摘要：為探究不同品種雪茄煙葉香氣品質(zhì)的差異，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-massspectrometry， GC-MS）對(duì)德雪1號(hào)、德雪3號(hào)和德雪5號(hào)香氣成分進(jìn)行分析，并進(jìn)行正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis， OPLS-DA）。結(jié)果表明，品種間煙葉香氣物質(zhì)的種類基本一致，而香氣物質(zhì)含量卻存在差異，其中德雪1號(hào)煙葉中巨豆三烯酮、β-環(huán)檸檬醛、苯甲醛和2，6-壬二烯醛含量較高，二氫獼猴桃內(nèi)酯、2-乙?；秽?、茄酮和新植二烯含量較低；德雪3號(hào)中呋喃類化合物和新植二烯含量較高；德雪5號(hào)中二氫獼猴桃內(nèi)酯、茄酮和愈創(chuàng)木酚含量較高。通過(guò)30個(gè)香氣成分構(gòu)建了OPLS-DA模型，其中自變量擬合指數(shù)（R2X）、因變量擬合指數(shù)（ R2Y） 和模型預(yù)測(cè)指數(shù)（ Q2）分別為0.806、0.993和0.988，交叉驗(yàn)證方差分析（cross validation analysis of variance， CV-ANOVA）檢驗(yàn)結(jié)果F 為179.76（ Plt;0.05），且通過(guò)200次置換驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)模型未出現(xiàn)過(guò)擬合現(xiàn)象，表明模型顯著可靠。模型從30個(gè)香氣成分中篩選出了8個(gè)差異香氣物質(zhì)，可用于雪茄品種的區(qū)分。以上結(jié)果為闡明不同品種雪茄煙葉的香氣特征提供理論參考。

關(guān)鍵詞：雪茄煙葉；香氣成分；正交偏最小二乘法；品種判別doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0214

中圖分類號(hào)：S572 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：10080864（2024）12017611

雪茄煙是由煙葉卷制成的特殊煙草制品，具有香味獨(dú)特豐富和吃味醇厚濃郁的特點(diǎn)，近年來(lái)被消費(fèi)者廣泛接受[1]。由于雪茄煙葉受到品種、栽培措施和調(diào)制工藝等因素影響，各種煙葉形成了獨(dú)特的品質(zhì)特征。香氣作為評(píng)價(jià)雪茄煙葉感官品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，也是決定雪茄煙葉風(fēng)格的主要依據(jù)[2]。戚瑩[3]對(duì)30個(gè)不同基因型烤煙的棕色化反應(yīng)產(chǎn)物分析評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，煙葉棕色化反應(yīng)產(chǎn)物含量越高，其外觀質(zhì)量與感官質(zhì)量越好。史宏志等[4]對(duì)達(dá)白1號(hào)、鄂煙1號(hào)、TN90、達(dá)所24和宣漢-5共5個(gè)白肋煙品種的中性香氣成分含量及感官品質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，達(dá)白1號(hào)的類胡蘿卜素降解產(chǎn)物和茄酮含量顯著高于其他品種，且該品種的風(fēng)格和香氣品質(zhì)均較好。因此，明確不同品種煙葉香氣成分差異，對(duì)客觀評(píng)價(jià)煙葉品質(zhì)有重要意義。

正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partialleast squares discriminant analysis， OPLS-DA）是通過(guò)正交思想過(guò)濾了X 變量中與Y 變量不相關(guān)的信息，該方法能有效解決多元回歸中變量多重共線性、多因變量對(duì)多變量的回歸模型構(gòu)建的阻礙，且提高了模型的預(yù)測(cè)精度，可用于確定不同類別分界面的最優(yōu)位置，并能有效解釋模式間差異的根本原因[5]。邵淑賢等[6]對(duì)云霄和武夷生產(chǎn)的黃觀音烏龍茶香氣成分進(jìn)行分析，結(jié)果表明，基于OPLS-DA模型篩選出17個(gè)差異香氣物質(zhì)，可有效區(qū)分黃觀音烏龍茶的產(chǎn)地。李武峰等[7] 通過(guò)OPLS-DA 模型篩選出了與驢肉嫩度相關(guān)的關(guān)鍵差異風(fēng)味物質(zhì)。目前，OPLS-DA分析對(duì)香氣成分的篩選主要集中在果蔬和食品方面[89]，而對(duì)雪茄煙這類特殊煙草的研究較缺乏。本研究基于雪茄煙葉香氣指標(biāo)進(jìn)行OPLS-DA分析，構(gòu)建不同品種雪茄煙葉的識(shí)別模型，分析不同品種雪茄煙葉之間香氣指標(biāo)的差異，為鑒別不同品種雪茄煙葉香氣品質(zhì)差異提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2021年在四川省德陽(yáng)市什邡市大泉坑村雪茄煙葉種植基地（31°12′N、104°12′E，海拔543 m）進(jìn)行。試驗(yàn)田為水稻土，有機(jī)質(zhì)含量34.35 g·kg-1，堿解氮含量118.52 mg·kg-1，速效鉀含量83.72 mg·kg-1，速效磷含量35.30 mg·kg-1，pH 6.37。

