摘 要： 為了研究能有效免疫防控當(dāng)前流行的O型3個(gè)拓?fù)湫涂谔阋卟《荆╢oot-and-mouth disease virus， FMDV）的疫苗候選株，本研究利用FMDV反向遺傳操作技術(shù)，通過(guò)基因替換，構(gòu)建同時(shí)含當(dāng)前流行的O型三個(gè)拓?fù)湫筒《局杲Y(jié)構(gòu)蛋白基因的重組全長(zhǎng)克隆，轉(zhuǎn)染表達(dá)T7RNA聚合酶的細(xì)胞后拯救重組FMDV，分析結(jié)構(gòu)蛋白基因的重構(gòu)對(duì)病毒生物學(xué)特性的影響；拯救病毒制備滅活疫苗，免疫豬和牛，用體外中和試驗(yàn)初步研究其作為O型FMD疫苗候選株的潛力。結(jié)果表明FMD流行毒株結(jié)構(gòu)蛋白VP1 G-H環(huán)基因的替換沒(méi)有明顯影響重組病毒的噬斑表型和復(fù)制能力，但不同F(xiàn)MDV G-H環(huán)抗原表位對(duì)豬誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生交叉中和抗體水平影響較大，對(duì)牛誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生交叉中和抗體的影響較小，表明FMDV G-H抗原表位是豬免疫優(yōu)勢(shì)的表位。本研究為未來(lái)FMDV疫苗的設(shè)計(jì)提供了重要參考。

關(guān)鍵詞： G-H環(huán)；重組口蹄疫病毒；拯救；免疫原性分析

中圖分類號(hào)： S852.659.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）11-5222-08

收稿日期：2024-01-02

基金項(xiàng)目：“十四五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2023YFD1802501）

作者簡(jiǎn)介：李平花（1973-），女，甘肅武威人，研究員，博士，主要從事病毒分子生物學(xué)和口蹄疫疫苗研究，E-mail： lipinghua@caas.cn

*通信作者：劉在新，主要從事病毒分子生物學(xué)研究，E-mail： liuzaixin@caas.cn;盧曾軍，主要從事病毒生物學(xué)和免疫學(xué)，E-mail： luzengjun@caas.cn

Rescue and Immunogenicity Analysis of Recombinant Foot-and-Mouth Disease Virus with

the Chimera of G-H Loop Gene of the Epidemic Strain

LI" Pinghua1，2， HUANG" Shulun1，2， ZHANG" Keqiang1，2， LIU" Feng1，2， SUN" Pu1，2， LI" Dong1，2，

BAO" Huifang1，2， CAO" Yimei1，2， BAI" Xingwen1，2， MA" Xueqing1，2， LI" Kun1，2， YUAN" Hong1，2，

LIU" Zaixin1，2*， LU" Zengjun1，2*

（1.State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention， College of Veterinary

Medicine， Lanzhou University， Lanzhou Veterinary Research Institute， Chinese Academy of

Agricultural Sciences， Lanzhou 730000，" China;

2.Gansu Province Research Center for Basic Disciplines of Pathogen Biology，

Lanzhou 730046，" China）

Abstract： In order to develop FMD vaccine candidate strain that could effectively prevent and control recently epidemic strains belonging to three topotypes of serotype O FMDV， we constructed recombinant full-length clone containing the structural protein genes belonging to three topotypes of type O FMDV by gene replacement based on FMDV reverse genetic manipulation technique. The recombinant FMDV was rescued after transfection the full-length plasmid into BSR/T7 cells expressing T7 RNA polymerase. The effect of gene reconstruction on the biological characteristics of the recombinant virus was analyzed， pigs and cattle were vaccinated with the vaccines prepared from the recombinant virus and parental virus， the potential of the recombinant virus as a vaccine candidate strain for type O FMD was preliminarily studied by in vitro neutralization test. The results showed that the replacement of G-H loop gene of structural protein VP1 of FMD epidemic strain did not significantly affect the plaque phenotype and replication ability of the recombinant virus， but different G-H has obvious effect on production the cross-neutralizing antibody in pigs， and has little effect on production the cross-neutralizing antibody in cattle， indicating that FMDV G-H loop is the immune dominance epitope for pigs. This study will provide important reference for the design of FMDV vaccine in future.

