摘要：為明確施用菜籽餅或菜籽油對植煙土壤代謝物的影響，采用擬靶向代謝組學(xué)技術(shù)，分析土壤差異代謝物的變化特征。結(jié)果表明：與未施用菜籽餅或菜籽油的對照土壤比較，施用菜籽餅篩選出43種土壤差異代謝物，施用菜籽油共篩選出9種。施用菜籽餅培養(yǎng)的土壤，土壤差異代謝物主要為谷氨酰胺、脯氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、亮氨酸、L-異亮氨酸、焦谷氨酸和賴氨酸8種氨基酸，上調(diào)表達(dá)14.72～207.94倍；施用菜籽油培養(yǎng)的土壤，土壤差異代謝物主要為油酸、油酸異構(gòu)體、十六烯酸異構(gòu)體、二十酸和海松酸5種有機(jī)酸，上調(diào)表達(dá)1.73～225.97倍，另有乳糖和松二糖2種糖類分別上調(diào)表達(dá)3.12和16.91倍。綜合可知，施用菜籽餅增加土壤中氨基酸等高氮代謝物積累，施用菜籽油提高土壤中有機(jī)酸、糖等高碳代謝物積累。

關(guān)鍵詞：植煙土壤；土壤培養(yǎng)；菜籽餅；菜籽油；土壤代謝物

中圖分類號：S154.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-060X（2024）09-0063-05

Effects of Rapeseed Meal or Oil on Differential Metabolites in Tobacco-Planting Soil

LONG Yong1，LIN Ye-chun2，CAI Kai2，AI Yong-feng3，LI Hong-xun2，CHEN Dai-rong3

（1. Songtao Branch of Tongren Tobacco Company， Songtao 554100， PRC; 2. Guizhou Academy of Tobacco Science， Guiyang 550081， PRC; 3. Tongren Tobacco Company， Guizhou Provincial Tobacco Company， Tongren 554300， PRC）

Abstract： Pseudo-targeted metabolomics was employed to identify the differential metabolites in soil， on the basis of which the effects of the application of rapeseed meal or oil on metabolites in tobacco-planting soil were examined. Compared with the soil without application of rapeseed meal or oil， the soil with application of rapeseed meal and oil showed 43 and 9 differential metabolites， respectively. The differential metabolites in the soil with the application of rapeseed meal were mainly glutamine， proline， alanine， γ-aminobutyric acid， leucine， L-isoleucine， pyroglutamic acid， and lysine， which were up-regulated by 14.72 to 207.94 folds. The differential metabolites in soil with the application of rapeseed oil mainly included oleic acid， oleic acid isomers， hexadecenoic acid isomers， eicosoic acid， and pimaric acid， which were up-regulated by 1.73 to 225.97 folds. In addition， lactose and turanose were up-regulated by 3.12 folds and 16.91 folds， respectively， in the soil treated with rapeseed oil. In conclusion， the application of rapeseed meal promoted the accumulation of high nitrogen-containing metabolites such as amino acids in the soil， while the application of rapeseed oil increased the accumulation of high carbon-containing metabolites such as organic acids and sugars in the soil.

Key words： tobacco-planting soil; soil culture; rapeseed meal; rapeseed oil; soil metabolite

菜籽餅又稱油枯，是油菜籽榨油后余下的副產(chǎn)物，含有豐富的蛋白質(zhì)等含氮有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)，是優(yōu)質(zhì)的有機(jī)肥源，能夠改善土壤條件[1]。菜籽餅肥在腐解過程中，銨態(tài)氮含量先快速升高后大幅回落，硝態(tài)氮含量則持續(xù)升高，但總氮含量仍表現(xiàn)為增加趨勢；菜籽餅含有大量有機(jī)質(zhì)，能夠疏松土壤結(jié)構(gòu)，有效降低土壤容重[2]。施用菜籽餅肥，可提高煙葉產(chǎn)量和產(chǎn)值，改善初烤煙葉質(zhì)量。施用菜籽餅可提高初烤煙葉單位面積產(chǎn)量12.4%，產(chǎn)值增加12.8%[3]；施用菜籽餅肥促進(jìn)連作障礙煙田煙株的生長發(fā)育，可提高初烤煙葉產(chǎn)量195 kg/hm2[4]。合理施用菜籽餅肥，能改善初烤煙葉油分等外觀質(zhì)量，提升煙葉糖堿比等化學(xué)協(xié)調(diào)性，增加煙葉香氣量[5-6]。針對肥力水平較高的土壤，增施菜籽餅肥提高了煙葉產(chǎn)量，但烘烤難度增大，降低了上等煙比例[7]。雖然菜籽餅作為有機(jī)肥在烤煙生產(chǎn)中應(yīng)用較普遍，但隨著植煙土壤肥力水平的不斷提升，應(yīng)避免單獨(dú)或連續(xù)施用菜籽餅肥[8]。

