摘要：目的：構建搭載慶大霉素的45S5生物玻璃支架，對比其生物活性及抗菌能力。方法：采用聚氨酯泡沫模板法制備搭載慶大霉素的45S5生物玻璃支架，制備不同慶大霉素含量的分組；研究支架在生理環(huán)境下的生物活性、降解性能及其體外抗菌能力規(guī)律；并了解研究支架在生物體內骨髓炎模型下的抗菌能力。結果：45S5+8%慶大霉素復合材料對BMSC的增殖沒有明顯的影響；體外細菌抵抗實驗顯示接觸的細菌減少了50%；體內細胞實驗顯示僅有細菌少量聚集；通過吉姆薩染色顯示僅有輕微的炎癥反應，并且有明顯的成骨反應。結論：45S5搭載8%慶大霉素復合支架作為抗生素載體，具有較好的藥物緩釋性及生物相容性，其成骨作用較強；并能根據(jù)缺損形態(tài)進行有效修復，有望成為一種理想的藥物載體和骨缺損修復材料治療骨髓炎。

關鍵詞：生物玻璃；慶大霉素；金黃色葡萄球菌；骨髓炎

臨床上治療骨關節(jié)和軟組織感染主要依賴抗生素，包括全身和局部給藥［1］。但由于受感染區(qū)域血供不足，全身靜脈給藥難以達到有效濃度，可能需增加劑量和給藥頻次，增加患者并發(fā)癥風險［2］。局部直接給藥就成為更佳選擇［3］。研究者一直在探索理想的抗生素載體，通過材料降解在感染部位局部釋放抗生素［4］。本研究旨在構建基于45S5生物玻璃的慶大霉素載藥支架，評估其在模擬生理條件下的活性、降解性和抗菌效果，以及在體內骨髓炎模型中的治療潛力。

1材料和方法

1.1載藥復合支架材料的制備

采用熔融法制備硼酸鹽生物玻璃，主要原料包括分析純的硅酸鹽、碳酸鹽和磷酸鹽，均勻混合后在鉑金坩堝中1 100～1 300 ℃熔化120 min后快速冷卻并研磨成小于50 μm的粉末。接著以1∶10∶20質量比混合殼聚糖、檸檬酸和葡萄糖制成溶液。硅酸鹽生物活性玻璃、硫酸慶大霉素和殼聚糖溶液以2∶1體積比混合成BG/CS/T復合材料，固化20 min后得圓柱形實心片劑（φ4.7 mm×3.5 mm，（98±6.4） mg）。制備兩種不同抗生素質量分數(shù)（4%及8%）的試樣，并以無抗生素樣品為對照。所有試樣在實驗前經(jīng)γ射線消毒。

1.2體外抗生素釋放實驗

將兩種不同抗生素含量的BG/CS/T復合材料試樣各4片，分別浸泡在10 ml磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2～7.4）中，并在37 ℃恒溫條件下孵育。每48 h更新一次PBS，并在無菌條件下用高效液相色譜法測定洗脫液中的替考拉寧濃度。通過計算BG/CS/T復合物釋放的替考拉寧含量，并應用Peppas方程擬合藥物釋放曲線，從而研究其釋放機制：Mt/M∞=k

瘙 簚 tn。方程中，Mt/M∞代表時間t的藥物累積釋放率，k是與藥物和載體物理性質相關的釋放速率常數(shù)，n是表征藥物釋放機理和載體形狀的特征指數(shù)，詳細解釋見Peppas模型。

1.3生物相容性檢測

利用CCK8試劑盒評估BMSCs在慶大霉素復合材料上的增殖狀況。簡述實驗步驟如下：BMSCs接種于3組硼酸鹽生物玻璃支架，培養(yǎng)周期分別為1天、3天和7天，接種密度為每樣品104細胞。各時間點，向每孔加入360 μL培養(yǎng)基和40 μL CCK8溶液，繼續(xù)在37 ℃孵育4 h。隨后，從24孔板每孔抽取100 μL反應液至96孔板中，使用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度。

1.4體外抗菌實驗

在體外抗菌實驗中，以骨科常見致病菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， ATCC25923）為對象，測試樣品45S5生物玻璃及其含有不同質量分數(shù)慶大霉素的復合材料（45S5+4%慶大霉素和45S5+8%慶大霉素）的抗菌效果。通過比較實驗組與對照組（原始45S5生物玻璃）的菌落數(shù)，計算抑菌率。

抑菌率=［（對照組菌落數(shù)）-實驗組菌落數(shù)］/對照組菌落數(shù)×100%

實驗步驟如下：紫外燈消毒無菌臺30～60 min。向含5 mLB肉湯的EP管中加入100 μL菌原液和樣品，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。取出EP管，搖勻，取100 μL稀釋105倍。取50 μL稀釋液滴入冷肉湯瓊脂培養(yǎng)皿，用涂棒涂抹。封口膜封培養(yǎng)皿，37 ℃培養(yǎng)12～16 h。菌落計數(shù)，記錄數(shù)據(jù)和拍照。