Key words： G-H loop; recombinant foot-and-mouth disease viruse; rescue; immunogenicity analysis

*Corresponding authors：" LIU Zaixin， E-mail： liuzaixin@caas.cn; LU Zengjun， E-mail： luzengjun@caas.cn

口蹄疫（foot-and-mouth disease， FMD）是豬、牛和羊等主要家畜易感染的一種烈性傳染病。該病的暴發(fā)和流行，嚴(yán)重危害家畜的生產(chǎn)力和畜產(chǎn)品質(zhì)量，影響家畜及其產(chǎn)品的國(guó)際貿(mào)易，給發(fā)病地區(qū)的畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。如1997年我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)暴發(fā)豬FMD，造成超過(guò)80 億美元的經(jīng)濟(jì)損失［1］，2001 年英國(guó)暴發(fā)FMD，造成約237 億英鎊的經(jīng)濟(jì)損失［2］。因此，世界各國(guó)仍十分重視對(duì)FMD的防控。

我國(guó)是FMD流行的國(guó)家，近年來(lái)主要流行A型和O型FMD，其中A型FMD趨于控制，而O型FMD依然嚴(yán)重危害我國(guó)畜牧養(yǎng)殖業(yè)。分析其病原——口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus， FMDV）的遺傳演化，發(fā)現(xiàn)近年流行的O型FMDV主要為三個(gè)拓?fù)湫停壑袞|-南亞型（ME-SA）、東南亞型（SEA）和古典中國(guó)型（Cathay）］中的四個(gè)譜系［PanAsia譜系（ME-SA）、Ind-2001譜系（ME-SA）、Mya-98譜系（SEA）和Cathay譜系］病毒株［3］。其中O/SEA/Mya-98譜系病毒株自2010年流行至今仍未消滅，是近年流行最嚴(yán)重、防控難度最大、且持續(xù)危害我國(guó)畜牧養(yǎng)殖業(yè)的主要病毒株。分析該譜系流行毒株的結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其VP1蛋白上出現(xiàn)了規(guī)律性氨基酸的變異，導(dǎo)致田間流行毒株和疫苗毒株抗原匹配性降低［3］，因此需要及時(shí)篩選抗原性匹配的疫苗候選株。

FMDV粒子由20 面體對(duì)稱的衣殼和一條單股正鏈RNA組成，病毒衣殼由各60分子的結(jié)構(gòu)蛋白VP4、VP2、VP3和VP1組成，它們是病毒感染和疫苗免疫產(chǎn)生保護(hù)性抗體的主要免疫原［4］。FMDV基因在免疫壓力下高度易變，尤其是病毒粒子表面的抗原位點(diǎn)，從而使病毒能夠逃避宿主的免疫識(shí)別。O型FMDV表面至少含有5 個(gè)抗原位點(diǎn)，其中結(jié)構(gòu)蛋白VP1的G-H環(huán)是FMDV誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體最重要的抗原表位，在疫苗免疫保護(hù)方面發(fā)揮著非常重要的作用［4-5］。該環(huán)也是FMDV基因組中變異頻率最高的部位，其上一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的突變常引起病毒抗原性的變異。如中東地區(qū)流行的A型FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1第149 位氨基酸（在G-H環(huán)內(nèi)）的突變導(dǎo)致病毒抗原性的改變，使常用的A型FMD疫苗毒株與流行毒株抗原不匹配［6］。Baba等研究發(fā)現(xiàn)，Asia1型FMD流行株和疫苗毒株G-H環(huán)的不同，導(dǎo)致疫苗不能免疫保護(hù)動(dòng)物免遭流行病毒株的攻擊［7］。