近年來，菜籽壓榨和生產(chǎn)菜籽餅肥過程中的下腳菜籽油也被用于烤煙生產(chǎn)。在烤煙團(tuán)棵期，用菜籽油對煙株灌根，初烤煙葉產(chǎn)量提高4.67%～9.39%，產(chǎn)值增加6.26%～11.84%；中上部煙葉油分由“稍有”提升至“有”或“多”，葉片結(jié)構(gòu)更加疏松；降低中上部煙葉煙堿含量、提高總糖含量，煙葉化學(xué)成分更加協(xié)調(diào)；香氣質(zhì)更優(yōu)、香氣量更足，雜氣減弱、刺激性變小，余味更加舒適，改善了煙葉感官品質(zhì)[9]。

菜籽餅主要含有蛋白質(zhì)、多糖、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，粗蛋白含量35%～40%[10]；菜籽油主要含有油酸、亞油酸、亞麻酸、飽和脂肪酸、甾醇、多酚等營養(yǎng)物質(zhì)[11]。菜籽餅和菜籽油的營養(yǎng)物質(zhì)組成存在較大差異，目前，關(guān)于二者施用于土壤，影響土壤代謝物組成的相關(guān)報道仍較少。因此，筆者通過土壤培養(yǎng)試驗(yàn)，旨在探明土壤代謝物對菜籽餅和菜籽油的不同響應(yīng)，為烤煙品質(zhì)提升提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

2022年9月，采集銅仁市松桃縣長坪鄉(xiāng)烤煙種植地塊0～20 cm耕層土壤，避光處自然風(fēng)干，剔除石塊、植物根系等雜質(zhì)后，過2 mm篩備用。取樣地塊0～20 cm土壤的田間最大持水量為25%，土壤有機(jī)質(zhì)含量33.84 g/kg，堿解氮、有效磷和速效鉀分別為158.88、53.64和619.79 mg/kg，土壤pH值6.34。

1.2 供試菜籽油和菜籽餅

選取本地當(dāng)年油菜籽（品種為油研2020），采用物理壓榨工藝，得到菜籽油以及相應(yīng)的菜籽餅用于試驗(yàn)。

1.3 土壤培養(yǎng)

1.3.1 土壤處理 參考銅仁松桃烤煙生產(chǎn)中菜籽油和菜籽餅施用水平（5 L/667m2和15 kg/667m2），開展土壤培養(yǎng)試驗(yàn)，過篩土壤設(shè)置空白（CK）、菜籽餅（CB）和菜籽油（CY）3種處理，每個處理重復(fù)4次。每個重復(fù)稱取過篩土壤1 000 g（含水量12.6%），其中，CB處理加入15 g菜籽餅并混勻，CY處理加入5 mL菜籽油并混勻。

1.3.2 培養(yǎng)環(huán)境溫濕度 培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為25℃（當(dāng)?shù)?月平均氣溫19～27℃），濕度為自然環(huán)境濕度，培養(yǎng)全過程處于黑暗環(huán)境。首次澆水量120 mL/盆（2022年10月29日）。調(diào)節(jié)土壤含水量至80%田間持水量（初始水分），每3 d采用稱重法計(jì)算補(bǔ)水量，調(diào)節(jié)土壤水分至初始狀態(tài)，每盆補(bǔ)水量（mL）=80%田間持水量（g）+土壤干重（g）-每盆濕土重量（g）。

1.3.3 培養(yǎng)土壤樣品采集 在培養(yǎng)30 d時，每盆取3個點(diǎn)，鉆取0～5 cm范圍的土壤，混合均勻裝入5 mL離心管中，立即置于液氮中，速凍后存入-80℃冰箱備用。

1.4 土壤代謝物分析

參照CAI等[12]建立的微波輔助衍生化–氣相色譜-質(zhì)譜（GC–MS）方法，開展培養(yǎng)土壤的代謝物分析。

1.4.1 土壤代謝物提取 培養(yǎng)土壤樣品經(jīng)凍干處理48 h。取0.5 g凍干土壤置于10 mL玻璃錐形管中，加入6 μL 2–甲氧基酚–d3、L–正纈氨酸、己二酸、核糖醇、棕櫚酸–d31和苯基–β–D–吡喃葡萄糖苷水合物混合內(nèi)標(biāo)（IS）溶液（0.250、0.272、0.528、0.210、0.260和0.520 mg/mL，50%甲醇為溶劑），加入1.5 mL預(yù)冷（4℃）甲醇–水（v∶v = 3∶2）萃取溶劑。在4℃渦旋（2 500 r/min）5 min后提取土壤樣品。然后，將樣品離心5 min（3 000 r/min，4℃）并過濾上清液。提取過程分別用0.8 mL甲醇–水（v∶v = 3∶2）和0.8 mL水重復(fù)2次，將組合提取液置于約4℃的CentriVap離心濃縮儀（美國）中冷凍干燥18 h。

