摘要 為了探究東北林蛙在人工誘導蘇醒過程中適應溫度變化的生理機制，包括不同溫度、不同器官或組織的冷凍保護劑含量變化及其抗氧化應激相關(guān)生理指標在蘇醒適應階段的差異，采用梯度升溫方法對冬眠東北林蛙進行人工誘導蘇醒，至東北林蛙攝食標記蘇醒過程結(jié)束。蘇醒培養(yǎng)期間取樣，未取樣林蛙持續(xù)培養(yǎng)，取樣結(jié)束后剩余林蛙常溫養(yǎng)殖；采用分光光度法對其肝臟、肌肉內(nèi)的葡萄糖含量、尿素氮含量、總抗氧化能力進行測定。結(jié)果表明，東北林蛙肝臟內(nèi)上述物質(zhì)含量與肌肉內(nèi)各物質(zhì)的消耗趨勢基本一致，但肝臟內(nèi)各物質(zhì)含量及其變化幅度遠大于肌肉內(nèi)。冬眠東北林蛙人工誘導蘇醒初期葡萄糖、尿素氮含量即冷凍保護劑含量明顯降低（Plt;0.05）、總抗氧化能力明顯增強（Plt;0.05），而蘇醒后期，各項含量趨于穩(wěn)定，無明顯變化。這說明肝臟是東北林蛙冬眠過程中對抗低溫冷凍環(huán)境的主要器官，且冬眠狀態(tài)的東北林蛙體內(nèi)會積累冷凍保護劑，隨著蘇醒過程的進行，溫度逐漸上升，機體活動逐漸恢復，葡萄糖被大量消耗，以對抗因缺少能量來源而帶來的應激損傷，抗氧化應激能力也隨之增強以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，保證東北林蛙在0 ℃以下得以生存。

關(guān)鍵詞 東北林蛙；人工誘導蘇醒；冷凍保護劑；抗氧化能力；人工養(yǎng)殖

中圖分類號 S966.35" "文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2024）11-0049-07

Analysis on the mechanism of artificial induction of awakening adaptation in Rana dybowskii

ZHAO Honglei" " ZHANG Chuanhui" " MENG Ruyuan" " MA Jiaxin" " WEN Renshuang" " YU Cuiping

（College of Wildlife and Protected Area Northeast Forestry University， Harbin 150040， China）

Abstract In order to explore the physiological mechanisms by which the Rana dybowskii adapts to temperature changes during artificial induction of awakening， including changes in cryoprotectant content at different temperatures and organs/tissues， as well as differences in antioxidant stress-related physiological indicators during the awakening adaptation stage， a gradient heating method was used to artificially induce awakening of the hibernating R. dybowskii， until the awakening process was marked by feeding by the R. dybowskii. During the awakening cultivation period， samples were taken， and non-sampled forest frogs were continuously cultured. After the sampling was completed， the remaining forest frogs were raised at room temperature; and the glucose content， urea nitrogen content， and total antioxidant capacity in its liver and muscles were measured using spectrophotometry. The results showed that the content of various substances in the liver was basically consistent with the trend of muscle consumption， but the content and changes of various substances in the liver were much greater than those in the muscle. The glucose and urea nitrogen content（cryoprotectant content） were significantly reduced（Plt;0.05）， and the total antioxidant capacity was significantly enhanced （Plt;0.05） in the early stage of artificial induction and awakening of the hibernating R. dybowskii. However， in the later stage of awakening， the various contents tended to stabilize without significant changes. The liver is the main organ that fights against the low-temperature freezing environment during the hibernation process of the R. dybowskii， and the hibernating R. dybowskii accumulates cryoprotectants in its body. As the awakening process progresses， the temperature gradually rises， and the body activity gradually recovers. The glucose is consumed in large quantities， reducing stress damage caused by a lack of energy sources， and the antioxidant stress capacity is also enhanced to maintain internal environment stability， ensure the survival of R. dybowskii below 0 ℃ celsius.

