卵巢基質(zhì)部組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，ALF17W與ERF17W共篩選出1 299個(gè)差異基因，其中ERF17W組338個(gè)上調(diào)，961個(gè)下調(diào)，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)，同一組四個(gè)樣品的差異表達(dá)基因聚在同一簇中，說(shuō)明本研究樣本采集準(zhǔn)確可靠。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)48個(gè)顯著富集的GO條目，主要富集在生物調(diào)節(jié)、多細(xì)胞生物過(guò)程、細(xì)胞增殖、發(fā)育、生殖等條目，其中StAR、CREB1、KRT18、PGR、GRM1等基因在上述多個(gè)GO條目中富集，說(shuō)明它們是較為重要的GO條目和差異基因。通過(guò)KEGG信號(hào)通路富集分析，發(fā)現(xiàn)25個(gè)顯著富集的KEGG通路，主要包括ECM受體相互作用、cAMP信號(hào)通路、類(lèi)固醇激素生物合成、催產(chǎn)素信號(hào)通路、松弛素信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路等，其中cAMP信號(hào)通路、膽固醇代謝通路、類(lèi)固醇激素生物合成通路和雌激素信號(hào)通路引起我們極大關(guān)注，這些通路與能量代謝或繁殖密切相關(guān)，說(shuō)明育成期ME攝入量調(diào)控蛋雞雌激素變化的差異表達(dá)基因可能與這幾個(gè)信號(hào)通路有關(guān)。

蛋雞性成熟是由多個(gè)基因和通路共同調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，動(dòng)物卵巢產(chǎn)生可用的卵母細(xì)胞取決于促性腺激素對(duì)卵泡發(fā)育、顆粒細(xì)胞成熟、排卵及黃體化的調(diào)節(jié)作用，cAMP信號(hào)通路可以調(diào)控促性腺激素對(duì)顆粒細(xì)胞與膜細(xì)胞功能進(jìn)行調(diào)節(jié)［18］。卵巢類(lèi)固醇激素包括雄激素、雌激素、孕激素等［19］，是一類(lèi)四環(huán)脂肪烴化合物，主要由膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞分泌而來(lái)，是蛋雞性成熟過(guò)程的重要表型指標(biāo)，對(duì)生殖器官發(fā)育和性成熟具有重要的調(diào)控作用［20］，而膽固醇是卵巢類(lèi)固醇激素生成的主要前體物質(zhì)。性成熟過(guò)程中，蛋雞對(duì)雌激素的敏感度比較高，提高營(yíng)養(yǎng)素?cái)z入能夠促進(jìn)雌激素分泌，雌激素進(jìn)一步促進(jìn)肝脂質(zhì)合成，脂質(zhì)的合成為卵泡中卵黃的合成提供基礎(chǔ)，最終促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)［21］。