1.4.2 微波輔助衍生化（肟化與硅烷化） 凍干提取物用300 μL甲醇重新溶解，然后離心以除去顆粒不溶性鹽。將上清轉(zhuǎn)移2 mL螺旋頸最大回收瓶（Waters，美國），然后在平緩的氮?dú)饬飨赂稍?。為完全去除殘留水分，加?00 μL二氯甲烷干燥。衍生化反應(yīng)在可用的微波爐（1 000 w，Panasonic NN–GN68KS）上進(jìn)行。加入17 μL MEOX （25 mg/mL在吡啶中溶液中），在800 W能量下進(jìn)行3+2 min的微波反應(yīng)。然后，加入103 μL BSTFA （1%TMCS），進(jìn)行3+3+3 min的微波反應(yīng)。冷卻后，加入5 μL正十二烷吡啶代物（1.00 mg/mL），所得溶液離心5 min（3 000

r/min）。將上清液轉(zhuǎn)移到150 μL微量進(jìn)樣瓶中，取1 μL進(jìn)樣量進(jìn)行GC–MS分析。分別采用內(nèi)標(biāo)物和儀器校正內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行相對定量計(jì)算和數(shù)據(jù)歸一化。

1.4.3 GC–MS擬靶向代謝組學(xué) 安捷倫7890A–

5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀配備CTC PAL自動進(jìn)取器，開展GC–MS分析（美國）。進(jìn)樣口保持在280℃，采用分流模式，分流比為8∶1。采用超純氦作為載氣，流速恒定為1.0 mL/min。采用HP–5ms色譜柱（60 m×0.25 mm內(nèi)徑×0.25 μm膜厚）進(jìn)行分離。柱溫箱溫度如下：6℃持續(xù)2 min，以5℃/min升高至230℃，保持5 min，然后以8℃/min升高至290℃，保持25.5 min。將傳輸線溫度和溶劑延遲分別設(shè)置為280℃和11.9 min。離子源和四極桿的溫度分別保持在230和150℃。所有質(zhì)譜均在70 eV的電子碰撞（EI）模式下獲得。全掃描質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，掃描范圍為45～600 m/z。利用正構(gòu)烷烴（C6–C40）的保留時間和AMDIS軟件（自動質(zhì)譜反卷積和識別系統(tǒng)）計(jì)算保留指數(shù)（RI）。手動檢查并接受RI誤差百分比閾值（≤1.0%）。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Simca軟件13.0進(jìn)行PCA分析。采用Meta-boanalyst 5.0（http：//www.metaboanalyst.ca）進(jìn)行偏最小二乘判別分析（OPLS–DA），并繪制代謝物火山圖；結(jié)合VIP值（Variable important in projection，＞1.2）和顯著性差異（P＜0.05），篩選土壤差異代謝物。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤代謝物主成分分析

采用多變量數(shù)據(jù)分析方法，研究添加菜籽油或菜籽餅對植煙土壤代謝物的影響，以區(qū)分不同模式下土壤代謝物變化，使用主成分分析方法（PCA），從總體上反映樣本間差異及代謝物表達(dá)模式差異。由圖1可知，CK、CY和CB處理組間差異明顯，樣本間坐標(biāo)點(diǎn)較為聚集，易于區(qū)分，所有坐標(biāo)點(diǎn)均位于置信橢圓內(nèi)，表明各樣本均處于95%置信度下，且組內(nèi)樣本相似性較高，數(shù)據(jù)處理可信度高。

2.2 土壤組間差異代謝物篩選

CB處理的培養(yǎng)土壤中（圖2A），共鑒定出43種具有顯著性差異（P＜0.05）的代謝物。與CK比較，CB處理中表達(dá)差異上調(diào)的代謝物有43種，沒有下調(diào)表達(dá)的代謝物。CY處理的培養(yǎng)土壤中（圖2B），共鑒定出9種具有顯著性差異（P＜0.05）的代謝物。與對照比較，CY處理中表達(dá)差異上調(diào)的代謝物有8種，下調(diào)表達(dá)的代謝物1種。