1.5抵抗細菌黏附實驗

本實驗采用金黃色葡萄球菌進行表面黏附實驗（抵抗細菌接觸實驗）使用0.9% NaCl的生理鹽水調整細菌懸液至105 CFU/mL。將樣品（45S5及含4%和8%慶大霉素的45S5復合材料）放入12孔板底部。向每孔加入1.5 mL細菌溶液，37 ℃孵育3 h。用無菌PBS輕輕清洗樣品5次。將樣品在3 mL PBS中振蕩2次，每次3 min，以去除表面細菌。采用標準平板計數(shù)法計數(shù)脫落的細菌。

1.6體內抗菌實驗

在體內抗菌實驗中，使用金黃色葡萄球菌，與體外實驗相對應。動物在適宜的環(huán)境下飼養(yǎng)，所有程序符合國家動物福利法。樣品45S5及其含抗生素復合材料分別植入大鼠，手術在無菌環(huán)境下進行。術前禁食24 h，麻醉后固定進行手術，植入樣品并注射細菌懸液。術后給予生理鹽水補液，設立未注射細菌的空白對照組。30天后處死大鼠，取出植入體及周圍組織，進行組織學檢查和菌落計數(shù)。

2結果與討論

2.1體外抗生素釋放結果

慶大霉素復合材料浸泡時間累積釋放曲線見圖1。

圖1慶大霉素復合材料浸泡時間累積釋放曲線

圖1展示了含4%和8%慶大霉素的復合材料在PBS中的慶大霉素累積釋放曲線。兩種材料顯示出類似釋放動力學，即初始快速釋放后轉為緩慢穩(wěn)定。第1天時，4%和8%復合材料的累積釋放量分別達到總量的42.11%和48.65%，7天后分別為68.52%和70.74%，隨后進入穩(wěn)定期。兩組樣本的總釋放時間分別為23天和39天，累積釋放率為78.91%和85.76%。慶大霉素作為水溶性抗生素，PBS使其在載體內溶解形成高濃度，而載體表面的殼聚糖絡合集團及HA層限制藥物釋放，形成內外濃度差推動藥物擴散。藥物釋放由溶解和擴散兩階段組成，由于溶解快于擴散，整個過程由后者控制。

2.2細胞相容性結果

圖2（A）顯示了BMSCs在不同材料上1天、3天和7天的增殖情況。通過CCK8實驗結果顯示，45S5生物玻璃及其含4%和8%慶大霉素的復合材料都能支持BMSCs增殖。各時間點的細胞增殖率在不同材料間沒有顯著差異，表明慶大霉素的加入并未影響B(tài)MSCs的增殖能力。

（A）

（B）

圖2（A）BMSCs在45S5、45S5+4%慶大霉素和45S5+8%

慶大霉素復合材料上的增殖情況；（B）45S5、45S5+4%

慶大霉素和45S5+8%慶大霉素復合材料對金黃色葡萄球

菌在24 h以及48 h的抑菌效果（LB肉湯中）2.3體內抗菌實驗結果

圖2（B）展示了含慶大霉素的復合材料對金黃色葡萄球菌的抗菌效果。經(jīng)24 h和48 h共培養(yǎng)，平板計數(shù)結果指出，添加慶大霉素的復合材料對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出顯著殺菌作用。含4%慶大霉素的45S5復合材料在24 h抗菌效率為35.2±6.7%，48 h為42.1±6.4%。含8%慶大霉素的復合材料抗菌活性更強，顯示出更優(yōu)的抗菌效果，特別是對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌。

2.4體內抗菌實驗結果

圖3（A）45S5、45S5+4%慶大霉素和45S5+8%慶大

霉素復合材料植入股骨髁后表面及周圍收集液細菌

培養(yǎng)結果；（B）45S5、45S5+4%慶大霉素和45S5+8%

慶大霉素復合材料植入股骨髁吉姆薩染色結果

圖3（A）顯示了45S5+8%慶大霉素復合材料體外表現(xiàn)出良好的抗菌活性，但關鍵的體內抗菌效果也通過實驗得到驗證。研究針對醫(yī)院常見病原菌金黃色葡萄球菌，30天體內培養(yǎng)后，取樣分析顯示45S5對照組細菌密集，而含慶大霉素的組織表面細菌少。平板計數(shù)結果支持慶大霉素復合材料的抗菌效果。圖3（B）顯示進一步的吉姆薩染色揭示，與45S5相比，含藥復合材料引起輕微炎癥但促進骨形成。

3結語

制備的生物玻璃殼聚糖復合材料具備類似人骨的強度，適用于承重骨缺損修復。材料能長期緩釋抗生素，滿足骨髓炎治療需求，釋放期可達3～4周。復合材料還具有良好的藥物緩釋性、生物相容性及促進骨再生能力，可根據(jù)缺損定制修復，是治療骨髓炎的理想選擇。

參考文獻：

［1］章峰火，胡玉祥，張文正，等.抗生素鹽水沖洗治療手部骨關節(jié)感染［J］.實用手外科雜志，2017，31（1）：3.

［2］劉飛、崔宇韜、劉賀.局部抗生素遞送系統(tǒng)治療骨髓炎的優(yōu)勢與問題［J］.中國組織工程研究，2021，25（4）：7.

作者簡介：胡浙安，男，安徽廬江人，高級工程師，本科，研究方向：無機非金屬材料。