本試驗(yàn)篩選的差異基因StAR、CREB1等富集在cAMP信號(hào)通路，KRT18、PGR、GRM1等富集在雌激素信號(hào)通路。在卵泡發(fā)育過(guò)程中，卵母細(xì)胞的發(fā)育和減數(shù)分裂等過(guò)程都需要大量的能量［22］，其中能量代謝相關(guān)的信號(hào)通路cAMP-PKA參與生殖激素的合成和卵泡的發(fā)育：cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白CREB通過(guò)cAMP-PKA途徑磷酸化，與 cAMP 反應(yīng)元件（CRE）結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控與膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞增殖分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)卵泡發(fā)育［23］；磷酸化的ERK也可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白cyclinD2和類(lèi)固醇生成急性調(diào)節(jié)蛋白StAR的表達(dá)，StAR將膽固醇從線粒體外膜轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)膜，通過(guò)正向和負(fù)向調(diào)節(jié)因子影響卵巢雌激素的生成以及膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的增殖分化［24］。CREB家族包括CREB1、CREM和ATF1等，在哺乳動(dòng)物中，CREB是細(xì)胞能量平衡的關(guān)鍵感受器，研究表明，CREB和CREB轉(zhuǎn)錄激活因子（CRTC2）能夠在轉(zhuǎn)錄水平上整合由能量和激素調(diào)節(jié)的細(xì)胞信號(hào)通路［25］，且在糖異生和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)程中發(fā)揮重要作用［26］，低能引起細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度升高，促進(jìn)核內(nèi)CRTC2表達(dá)和活化并與CREB結(jié)合，激活下游基因轉(zhuǎn)錄［27］。StAR是一類(lèi)可以通過(guò)激素進(jìn)行誘導(dǎo)的線粒體蛋白，主要存在類(lèi)固醇激素合成的過(guò)程中［28］。類(lèi)固醇激素合成細(xì)胞中的促性腺激素通過(guò)激活G蛋白和腺苷酸環(huán)化酶，提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，活化蛋白激酶A（PKA），活化的PKA進(jìn)入細(xì)胞核磷酸化CREB等轉(zhuǎn)錄蛋白［29］，磷酸化的CREB結(jié)合到StAR上的CREB結(jié)合區(qū)，作為轉(zhuǎn)錄因子激活StAR，刺激StAR基因表達(dá)，StAR蛋白能夠?qū)⒕€粒體外膜的膽固醇遞送到內(nèi)膜，由CYP11A將不溶性膽固醇裂解為可溶性的P5，進(jìn)而生成類(lèi)固醇激素［30］。KRT18可用作滋養(yǎng)外胚層分化的標(biāo)志物［31］，在卵巢中，卵泡的選擇和成熟以及排卵直接由附近的免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)，KRT18參與免疫防御過(guò)程的基因在卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體培養(yǎng)物中上調(diào)，可作為卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體生長(zhǎng)和發(fā)育以及顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞增殖的有用分子標(biāo)記［32］。PGR在性激素的生物合成通路中具有重要的作用，與繁殖性狀密切相關(guān)［33］，在能量限制情況下低表達(dá)［34］，發(fā)情期高表達(dá)，且與孕酮水平密切相關(guān)［35］。GRM1基因多態(tài)性可能是控制哺乳動(dòng)物季節(jié)性繁殖及產(chǎn)仔數(shù)的潛在分子標(biāo)記［36］。因此，本研究中，預(yù)測(cè)CREB1、StAR、KRT18、PGR、GRM1等基因可能是育成期ME攝入量調(diào)控蛋雞生殖器官發(fā)育和雌激素生成的關(guān)鍵候選基因。但是目前育成期ME攝入量調(diào)控家禽生殖器官發(fā)育和雌激素生成的研究在分子層面上較少，還不夠清晰，需要深入探究其作用機(jī)制。

4 結(jié) 論

4.1 隨育成期ME攝入量減少，育成期末蛋雞體重、血清UN和GLU含量均顯著線性減小，但血漿雌二醇水平顯著線性增加。

4.2 減少育成期ME攝入量可能通過(guò)調(diào)控蛋雞卵巢組織StAR、CREB1、KRT18、PGR和GRM1等基因的表達(dá)，作用于cAMP信號(hào)通路和雌激素信號(hào)通路，以調(diào)控蛋雞能量代謝和雌激素生成。

4.3 建議6～17周齡蛋雞采用9.87 MJ·kg-1代謝能水平飼糧定量飼喂，以促進(jìn)育成期末蛋雞雌激素生成。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ BESTMAN M，RUIS M，HEIJMANS J，et al.Poultry signals：a practical guide for bird focused poultry farming［M］.Zutphen：Roodbont Publishers B.V.，2011：42-55.

［2］ FRIKHA M，SAFAA H M，JIMNEZ-MORENO E，et al.Influence of energy concentration and feed form of the diet on growth performance and digestive traits of brown egg-laying pullets from 1 to 120 days of age［J］.Anim Feed Sci Technol，2009，153（3-4）：292-302.

［3］ AFROUZIYEH M，ZUKIWSKY N M，ZUIDHOF M J.Timing of growth affected broiler breeder feeding motivation and reproductive traits［J］.Poult Sci，2021，100（9）：101375.

［4］ LU J，QU L，LI Y F，et al.Effects of energy-restricted feeding during rearing on the performance，uniformity，and development of Rugao layer breeders at the initiation of the laying period［J］.Animals （Basel），2021，11（8）：2222.