利用病毒反向遺傳操作技術(shù)構(gòu)建能同時(shí)表達(dá)兩種以上病毒亞型抗原的嵌合病毒疫苗也是當(dāng)前疫苗研究主要方向。為了研制能有效免疫防控我國(guó)當(dāng)前流行的O型三個(gè)拓?fù)湫虵MDV的疫苗候選株，本研究以已建立的含兩個(gè)拓?fù)湫虵MDV（Cathay+ME-SA）結(jié)構(gòu)蛋白基因的全長(zhǎng)克隆為骨架，用當(dāng)前流行的Mya-98譜系流行毒株結(jié)構(gòu)蛋白VP1 G-H抗原表位基因（30個(gè)氨基酸）替換嵌合病毒的對(duì)等基因，構(gòu)建含O型三個(gè)拓?fù)湫虵MDV結(jié)構(gòu)蛋白主要免疫基因的重組FMDV，并制備疫苗免疫豬和牛，用體外中和試驗(yàn)初步研究其作為O型FMD疫苗候選株的潛力。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒和病毒

BSR/T7細(xì)胞由德國(guó)Karl-Klaus Conzelmann 教授惠贈(zèng)，BHK-21 細(xì)胞為宿主抗病毒感染與免疫生物學(xué)團(tuán)隊(duì)保存；FMDV 疫苗株O/HN/93（Cathay拓?fù)湫停┤L(zhǎng)感染性克隆的框架［8］上，嵌合疫苗毒株O/TUR/05/2009（ME-SA拓?fù)湫停￢P1 基因的全長(zhǎng)質(zhì)粒pOFS/TURVP1 和半長(zhǎng)質(zhì)粒pSK-Z123/TURVP1［8］ 為蘭州獸醫(yī)研究所宿主抗病毒感染與免疫生物學(xué)團(tuán)隊(duì)構(gòu)建保存。全長(zhǎng)質(zhì)粒pOFS/TURVP1 轉(zhuǎn)染拯救獲得的基因工程病毒rHN/TURVP1 為本團(tuán)隊(duì)保存［8］。FMDV O/GXCX/CHA/2018（MH791316.1）、O/NXYCh/CHA/2018 （MH791315.1）、O/Tibet/99（AJ539138）和O/XJ/CHA/2017（MF461724.1）為國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶BglⅡ、SpeⅠ、NotⅠ、PstⅠ、高保真DNA聚合酶Taq、一步法（one-step）RT-PCR試劑盒、T4 DNA連接酶、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA片段回收試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞JM109均購(gòu)自TaKaRa公司；細(xì)胞培養(yǎng)基、抗生素和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA Ladder購(gòu)自全式金生物科技有限公司；FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體購(gòu)自BOSTER生物工程有限公司；FMDV-3B單克隆抗體由研究團(tuán)隊(duì)制備保存。

1.3 FMDV重組全長(zhǎng)克隆的構(gòu)建

以已構(gòu)建的質(zhì)粒pSK-Z123/TURVP1 為骨架，替換FMDV O/NXYCh/CHA/2018流行毒株G-H 環(huán)基因（長(zhǎng)約30 個(gè)氨基酸）的半長(zhǎng)質(zhì)粒pSK-Z123/TURVP1/NXG-H 由金唯智股份有限公司合成。該質(zhì)粒用SpeⅠ和BglⅡ酶切后將5 400 bp的基因片段插入用同樣酶消化的全長(zhǎng)質(zhì)粒pOFS/TURVP1 中，構(gòu)建重組全長(zhǎng)質(zhì)粒pOFS/TURVP1/NXG-H。重組質(zhì)粒用PstⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒送金唯智股份有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。FMDV 重組全長(zhǎng)基因示意見(jiàn)圖1。