1.2 供試材料

以當(dāng)?shù)刂髟云贩N德雪1號(hào)、德雪3號(hào)和德雪5號(hào)為參試品種。各品種均選取10～12片中部葉進(jìn)行晾制，晾制結(jié)束后各選取樣品1 kg，去除主脈和葉尖后烘干過(guò)250 μm篩，用于香氣成分的測(cè)定，同一品種取10個(gè)樣品進(jìn)行香氣成分分析。

1.3 香氣成分測(cè)定

參照劉典三等[10]方法測(cè)定雪茄煙中香氣成分，將10.00 g煙末樣品、1.0 g檸檬酸、500 μL內(nèi)標(biāo)（0.359 5 mg·mL-1 硝基苯溶液，購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司）加入500 mL 圓底燒瓶中，再加入350 mL 的蒸餾水。安裝蒸餾萃取裝置，在冷凝管的上方加入40 mL 的二氯甲烷（無(wú)錫東能化工科技有限公司）至250 mL 燒瓶中，當(dāng)樣品沸騰且蒸餾萃取裝置出現(xiàn)分層開(kāi)始計(jì)時(shí)；2.5 h后收集燒瓶中的有機(jī)相，加入10 g的無(wú)水硫酸鈉（濰坊達(dá)康化工有限公司）搖勻至溶液澄清，將有機(jī)相轉(zhuǎn)移至雞心瓶（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上55 ℃水浴濃縮有機(jī)相約為1 mL。由于二氯甲烷的沸點(diǎn)為39.7 ℃，若水浴溫度過(guò)低，雖能減少低沸點(diǎn)香味物質(zhì)的損失，但會(huì)造成試驗(yàn)周期延長(zhǎng)，不利于試驗(yàn)進(jìn)行，同時(shí)煙草中主要香味物質(zhì)的沸點(diǎn)高于水浴溫度[11]，因此，水浴溫度為55 ℃時(shí)便于試驗(yàn)的進(jìn)行。所得樣品經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatographymassspectrometry， GC-MS）分析、由NIST（NationalInstitute of Standards and Technology）庫(kù)檢索定性。

采用7890-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）對(duì)樣品進(jìn)行定性分析。GC/MS條件：毛細(xì)管色譜柱DB-5MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司），載氣為恒流0.8 mL·min-1流速的氦氣（純度99.999%），進(jìn)樣口溫度為250 ℃。升溫程序：起始溫度為50 ℃，保持5 min；以5 ℃·min-1升至120 ℃，保持5 min；以5 ℃·min-1升至180 ℃，保持5 min；以6 ℃·min-1升至250 ℃，保持15 min。電離模式為EI，電離能70 eV，離子源、四級(jí)桿和傳輸線的溫度設(shè)置分別為177、150和280 ℃；分流比為1∶15；進(jìn)樣量2 μL；掃描方式為全掃描（scan），質(zhì)量掃描范圍50～500 amu。

基于NIST數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)雪茄煙葉的香氣物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜定性，定量通過(guò)與內(nèi)標(biāo)物峰面積進(jìn)行比較，得到香氣物質(zhì)的含量（μg·g-1），計(jì)算公式如下。

香氣物質(zhì)含量=（香氣物質(zhì)峰面積×內(nèi)標(biāo)物含量）/內(nèi)標(biāo)物峰面積（1）

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 2021進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及作圖。運(yùn)用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行OPLS-DA，計(jì)算預(yù)測(cè)變量重要性投影（variable importance in projection， VIP）值。結(jié)合SPSS 21.0進(jìn)行單因素分析，香氣成分篩選條件為Plt;0.05且VIPgt;1。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種雪茄煙葉主要致香物質(zhì)含量分析