Keywords Rana dybowskii; artificial induction of awakening; freeze protectants; antioxidant capacity; artificial breeding

東北林蛙在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，在消滅農(nóng)林害蟲、控制蟲害大發(fā)生和維護生態(tài)系統(tǒng)平衡等方面具有一定的積極作用[1]。由于其生活習性和生態(tài)環(huán)境的特殊性，尤其是在冬季會選擇進入冰洞中冬眠，導致現(xiàn)階段東北林蛙的人工養(yǎng)殖和物種保護面臨一定的困難?，F(xiàn)有研究表明，越冬動物會通過增加血漿葡萄糖、抗凍蛋白含量和抗氧化酶活性等方式在0 ℃以下環(huán)境中生存[2]。高濃度葡萄糖內(nèi)環(huán)境可以降低東北林蛙體內(nèi)的冰含量和紅細胞損傷，是決定林蛙冷凍耐受能力的一個關(guān)鍵因素[3]。尿素[4]在冬眠動物體內(nèi)的儲存是一種滲透壓平衡保護機制，由于尿素不能通過皮膚排出，在其體內(nèi)儲存一定濃度的尿素可以抑制代謝水平，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，并且能夠在低溫脅迫過程中促進膀胱對水分的重吸收，避免水分過度流失?？偪寡趸芰5]可以反映體內(nèi)抗氧化功能相關(guān)物質(zhì)的含量變化，進而反映抗氧化能力的強弱和氧化應激的進行階段，是判斷機體是否完全蘇醒的指標之一。

本研究以東北林蛙為研究對象，采用梯度升溫方法對東北林蛙進行人工誘導蘇醒，并采用分光光度法對其肝臟、肌肉內(nèi)的葡萄糖含量、尿素氮含量和總抗氧化能力等生理指標進行測定，探究東北林蛙在蘇醒適應階段不同溫度、不同器官或組織的葡萄糖、尿素氮及抗氧化應激相關(guān)生理指標的差異，進而為人工養(yǎng)殖東北林蛙技術(shù)體系突破低溫限制提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選取30只體況良好的處于冬眠期的人工養(yǎng)殖成年雄性東北林蛙，均購自吉林省白山市。

1.2 主要試劑

葡萄糖含量檢測試劑盒（BC2500），尿素氮檢測試劑盒（BC1530），總抗氧化能力（T-AOC）檢測試劑盒（BC1310），均購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.3 主要儀器

可見分光光度計（722N），購自上海菁華科技儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱（QHX-250BSH-Ⅲ），購自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；臺式離心機（5810R），購自德國Eppendorf公司；電子天平（XS225A），購自瑞士Precisa公司；水浴鍋（DZKW），購自天津天泰儀器有限公司。

1.4 試驗方法

將處于冬眠期的30只東北林蛙按每盒3只分配到10個培養(yǎng)盒中，培養(yǎng)盒中均鋪潮濕吸水軟墊，并設置避光處和采食盒。后將培養(yǎng)盒置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱初始參數(shù)設置為明暗時間比13∶11，培養(yǎng)溫度0 ℃，培養(yǎng)濕度70%～80%，培養(yǎng)7 d，其間隨時檢查有無瀕死林蛙，并及時移除。

第8天隨機選取3只0 ℃條件下的東北林蛙解剖，分別取其肝臟和腿部肌肉為0 ℃樣品，用液氮處理后置于-80 ℃冰箱中保存，備用。剩余東北林蛙繼續(xù)培養(yǎng)并梯度升溫（升溫速率均為+1 ℃/d），升至4 ℃后保持該溫度3 d，隨機選取3只4 ℃條件下的東北林蛙解剖，分別取其肝臟和腿部肌肉4 ℃樣品，同方法取8、12、16和20 ℃時的樣品，在16～20 ℃時，東北林蛙開始自主攝食，蘇醒過程結(jié)束同時于20 ℃停止取樣。

1.5 檢測指標

1.5.1 葡萄糖含量" 每組取0.05 g肝臟（0.1 g肌肉）樣品，加入0.5 mL（1 mL）純化水，研磨成勻漿后裝入離心管，水浴10 min；冷卻至室溫，25 ℃、8 000×g離心10 min；取上清液，按照葡萄糖含量檢測試劑盒方法檢測葡萄糖含量。