1.4 重組FMDV的拯救

測(cè)序正確的重組全長(zhǎng)質(zhì)粒pOFS/TURVP1/NXG-H 用NotⅠ酶線性化，并純化回收后作為轉(zhuǎn)染模板，用LipofectamineTM2000 介導(dǎo)轉(zhuǎn)染單層BSR/T7細(xì)胞（細(xì)胞培養(yǎng)在六孔板），具體步驟見(jiàn)操作說(shuō)明書。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞置37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。每日觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞出現(xiàn)致細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathogenic effect， CPE）的情況，連續(xù)觀察2～4 d。當(dāng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞出現(xiàn)明顯的CPE時(shí)，收集細(xì)胞，反復(fù)凍融3 次后在BHK-21細(xì)胞上連續(xù)傳代備用。拯救的重組FMDV命名為rHN/TURVP1/NXG-H。

1.5 重組FMDV的鑒定

1.5.1 RT-PCR 和序列測(cè)定

收集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清，提取細(xì)胞總RNA，用一步法RT-PCR 試劑盒和引物VP1-F（AGATAACACAGGGAAAGCC）和VP1-R（CTGATGGCCTTCACTCCAGT）擴(kuò)增含VP1 結(jié)構(gòu)蛋白的特定基因片段?；蚱渭兓厥蘸笏徒鹞ㄖ枪煞萦邢薰具M(jìn)行序列測(cè)定，驗(yàn)證重組病毒的正確性。

1.5.2 間接免疫熒光試驗(yàn)

生長(zhǎng)至70%～80%滿的BHK-21單層細(xì)胞（置12 孔板），分別接種親本病毒和重組病毒。5～8 h后用常規(guī)間接免疫熒光法檢測(cè)感染細(xì)胞是否有FMDV 特定蛋白的表達(dá)。

1.5.3 電鏡觀察

用貼壁BHK-21細(xì)胞分別增殖FMD親本病毒和重組病毒各200 mL，凍融2～3次后，12 000 r·min―1離心收集上清，加BEI滅活。滅活完成后12 000 r·min―1離心，收集病毒上清，4℃條件下35 000 r·min―1離心3 h，收集的沉淀用PBS（pH7.6）緩沖液重懸，磷酸鎢負(fù)染，電鏡觀察病毒粒子的形態(tài)。

1.6 重組病毒的生長(zhǎng)特性

1.6.1 蝕斑試驗(yàn)

將第6代親本病毒和重組病毒分別做10倍系列稀釋，然后將不同稀釋度病毒分別接種長(zhǎng)滿的BHK-21 細(xì)胞（200 μL·孔―1，6孔板），用常規(guī)的噬斑試驗(yàn)方法觀察病毒的蝕斑表型，并計(jì)算每個(gè)病毒的蝕斑形成單位（PFU·mL―1）。

1.6.2 一步生長(zhǎng)曲線

將第6代重組病毒和親本病毒以2×106病毒劑量接種長(zhǎng)滿的單層BHK-21 細(xì)胞（25 mL培養(yǎng)瓶），加5 mL MEM培養(yǎng)基，置于37℃ CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。接種后4、8、12、16和20 h收取樣品，反復(fù)凍融2次，在BHK-21單層細(xì)胞上（96孔板）用噬斑法測(cè)定病毒毒價(jià)（PFU·mL―1）（試驗(yàn)進(jìn)行2次重復(fù)），繪制一步生長(zhǎng)曲線。

1.6.3 重組FMDV遺傳穩(wěn)定性分析

將親本病毒和轉(zhuǎn)染上清接種長(zhǎng)滿的BHK-21單層細(xì)胞（T25細(xì)胞瓶），待接種轉(zhuǎn)染上清的細(xì)胞95%～100%出現(xiàn)CPE時(shí)收獲細(xì)胞，反復(fù)凍融3次后繼續(xù)連續(xù)傳代，觀察第6代后病毒接種細(xì)胞致95%～100%以上細(xì)胞出現(xiàn)典型CPE的時(shí)間，并對(duì)第5、10代病毒進(jìn)行 RT-PCR，檢測(cè)拯救的重組FMDV結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸的變化。