［5］ PAN Y E，LIU Z C，CHANG C J，et al.Feed restriction ameliorates metabolic dysregulation and improves reproductive performance of meat-type country chickens［J］.Anim Reprod Sci，2014，151（3-4）：229-236.

［6］ ZUIDHOF M J，F(xiàn)EDORAK M V，OUELLETTE C A，et al.Precision feeding：innovative management of broiler breeder feed intake and flock uniformity［J］.Poult Sci，2017，96（7）：2254-2263.

［7］ FULLER H L，CHANEY L W.Effect of delayed maturity of white leghorn chickens on subsequent productivity［J］.Poult Sci，1974，53（4）：1348-1355.

［8］ 盧 建，王克華，楊曉東，等.育成期飼糧代謝能水平對(duì)開(kāi)產(chǎn)時(shí)如皋黃雞生長(zhǎng)發(fā)育的影響［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2022，53（7）：2215-2227.

LU J，WANG K H，YANG X D，et al.Effects of dietary metabolizable energy levels during rearing on growth and development of Rugao yellow chicken at the Initiation of the laying period［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2022，53（7）：2215-2227.（in Chinese）

［9］ LU J，LI Y F，QU L，et al.Effects of energy-restricted feeding during rearing on sexual maturation and reproductive performance of Rugao layer breeders［J］.Poult Sci，2021，100（8）：101225.

［10］ LU J，WANG Q，WANG K H，et al.Effects of energy restriction during growing phase on the productive performance of Hyline brown laying hens aged 6 to 72 wk［J］.Poult Sci，2023，102（10）：102942.

［11］ VAN DER KLEIN S A S，SILVA F A，KWAKKEL R P，et al.The effect of quantitative feed restriction on allometric growth in broilers［J］.Poult Sci，2017，96（1）：118-126.

［12］ BUTZEN F M，RIBEIRO A M L，VIEIRA M M，et al.Early feed restriction in broilers.I–performance，body fraction weights，and meat quality［J］.J Appl Poult Res，2013，22（2）：251-259.

［13］ URDANETA-RINCON M，LEESON S.Quantitative and qualitative feed restriction on growth characteristics of male broiler chickens［J］.Poult Sci，2002，81（5）：679-688.

［14］ NOVEL D J，NGAMBI J W，NORRIS D，et al.Effect of different feed restriction regimes during the starter stage on productivity and carcass characteristics of male and female Ross 308 broiler chickens［J］.Int J Poult Sci，2009，8（1）：35-39.

［15］ 盧 建，王克華，楊曉東，等.飼糧代謝能水平對(duì)3～8周齡如皋黃雞生長(zhǎng)發(fā)育和血清生化指標(biāo)的影響［J］.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2022，34（4）：2301-2313.

LU J，WANG K H，YANG X D，et al.Effects of dietary metabolic energy level on growth and development and serum biochemical indexes of Rugao yellow chickens aged from 3 to 8 weeks［J］.Chinese Journal of Animal Nutrition，2022，34（4）：2301-2313.（in Chinese）

［16］ BRUGGEMAN V，ONAGBESAN O，D′HONDT E，et al.Effects of timing and duration of feed restriction during rearing on reproductive characteristics in broiler breeder females［J］.Poult Sci，1999，78（10）：1424-1434.

［17］ BDCARRATS G Y.Control of the reproductive axis：balancing act between stimulatory and inhibitory input［J］.Poult Sci，2015，94（4）：810-815.

［18］ CHENG Y，ZHU H，REN J，et al.Follicle-stimulating hormone orchestrates glucose-stimulated insulin secretion of pancreatic islets［J］.Nat Commun，2023，14（1）：6991.

［19］ YUAN X H，YANG C R，WANG X N，et al.Progesterone maintains the status of granulosa cells and slows follicle development partly through PGRMC1［J］.J Cell Physiol，2019，234（1）：709-720.

［20］ 李永峰.育成期能量攝入量對(duì)蘇禽綠殼蛋雞母本早期蛋用性能的影響［D］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2017.

LI Y F.The impact of energy intake during growing period on early laying performance of Suqin green eggshell layer female parent［D］.Beijing：Chinese Academy of Agricultural Sciences，2017.（in Chinese）

［21］ RENEMA R A，ROBINSON F E，ZUIDHOF M J.Reproductive efficiency and metabolism of female broiler breeders as affected by genotype，feed allocation，and age at photostimulation.2.Sexual maturation［J］.Poult Sci，2007，86（10）：2267-2277.