1.5.2 尿素氮含量" 每組取0.05 g肝臟（0.1 g肌肉）樣品，加入0.5 mL（1 mL）純化水，冰浴勻漿，于4 ℃、12 000×g離心15 min；取上清液，按照尿素氮檢測試劑盒方法檢測尿素氮含量。

1.5.3 總抗氧化能力" 每組取0.05 g肝臟（0.1 g肌肉）樣品，加入0.5 mL（1 mL）預冷提取液，冰浴勻漿，4 ℃、10 000×g離心10 min，取上清液；按照總抗氧化能力檢測試劑盒方法檢測總抗氧化能力。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均使用WPS 2023軟件進行初步處理，使用SPSS 26軟件及GraphPad Prism 8軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）并制圖。結(jié)果以平均值±標準差表示，Plt;0.01表示在0.01水平差異具有統(tǒng)計學意義，Plt;0.05表示在0.05水平差異具有統(tǒng)計學意義，Pgt;0.05表示在0.05水平差異無統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖含量變化

葡萄糖含量測定結(jié)果（圖1）顯示，在0 ℃時，東北林蛙體內(nèi)葡萄糖含量最高，而20 ℃的條件下，即蘇醒狀態(tài)其體內(nèi)葡萄糖含量最低。在梯度升溫過程中，肝臟內(nèi)的葡萄糖含量整體呈明顯下降趨勢，而在肌肉中只在蘇醒初期即0～4 ℃時肌肉內(nèi)葡萄糖含量明顯下降（Plt;0.05），在4～20 ℃升溫過程中葡萄糖含量緩慢下降且基本保持平穩(wěn)?？梢姈|北林蛙機體在蘇醒初期和攝食初期葡萄糖消耗較多且大部分來源于肝臟，葡萄糖的消耗在提供能量的同時直接補充血糖，維持機體呼吸及體溫等生理狀態(tài)正常。在東北林蛙機體恢復意識和活動之后，其能量來源主要依賴于肝臟內(nèi)的葡萄糖，肌肉內(nèi)葡萄糖主要用于維持肌肉基本運動，除應激等運動劇烈情況，其體內(nèi)葡萄糖含量基本維持在穩(wěn)定水平。

由圖2可知，同樣處理操作下，肌肉中葡萄糖含量約為肝臟組織中的1/6，整體含量較低。升溫過程中葡萄糖含量整體呈下降趨勢，在0～4 ℃時下降最快。肌肉中葡萄糖含量在溫度高于4 ℃時基本保持正常消耗，維持平穩(wěn)，比肝臟中葡萄糖消耗速率慢。

2.2 尿素氮含量變化

尿素氮含量測定結(jié)果見圖3，在0 ℃條件下東北林蛙機體內(nèi)尿素氮含量最高，而20 ℃條件下，即蘇醒狀態(tài)下其體內(nèi)尿素氮含量最低。在蘇醒初期，即0～4 ℃過程中東北林蛙體內(nèi)尿素含量明顯下降（Plt;0.05），蘇醒過程前中期主要代謝肝臟內(nèi)尿素，而中后期肌肉內(nèi)尿素代謝增加。12～16 ℃條件下肌肉內(nèi)尿素氮含量明顯下降（Plt;0.05），之后含量基本保持平穩(wěn)。

由圖4可知，同樣處理操作下的肝臟和肌肉中的尿素氮含量均呈下降趨勢，機體內(nèi)尿素氮含量在蘇醒初期未出現(xiàn)大幅下降，下降主要出現(xiàn)在12 ℃之后，隨后保持正常攝食狀態(tài)，尿素含量穩(wěn)定在一定水平，此時滲透壓基本維持在平衡狀態(tài)。肝臟中的尿素氮含量在蘇醒初期呈持續(xù)降低趨勢，表明在冬眠過程中尿素氮會逐漸積累作為抗凍保護劑之一，維持機體內(nèi)的滲透壓平衡，隨著升溫過程的進行，尿素逐漸被消耗回歸到正常代謝所需水平。