1.7 FMDV滅活疫苗的制備

將電鏡觀測(cè)試驗(yàn)滅活的病毒抗原接種BHK-21細(xì)胞，接種72h后收集細(xì)胞反復(fù)凍融3次后，繼續(xù)在BHK-21細(xì)胞上連傳3～5次，進(jìn)行滅活安全檢驗(yàn)。檢驗(yàn)合格后，蔗糖梯度離心法純化病毒，用液相色譜儀檢測(cè)病毒抗原的146S含量。ISA201佐劑置于37℃恒溫水浴鍋預(yù)熱，按抗原：佐劑體積比=46∶54的比例配制疫苗，置于4～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 動(dòng)物試驗(yàn)

選取90日齡健康易感的豬12 頭和60日齡健康易感的牛14 頭（O型口蹄疫液相阻斷ELISA抗體效價(jià)＜1∶6，3ABC抗體陰性），隨機(jī)分為A組和B組，每組6 頭豬和7 頭牛。A組所有動(dòng)物免疫接種rHN/TURVP1病毒疫苗，B組每頭動(dòng)物免疫接種rHN/TURVP1/NXG-H病毒疫苗，免疫劑量為每頭2 mL（12 μg）。所有動(dòng)物免疫28 d后采血，收集血清，―20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 病毒中和試驗(yàn)

免疫28 d動(dòng)物的血清，用微量病毒中和試驗(yàn)分析免疫血清與我國(guó)當(dāng)前流行的三個(gè)拓?fù)湫偷乃膫€(gè)譜系FMDV株（O/GXCX/CHA/2018、O/HB/HK/99、O/XJ/CHA/2017和O/NXYCh/CHA/2018）的交叉反應(yīng)性，具體步驟參考WOAH標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)病毒回歸試驗(yàn)、陽(yáng)性、陰性、正常細(xì)胞對(duì)照，血清毒性對(duì)照全部成立時(shí)，統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果，用Karber法計(jì)算中和抗體效價(jià)。

2 結(jié) 果

2.1 FMDV重組全長(zhǎng)質(zhì)粒的構(gòu)建

構(gòu)建的重組全長(zhǎng)質(zhì)粒pOFS/TURVP1/NXG-H用PstⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，電泳結(jié)果顯示切出與預(yù)期大小相符的目的條帶（591、3 282和7 200 bp）（見(jiàn)圖2）。酶切鑒定正確的質(zhì)粒送金唯智股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果表明重組質(zhì)粒為正確構(gòu)建的質(zhì)粒，含靶標(biāo)基因的替換（圖略）。

2.2 重組病毒的拯救

線化的重組全長(zhǎng)質(zhì)粒pOFS/TURVP1/NXG-H轉(zhuǎn)染BSR/T7細(xì)胞56 h后，約70%細(xì)胞變大、變圓，而對(duì)照細(xì)胞無(wú)任何變化。隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)，出現(xiàn)CPE的細(xì)胞越來(lái)越多。轉(zhuǎn)染72 h后（圖略）收集轉(zhuǎn)染樣品，反復(fù)凍融后繼續(xù)在BHK-21細(xì)胞上連續(xù)傳代。

2.3 拯救病毒的鑒定

2.3.1 RT-PCR

轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清RT-PCR和序列測(cè)定結(jié)果表明：重組病毒rHN/TURVP1/NXG-H含有預(yù)期的替換，說(shuō)明試驗(yàn)成功構(gòu)建了目的基因替換的重組FMDV。兩個(gè)重組病毒G-H環(huán)氨基酸的差異見(jiàn)圖3。