由表1可知，3個(gè)品種雪茄煙葉共檢測(cè)出30種致香成分。其中，醛類物質(zhì)7種，分別為β-環(huán)檸檬醛、糠醛、苯甲醛、苯乙醛、5-甲基糠醛、2，6-壬二烯醛和藏花醛；酮類物質(zhì)10種，分別是巨豆三烯酮、氧化異佛爾酮、β-大馬酮、β-二氫大馬酮、3-羥基-β-大馬酮、香葉基丙酮、螺巖蘭草酮、法尼基丙酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮和茄酮；醇類化合物4 種，分別是6-甲基-5-庚烯-2-醇、糠醇、苯甲醇和苯乙醇；雜環(huán)類化合物2 種，分別是2-乙酰基呋喃和2-乙?；量惠葡╊惢衔? 種，分別為芳樟醇和新植二烯；酚類化合物和酯類化合物各1種，分別為愈創(chuàng)木酚和二氫獼猴桃內(nèi)酯。含量較高的香氣成分主要有新植二烯、巨豆三烯酮、β-大馬酮、β-二氫大馬酮、3-羥基-β-二氫大馬酮、茄酮、苯甲醇、苯乙醛、法尼基丙酮、糠醛等。從各種致香成分含量看，新植二烯含量顯著高于其他致香成分，在不同品種中表現(xiàn)為德雪3號(hào)gt;德雪5號(hào)gt;德雪1號(hào)，同時(shí)香氣總量在不同品種間的表現(xiàn)與新植二烯含量一致，表明不同品種雪茄煙葉香氣成分總量的不同可能是由新植二烯含量的差異所造成的。

2.2 不同品種雪茄煙葉香味物質(zhì)含量的分類分析

為便于分析不同品種雪茄煙葉致香成分含量間的差異，把所測(cè)定的香氣物質(zhì)按其對(duì)應(yīng)的香氣前體物質(zhì)進(jìn)行分類，可分為類胡蘿卜素降解產(chǎn)物、類西柏烷類降解產(chǎn)物、棕色化反應(yīng)產(chǎn)物和苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物[12]。由圖1 可知，德雪3 號(hào)的類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量最高，分別是德雪1 號(hào)和德雪5 號(hào)的1.12 和1.34 倍，德雪5 號(hào)顯著低于其他品種；類西柏烷類降解產(chǎn)物含量以德雪5 號(hào)最高，德雪1 號(hào)最低，且品種間均達(dá)到顯著差異，表明品種間的差異對(duì)類西柏烷類降解產(chǎn)物影響較大。相較于類胡蘿卜素降解產(chǎn)物和類西柏烷類降解產(chǎn)物，棕色化反應(yīng)產(chǎn)物和苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量較低，二者在不同品種間均表現(xiàn)為德雪3號(hào)gt;德雪1號(hào)gt;德雪5號(hào)，其中在棕色化反應(yīng)產(chǎn)物中，品種間差異不顯著；在苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中，3個(gè)品種間存在顯著差異。由此表明，苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物受不同品種差異的影響較大。

2.3 不同品種雪茄煙葉香氣成分OPLS-DA 模型

基于3個(gè)品種30種香氣成分構(gòu)建的雪茄煙葉OPLS-DA模型的第1、2成分得分圖，如圖2所示。各品種雪茄煙葉樣品有較為明顯的聚集趨勢(shì)，并且3個(gè)品種群體間能較好的分離。其中，從第1主成分（橫軸）得分可知，德雪5號(hào)分布在橫軸的負(fù)半軸，而德雪1號(hào)和德雪3號(hào)分布在橫軸的正半軸，表明通過(guò)第1主成分可將德雪5號(hào)樣品同德雪1號(hào)和德雪3號(hào)區(qū)分開(kāi)；從第2主成分（縱軸）得分可知，德雪1號(hào)分布在縱軸的正半軸，而德雪3號(hào)和德雪5號(hào)分布在縱軸的負(fù)半軸，表明通過(guò)第2主成分可將德雪1號(hào)樣品同德雪3號(hào)和德雪5號(hào)區(qū)分開(kāi)。整體來(lái)看，3個(gè)品種雪茄煙葉重復(fù)性良好，說(shuō)明不同品種雪茄煙葉香氣存在一定差異。

2.4 OPLS-DA 模型檢驗(yàn)

雪茄煙葉香氣成分OPLS-DA 模型統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表2）表明，該模型可選出2個(gè)預(yù)測(cè)主成分和2個(gè)正交主成分。自變量擬合指數(shù)（R2X）為0.806，表明4個(gè)主成分對(duì)X 變量變異解釋率為80.6%（其中預(yù)測(cè)主成分56.7%，正交主成分23.8%）；因變量擬合指數(shù)（R2Y）為0.993，表明模型中的2個(gè)預(yù)測(cè)主成分對(duì)Y 變量的解釋率為99.3%；模型預(yù)測(cè)指數(shù)（Q2）為0.988，表明模型中2個(gè)預(yù)測(cè)主成分對(duì)3個(gè)品種雪茄煙葉的預(yù)測(cè)率為98.8%，R2和Q2均超過(guò)0.5，表示本模型擬合結(jié)果可以接受[13]。圖3為置換檢驗(yàn)圖，經(jīng)過(guò)200次置換檢驗(yàn)，Q2回歸線與縱軸的交點(diǎn)在負(fù)半軸，且R2和Q2最右邊的真實(shí)值均高于左邊的預(yù)測(cè)值，表明該模型不存在過(guò)擬合現(xiàn)象。交叉驗(yàn)證方差分析（cross validation analysis of variance， CVANOVA）結(jié)果表明，F(xiàn) 為179.76（Plt;0.05），表明該模型顯著有效。因此，OPLS-DA模型可用于不同品種雪茄煙葉香氣成分的鑒別分析。