2.3 總抗氧化能力變化

總抗氧化能力測定結(jié)果見圖5，在0 ℃條件下東北林蛙總抗氧化能力最弱，而4 ℃條件下，即蘇醒初期東北林蛙的總抗氧化能力最強，且增強明顯（Plt;0.05）。表明東北林蛙在冬眠期間處在低溫狀態(tài)，抗氧化活性物質(zhì)的再生合成能力較弱，抗氧化酶的活性較低，含量相對較少。隨著升溫過程的持續(xù)進行，抗氧化能力趨于平穩(wěn)，側(cè)面反映出東北林蛙逐漸恢復到正常代謝水平，同時也表明東北林蛙為抵御冷凍脅迫，體內(nèi)積累大量抗凍保護劑的同時，存儲了一定含量的抗氧化物質(zhì)，其在冬眠過程中保護機體免受冷凍造成的不可逆凍融損傷的前提下維持機體低能運轉(zhuǎn)。

由圖6可知，抗氧化物質(zhì)，如抗氧化酶等大多儲存在肝臟中，肌肉中僅存有一小部分，且肝臟中的總抗氧化能力變化速率較快，說明肝臟作為代謝和排毒的主要器官，在整個抗氧化過程中發(fā)揮著重要作用。在升溫過程中，東北林蛙機體調(diào)動合成大量的抗氧化物質(zhì)防止過度應激，從而進一步調(diào)節(jié)自身的生理激素平衡?？傮w來看，在東北林蛙蘇醒初期抗氧化能力明顯增強，可見東北林蛙在蘇醒過程中會通過合成或分解抗氧化物質(zhì)等減輕氧化應激損傷。

3 結(jié)論與討論

葡萄糖不僅是細胞能量代謝的主要底物之一，也是機體系統(tǒng)的重要能量來源。較高的葡萄糖水平可以降低林蛙體內(nèi)冰的含量和體內(nèi)紅細胞的損傷程度，組織中的葡萄糖水平是決定林蛙冷凍耐受能力的一個關(guān)鍵因素[3-5]。肝臟內(nèi)葡萄糖含量較高的原因是動物機體所需糖原主要是肝糖原和肌糖原，冬眠過程中脂質(zhì)分解形成葡萄糖并積累到肝臟中，導致肝臟中葡萄糖含量較高。在0～4 ℃時東北林蛙體內(nèi)的葡萄糖含量下降最快，可見蘇醒初期機體意識和運動逐漸開始恢復，機體做出響應并消耗葡萄糖提供未攝食階段機體所有基本生理活動的所需能量。研究表明，葡萄糖和尿素的積累可能是兩棲類動物冬眠前攝食量增加，大量糖原儲存，隨著溫度降低和食物缺失會阻斷糖原供應[6-8]；同時，低溫環(huán)境會促進糖酵解并抑制糖異生，導致酮的代謝減少對游離葡萄糖的需求，從而間接促進了冬眠前機體內(nèi)葡萄糖的迅速產(chǎn)生和積累[9]。由此可以證實，東北林蛙在冬眠期間機體儲存的葡萄糖在其蘇醒初期被大量消耗作為恢復活動的能量來源，隨著溫度升高，逐漸恢復攝食之后有了食物和糖原來源，能量供應平衡，游離葡萄糖含量達到穩(wěn)定狀態(tài)。

尿素參與蛋白質(zhì)的合成與代謝，高濃度的尿素會產(chǎn)生清除自由基等活性分子，在一定程度上可以抑制正常代謝。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫狀態(tài)下東北林蛙的膀胱會儲存大量的尿液，其原因可能是在低溫狀態(tài)下東北林蛙肌肉等組織處于脫水狀態(tài)，機體為維持滲透壓平衡，防止體內(nèi)結(jié)冰損傷所產(chǎn)生的應對機制。相關(guān)研究表明，參與累積尿素的微生物的分解代謝過程可能會推遲到冬眠后期，避免影響尿素的合成與積累，進而破壞低溫保護機制，阻斷提供恢復機體活動所需的氮來源[10-11]。尿素氮含量的高低側(cè)面反映了尿素含量的高低。尿素可以起到調(diào)節(jié)滲透壓的作用[12]，防止機體水分含量失衡。在東北林蛙冬眠過程中，尿素的積累起到了防止因水分過度流失造成機體不可逆的凍融損傷甚至死亡的重要作用。在蘇醒初期機體內(nèi)尿素氮含量未出現(xiàn)大幅下降，下降主要出現(xiàn)在攝食之后，其原因可能是東北林蛙蘇醒初期運動能力尚未完全恢復，到后期活動量增加，在適應過程中機體蛋白質(zhì)來源增加，合成代謝消耗循環(huán)途徑增加，消耗速率加快，使尿素含量減少，機體內(nèi)儲存的水分以排尿、蒸發(fā)等形式正常排出；同時覓食、避光等運動行為使得肌肉中的蛋白質(zhì)分解代謝加快，尿素的含量逐漸減少至正常代謝水平。