2.3.2 免疫熒光檢測(cè)

用抗FMDV特異的3B單抗檢測(cè)重組病毒3B蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明兩個(gè)病毒感染的BHK-21 細(xì)胞均能與FMDV 3B單抗反應(yīng)，出現(xiàn)特異的綠色熒光；而對(duì)照細(xì)胞與3B單抗作用看不到任何可見(jiàn)熒光（見(jiàn)圖4），說(shuō)明拯救的重組病毒為FMDV。

2.3.3 電鏡觀察

拯救的重組FMDV磷酸鎢染色后用電鏡觀察，結(jié)果顯示：重組病毒和親本病毒形態(tài)一樣，直徑約為25 nm、病毒粒子呈球形，與FMDV的形態(tài)完全一致（見(jiàn)圖5）。

2.4 重組病毒的生長(zhǎng)特性

2.4.1 噬斑試驗(yàn)

重組病毒和親本病毒的噬斑試驗(yàn)結(jié)果表明2 個(gè)FMDV均可在BHK-21 細(xì)胞上形成大小混合的噬斑，且噬斑大小形態(tài)相似（見(jiàn)圖6A）。

2.4.2 一步生長(zhǎng)曲線

病毒的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明重組病毒和親本病毒具有相似的復(fù)制動(dòng)力學(xué)，說(shuō)明FMDV O/NXYCh/CHA/2018 G-H環(huán)的替換沒(méi)有明顯影響重組FMDV在BHK-21細(xì)胞上的復(fù)制能力（見(jiàn)圖6B）。

2.4.3 重組FMDV的遺傳穩(wěn)定性分析

重組FMDV病毒在BHK-21細(xì)胞上連續(xù)傳代，感染細(xì)胞出現(xiàn)CPE的時(shí)間越來(lái)越短，傳到第6 代時(shí)趨于穩(wěn)定，95%以上細(xì)胞出現(xiàn)CPE的時(shí)間約為12 h左右。對(duì)第5 代和第10 代重組病毒結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果表明拯救重組病毒傳至第10 代未引起任何堿基和氨基酸的突變，說(shuō)明重組病毒遺傳穩(wěn)定。

2.5 病毒中和試驗(yàn)

中和試驗(yàn)的結(jié)果表明：重組病毒疫苗免疫豬均產(chǎn)生了針對(duì)O/NXYCh/CHA/2018、O/XJ/CHA/2017和O/HB/HK/99病毒較低的、保護(hù)性的平均中和抗體（lg抗體滴度gt;1.65，WOAH規(guī)定lg中和抗體滴度≥1.65判為保護(hù)），而親本病毒疫苗免疫豬均產(chǎn)生了針對(duì)這3個(gè)病毒較高的、保護(hù)性的平均中和抗體（lg抗體滴度gt;2.10）（見(jiàn)圖7）；兩個(gè)病毒疫苗均不能誘導(dǎo)豬產(chǎn)生針對(duì)O/GXCX/CHA/2018病毒保護(hù)性的平均中和抗體（lg抗體滴度lt;1.65），但親本病毒疫苗誘導(dǎo)豬產(chǎn)生的針對(duì)O/GXCX/CHA/2018的平均中和抗體顯著（Plt;0.01）高于重組病毒的（見(jiàn)圖7）；而兩個(gè)疫苗免疫的牛均產(chǎn)生了針對(duì)4個(gè)試驗(yàn)病毒保護(hù)性的平均中和抗體（lg抗體滴度gt;1.65）（見(jiàn)圖8）。這些結(jié)果表明流行株O/NXYCh/CHA/2018 G-H環(huán)的替換，明顯降低了重組病毒疫苗免疫豬血清交叉中和當(dāng)前流行的O型FMDV的能力（Plt;0.01），但沒(méi)有明顯影響免疫牛血清交叉中和當(dāng)前流行的O型FMDV的能力，表明FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1的G-H環(huán)是豬免疫優(yōu)勢(shì)的表位。