分析了與對照相比CB或CY處理差異表達(dá)倍數(shù)排列前15的土壤代謝物（表1）。CB處理的差異代謝物主要為有機(jī)酸，且以氨基酸等土壤高氮代謝物為主；其中，氨基酸為谷氨酰胺、脯氨酸、丙氨酸、γ–氨基丁酸、亮氨酸、L–異亮氨酸、焦谷氨酸和賴氨酸等8種，與對照相比上調(diào)表達(dá)倍數(shù)14.72～207.94倍；其他有機(jī)酸主要為2–氧代戊二酸、對苯二甲酸、亞油酸/亞麻酸和肌糖磷酸等4種，上調(diào)表達(dá)倍數(shù)12.47～52.71倍。CY處理主要影響土壤高碳代謝物；其中，油酸、油酸異構(gòu)體、十六烯酸異構(gòu)體、二十酸和海松酸等5種有機(jī)酸與對照相比上調(diào)表達(dá)1.73～225.97倍，葡萄糖酸下調(diào)表達(dá)4.17倍；另外，松二糖和乳糖等糖類以及甘露糖醇顯著上調(diào)表達(dá)。

3 討論與結(jié)論

植煙土壤施用菜籽油或菜籽餅?zāi)軌蛘{(diào)控土壤代謝物，在施用菜籽油處理中篩選出9種土壤差異代謝物，施用菜籽餅處理中篩選出43種土壤差異代謝物。添加菜籽油處理，油酸、油酸異構(gòu)體、十六烯酸異構(gòu)體、二十酸和海松酸5種有機(jī)酸上調(diào)表達(dá)1.73～225.97倍，乳糖和松二糖2種糖類分別上調(diào)表達(dá)3.12和16.91倍；添加菜籽餅處理，谷氨酰胺、脯氨酸、丙氨酸、γ–氨基丁酸、亮氨酸、L–異亮氨酸、焦谷氨酸和賴氨酸8種，上調(diào)表達(dá)倍數(shù)14.72～207.94倍。菜籽餅的蛋白質(zhì)等有機(jī)氮含量豐富[10]，而菜籽油中脂肪酸最為豐富[11]。據(jù)此推斷，施用菜籽餅和菜籽油的土壤代謝物差異，可能與菜籽餅和菜籽油自身的主要物質(zhì)組成差異有關(guān)。在常規(guī)種植和有機(jī)種植的玉米根際土壤中發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象，秸稈等有機(jī)碳投入為主的有機(jī)種植模式促進(jìn)土壤有機(jī)酸及衍生代謝產(chǎn)物積累，而降低了土壤氨基酸及其前體代謝產(chǎn)物含量[13]。

在有機(jī)質(zhì)含量較低（17.2 g/kg）的土壤中，施用菜籽餅肥能夠顯著促進(jìn)土壤凈礦化速率，施用后7 d土壤的銨態(tài)氮濃度可提高3.3～3.7倍[14]，并顯著增加N2O的排放通量[15]，土壤中無機(jī)氮的增加與施用菜籽餅提高有機(jī)氮的積累量密不可分。對于土壤有機(jī)質(zhì)含量較高（＞30 g/kg）的土壤，在施用菜籽餅有機(jī)肥的情況下，應(yīng)同時降低化肥氮的投入量，才能兼顧烤煙生長和品質(zhì)形成[16]。根據(jù)調(diào)查分析，植煙土壤肥力整體處于較高水平，尤其是堿解氮含量較高[17-19]。施用菜籽餅顯著上調(diào)表達(dá)的土壤代謝物以氨基酸等含氮化合物為主，施用菜籽油顯著上調(diào)表達(dá)的土壤代謝物以有機(jī)酸、糖類等含碳化合物為主，可能與菜籽餅和菜籽油對土壤微生物的不同調(diào)控效應(yīng)有關(guān)[13]。在土壤肥力偏高、煙株發(fā)育偏旺、煙葉堿高糖低化學(xué)成分不協(xié)調(diào)等特殊現(xiàn)象的區(qū)域，通過減少土壤含氮化合物、增加土壤含碳化合物、提高土壤碳氮比，在一定程度上有利于改善煙葉內(nèi)在品質(zhì)、彰顯煙葉風(fēng)格特色。

施用菜籽餅顯著提高了8種土壤氨基酸的上調(diào)表達(dá)倍數(shù)，而施用菜籽油顯著提高了5種不含氮土壤有機(jī)酸和2種糖的上調(diào)表達(dá)倍數(shù)，土壤投入不同類型的有機(jī)物料會明顯調(diào)節(jié)土壤代謝物組成。此外，有機(jī)物料投入對植煙土壤代謝物動態(tài)變化的影響、與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征與功能的關(guān)系，以及對煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)的作用等還需深入研究。

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（責(zé)任編輯：肖彥資）