試驗中抗氧化能力是指抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶的總體水平。肝臟作為代謝和排毒的主要器官，在整個抗氧化的過程中發(fā)揮著重要作用。東北林蛙在冬眠期間抗氧化活性物質(zhì)的再生合成能力較低，抗氧化酶的活性較低、含量相對較少[13-15]。在升溫過程中，代謝能力增強，呼吸功能恢復，活性氧增加，身體處于氧化應激的狀態(tài)，為了避免過度應激，機體調(diào)動抗氧化物消除體內(nèi)多余的自由基，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[5]。表明東北林蛙為了抵御冷凍脅迫，體內(nèi)積累大量葡萄糖和尿素的同時存儲了一定含量的抗氧化物質(zhì)，在冬眠過程中以保證機體受免冷凍造成不可逆的凍融損傷的前提下維持低能運轉(zhuǎn)[16-17]。研究表明[13]，過低的溫度可能會影響抗氧化活性物質(zhì)的再生合成能力，導致冬眠期間機體氧化損傷水平較高，但低溫抑制抗氧化酶的活性，因此抗氧化能力維持在相對較高的水平。隨著溫度升高東北林蛙蘇醒后，其代謝強度和耗氧量均會明顯增加，活性氧的生成速率隨之提高，可能會引發(fā)氧化應激，其抗氧化保護能力隨之增強，從而得以調(diào)節(jié)自身的生理激素平衡。隨著蘇醒過程的進行抗氧化能力趨于平穩(wěn)也表明東北林蛙逐漸適應外界溫度的梯度變化，應激減少，抗氧化物質(zhì)含量隨之逐漸降低并維持正常水平。

本研究采用梯度升溫方法對東北林蛙進行人工誘導蘇醒，并采用分光光度法對其肝臟、肌肉內(nèi)的葡萄糖含量、尿素氮含量和總抗氧化能力等生理指標進行測定，探究東北林蛙在蘇醒適應階段不同溫度、不同器官或組織內(nèi)葡萄糖、尿素氮及抗氧化應激相關(guān)生理指標的差異。結(jié)果表明，葡萄糖、尿素等作為抗凍保護劑在低溫時能限制東北林蛙機體內(nèi)冰的形成，在環(huán)境溫度升高的情況下主動消耗，來對抗能量來源和代謝底物不足等因素，同時平衡滲透壓，以保護生物膜和大分子免受離子滲透擾動，保障機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定平衡并幫助機體恢復運動和攝食。人工誘導東北林蛙蘇醒過程中，葡萄糖、尿素作為抗凍保護劑其含量隨溫度上升呈明顯下降趨勢，二者有無協(xié)同作用還有待進一步探究。東北林蛙處在低溫狀態(tài)下升溫時，其抗氧化能力明顯上升，持續(xù)升溫過程中其抗氧化能力維持在正常平穩(wěn)區(qū)間內(nèi)，其原因可能是溫度影響抗氧化酶活性，也可能是東北林蛙在低溫下氧化應激反應相對自然狀態(tài)劇烈，為避免凍融損傷所做的準備機制[18-19]。東北林蛙的人工養(yǎng)殖技術(shù)要著力解決冬眠這一難題[20-21]，而冬眠及蘇醒過程的相關(guān)生理及分子機制是突破口之一，有關(guān)東北林蛙冬眠及蘇醒過程的相關(guān)生理及分子機制研究有待進一步深入研究。

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（責編：何 艷）