3 討 論

FMDV滅活疫苗仍是目前FMD防控免疫效果最優(yōu)的疫苗，它在預(yù)防、控制和凈化FMD方面發(fā)揮了非常重要的作用。但FMDV是RNA病毒，基因組高度易變，常出現(xiàn)抗原變異株，需要不時(shí)地篩選與流行毒株抗原高度匹配的疫苗毒株。但傳統(tǒng)的方法篩選FMD疫苗毒株費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，而反向遺傳操作技術(shù)的發(fā)展為新型疫苗的研發(fā)提供了強(qiáng)大的工具，利用該技術(shù)人們可以對(duì)RNA病毒基因進(jìn)行修飾和改造，獲得生產(chǎn)性能提高，抗原匹配，免疫應(yīng)答能力增強(qiáng)的疫苗候選株。

FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1βG-βH環(huán)上有一個(gè)基因高變區(qū)（hyper variable，HV），它在FMDV免疫逃逸中起著非常重要的作用［9-13］。研究表明FMDV可以容忍這些區(qū)域氨基酸的突變，但突變會(huì)影響抗體與表位的結(jié)合以及中和抗體的產(chǎn)生［13-14］。研究也表明嵌合FMDV高度易變的G-H環(huán)抗原表位，能夠提高病毒的交叉反應(yīng)性和疫苗的交叉保護(hù)能力，拓展疫苗的抗原譜［15-16］。另外，研究表明中和抗體是衡量FMD免疫保護(hù)最重要的指標(biāo)之一，與動(dòng)物的保護(hù)效力密切相關(guān)［17］，而體外病毒中和試驗(yàn)是FMD疫苗株篩選的方法之一，它具有操作簡(jiǎn)單，成本低廉，不需要昂貴的動(dòng)物等優(yōu)點(diǎn)，因此，在本研究中，作者利用FMDV反向遺傳操作技術(shù)，在已構(gòu)建重組FMDV的骨架上，替換我國(guó)當(dāng)前多發(fā)的O/SEA/Mya-98流行毒株G-H抗原表位，構(gòu)建重組FMDV，制備疫苗免疫豬、牛，用體外病毒中和試驗(yàn)初步研究重組FMDV作為O型疫苗候選株的潛力。中和試驗(yàn)的結(jié)果表明兩個(gè)疫苗免疫的牛均能對(duì)O型FMD四個(gè)譜系流行毒產(chǎn)生保護(hù)性的平均中和抗體，而兩個(gè)疫苗免疫的豬均能對(duì)O/ME-SA/PanAsia、O/ME-SA/Ind-2001和O/SEA/Mya-98譜系病毒產(chǎn)生保護(hù)性的平均中和抗體，但均不能對(duì)O/Cathay病毒產(chǎn)生保護(hù)性的平均中和抗體，說(shuō)明FMDV不同的G-H環(huán)抗原表位對(duì)豬誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生交叉中和抗體的影響較大，對(duì)牛誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生交叉中和抗體的影響較小，這與先前的報(bào)道一致：FMDV的中和抗原位點(diǎn)的免疫優(yōu)勢(shì)性表位因種屬而不同［18］。

4 結(jié) 論

本研究表明FMDV 結(jié)構(gòu)蛋白VP1上的 G-H環(huán)是豬免疫優(yōu)勢(shì)的表位，這為未來(lái)FMDV疫苗的設(shè)計(jì)提供了重要參考。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ HUANG C C， JONG M H， LIN S Y. Characteristics of foot and mouth disease virus in Taiwan［J］. J Vet Med Sci， 2000， 62（7）：677-679.

［2］ DAVIES G. The foot and mouth disease （FMD） epidemic in the United Kingdom 2001［J］. Comp Immunol Microbiol Infect Dis， 2002， 25（5-6）：331-343.