［22］ BASTOS N M，GOULART R S，BAMBIL D B，et al.High body energy reserve influences extracellular vesicles miRNA contents within the ovarian follicle［J］.PLoS One，2023，18（1）：e0280195.

［23］ CASARINI L，CRPIEUX P.Molecular mechanisms of action of FSH［J］.Front Endocrinol （Lausanne），2019，10：305.

［24］ PURI P，LITTLE-IHRIG L，CHANDRAN U，et al.Protein kinase a：a master kinase of granulosa cell differentiation［J］.Sci Rep，2016，6：28132.

［25］ KOO S H，F(xiàn)LECHNER L，QI L，et al.The CREB coactivator TORC2 is a key regulator of fasting glucose metabolism［J］.Nature，2005，437（7062）：1109-1114.

［26］ WANG Y G，VERA L，F(xiàn)ISCHER W H，et al.The CREB coactivator CRTC2 links hepatic ER stress and fasting gluconeogenesis［J］.Nature，2009，460（7254）：534-537.

［27］ WANG Y G，LI G，GOODE J，et al.Inositol-1，4，5-trisphosphate receptor regulates hepatic gluconeogenesis in fasting and diabetes［J］.Nature，2012，485（7396）：128-132.

［28］ HIORT O，HOLTERHUS P M，WERNER R，et al.Homozygous disruption of P450 side-chain cleavage （CYP11A1） is associated with prematurity，complete 46，XY sex reversal，and severe adrenal failure［J］.J Clin Endocrinol Metab，2005，90（1）：538-541.

［29］ HAN J B，LI E W，CHEN L Q，et al.The CREB coactivator CRTC2 controls hepatic lipid metabolism by regulating SREBP1［J］.Nature，2015，524（7564）：243-246.

［30］ CORMIER M，GHOUILI F，ROUMAUD P，et al.Influences of flavones on cell viability and cAMP-dependent steroidogenic gene regulation in MA-10 Leydig cells［J］.Cell Biol Toxicol，2018，34（1）：23-38.

［31］ GOOSSENS K，TESFAYE D，RINGS F，et al.Suppression of keratin 18 gene expression in bovine blastocysts by RNA interference［J］.Reprod Fertil Dev，2010，22（2）：395-404.

［32］ CHERMUA B，HUTCHINGS G，KRANC W，et al.Expression profile of new gene markers and signaling pathways involved in immunological processes in human cumulus-oophorus cells［J］.Genes （Basel），2021，12（9）：1369.

［33］ FISCHER D，LAIHO A，GYENESEI A，et al.Identification of reproduction-related gene polymorphisms using whole transcriptome sequencing in the large white pig population［J］.G3 （Bethesda），2015，5（7）：1351-1360.

［34］ 王 震，馬鐵偉，鄧凱平，等.能量限飼和補(bǔ)償對(duì)湖羊生長(zhǎng)性能及相關(guān)激素和肉品質(zhì)的影響［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，41（4）：722-729.

WANG Z，MA T W，DENG K P，et al.Effects of energy restriction and compensation on growth performance，and related hormones and meat quality of Hu sheep［J］.Journal of Nanjing Agricultural University，2018，41（4）：722-729.（in Chinese）

［35］ 陶樂(lè)凱，高何璇，蔡永強(qiáng)，等.甘加型藏羊發(fā)情周期血漿孕酮?jiǎng)討B(tài)變化及HPO軸PGR的表達(dá)［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2023，28（9）：128-135.

TAO L K，GAO H X，CAI Y Q，et al.Dynamic changes of plasma progesterone and expression of HPO axis PGR in Ganjia Tibetan sheep during estrus cycle［J］.Journal of China Agricultural University，2023，28（9）：128-135.（in Chinese）

［36］ ZHU M T，ZHANG H M，YANG H，et al.Polymorphisms and association of GRM1，GNAQ and HCRTR1 genes with seasonal reproduction and litter size in three sheep breeds［J］.Reprod Domest Anim，2022，57（5）：532-540.

（編輯 范子娟）