［3］ 何繼軍， 馬維民， 楊亞民， 等. 我國(guó)O型口蹄疫流行毒株分子溯源［J］. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)， 2019， 49增刊：12-15.

［4］ GRUBMAN M J， BAXT B. Foot-and-mouth disease［J］. Clin Microbiol Rev， 2004， 17（2）：465-493.

［5］ MATEU M G， CAMARERO J A， GIRALT E， et al. Direct evaluation of the immunodominance of a major antigenic site of foot-and-mouth disease virus in a natural host［J］. Virology， 1995， 206（1）：298-306.

［6］ LUDI A B， HORTON D L， LI Y， et al. Antigenic variation of foot-and-mouth disease virus serotype A［J］. J Gen Virol， 2014， 95（2）：384-392.

［7］ BABA SHEIKH M O， RASHID P M A， MAROUF A S， et al. Phylogenic analysis of serotype Asia1 foot-and-mouth disease virus from Sulaimani/Iraq using VP1 protein：heterogeneity with vaccine strain As1/Shamir/89［J］. Iran J Vet Res， 2017， 18（3）：212-215.

［8］ LI P H， HUANG S L， ZHA J J， et al. Evaluation of immunogenicity and cross-reactive responses of vaccines prepared from two chimeric serotype O foot-and-mouth disease viruses in pigs and cattle［J］. Vet Res， 2022， 53（1）：56.

［9］ FERNANDEZ-SAINZ I， GAVITT T D， KOSTER M， et al. The VP1 G-H loop hypervariable epitope contributes to protective immunity against Foot and Mouth Disease Virus in swine［J］. Vaccine， 2019， 37（26）：3435-3442.

［10］ BORREGO B， CAMARERO J A， MATEU M G， et al. A highly divergent antigenic site of foot-and-mouth disease virus retains its immunodominance［J］. Viral Immunol， 1995， 8（1）：11-18.

［11］ MATEU M G， HERNNDEZ J， MARTNEZ M A， et al. Antigenic heterogeneity of a foot-and-mouth disease virus serotype in the field is mediated by very limited sequence variation at several antigenic sites［J］. J Virol， 1994， 68（3）：1407-1417.

［12］ MATEU M G， MARTNEZ M A， CAPUCCI L， et al. A single amino acid substitution affects multiple overlapping epitopes in the major antigenic site of foot-and-mouth disease virus of serotype C［J］. J Gen Virol， 1990， 71（3）：629-637.

［13］ SZCZEPANEK S M， BARRETTE R W， ROOD D， et al. Xenoepitope substitution avoids deceptive imprinting and broadens the immune response to foot-and-mouth disease virus［J］. Clin Vaccine Immunol， 2012， 19（4）：461-467.

［14］ ZAMORANO P， WIGDOROVITZ A， PEREZ-FILGUEIRA M， et al. A 10-amino-acid linear sequence of VP1 of foot and mouth disease virus containing B- and T-cell epitopes induces protection in mice［J］. Virology， 1995， 212（2）：614-621.

［15］ RIEDER E， BAXT B， LUBROTH J， et al. Vaccines prepared from chimeras of foot-and-mouth disease virus （FMDV） induce neutralizing antibodies and protective immunity to multiple serotypes of FMDV［J］. J Virol， 1994， 68（11）：7092-7098.

［16］ BISWAL J K， RANJAN R， PATTNAIK B. Chimeric foot-and-mouth disease virus serotype O displaying a serotype Asia1 antigenic epitope at the surface［J］. Biotechnol Lett， 2016， 38（9）：1509-1517.

［17］ PAY T W F， HINGLEY P J. Foot and mouth disease vaccine potency test in cattle：the interrelationship of antigen dose， serum neutralizing antibody response and protection from challenge［J］. Vaccine， 1992， 10（10）：699-706.

（編輯 白永平）