2.5 雪茄煙葉香氣物質(zhì)的篩選

圖4為OPLS-DA 模型的載荷圖，表示了2個(gè)主成分中各香氣成分與不同品種雪茄煙葉的相關(guān)性。圖5為OPLS-DA模型的VIP值，VIP值越大表明各香氣成分對(duì)變量的解釋貢獻(xiàn)度越大，與品種差異的相關(guān)性越高。共有15 個(gè)香氣物質(zhì)的VIP值大于1，如表3所示，它們對(duì)模型貢獻(xiàn)率較大。其中醇類3個(gè)、醛類2個(gè)、酮類5個(gè)、酯類1個(gè)、酚類1個(gè)、雜環(huán)類1個(gè)和萜烯類1個(gè)。結(jié)合表1可知，通過(guò)OPLS-DA模型篩選出的香氣物質(zhì)中，共有8種成分在品種間存在顯著差異（Plt;0.05），分別為二氫獼猴桃內(nèi)酯（X11）、β-環(huán)檸檬醛（X12）、2-乙?；秽╔20）、茄酮（X22）、苯乙醇（X26）、新植二烯（X27）、2，6- 壬二烯醛（X28）和愈創(chuàng)木酚（X29），這8種香氣成分可作為不同品種雪茄煙葉的特征香氣成分[6]。將篩選出的8個(gè)特征香氣成分與圖4相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)β-環(huán)檸檬醛（X12）和2，6-壬二烯醛（X28）與德雪1 號(hào)相關(guān)性高；2-乙?；秽╔20）、苯乙醇（X26）和新植二烯（X27）與德雪3 號(hào)相關(guān)性高；二氫獼猴桃內(nèi)酯（X11）、茄酮（X22）和愈創(chuàng)木酚（X29）與德雪5 號(hào)相關(guān)性高。

3 討論

雪茄煙葉內(nèi)在品質(zhì)對(duì)香氣要求較高，分析煙葉中致香物質(zhì)含量，對(duì)準(zhǔn)確評(píng)價(jià)雪茄煙葉內(nèi)在品質(zhì)起到重要的參考作用[14]。秦衛(wèi)普等[15]研究發(fā)現(xiàn)，基因型是決定煙葉香氣成分的遺傳基礎(chǔ)，不同基因型煙葉具有不同的風(fēng)格質(zhì)量。本研究結(jié)果表明，不同品種雪茄煙葉香氣成分種類基本一致，但含量間存在差異，其中醇類物質(zhì)和萜烯類物質(zhì)變幅較大，均大于50%，而酚類物質(zhì)變幅較小，均小于20%。趙銘欽等[14]研究表明，不同烤煙品種的香氣成分中醇類和萜烯類物質(zhì)的變幅大于50%，與本研究結(jié)果一致，但酚類物質(zhì)變幅接近90%，與本研究結(jié)果差異較大，可能是因?yàn)檠┣褵熑~調(diào)制階段的褐變需要酚類物質(zhì)充分轉(zhuǎn)化，因此調(diào)制后雪茄煙葉中酚類物質(zhì)含量的變幅遠(yuǎn)低于烤煙[16]。

類胡蘿卜素降解產(chǎn)物是重要的致香物質(zhì)組分，具有增進(jìn)花香、降低刺激的作用[17]。本研究結(jié)果表明，3個(gè)品種雪茄煙葉中類葫蘿卜素降解產(chǎn)物含量以德雪3 號(hào)最高，德雪5 號(hào)最低，其中德雪5 號(hào)與其他品種差異顯著，這可能是因?yàn)檎{(diào)制工藝的不配套造成了德雪5 號(hào)類胡蘿卜素降解產(chǎn)物的含量顯著低于其他2 個(gè)品種[18]。茄酮主要由西柏三烯降解產(chǎn)生，是類西柏烷類降解產(chǎn)物的重要香味成分[17]。本研究中，類西柏烷類降解產(chǎn)物含量表現(xiàn)為德雪5號(hào)最高，德雪1號(hào)最低，且品種間差異顯著，這可能是由于晾制期間，品種間香氣前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化程度不同所致[19]。棕色化反應(yīng)產(chǎn)物是由煙葉中的氨基酸和糖類物質(zhì)在非酶促條件下形成的，能賦予煙葉堅(jiān)果香、甜香和烘焙香[20]。本研究中3個(gè)品種雪茄煙葉棕色化反應(yīng)產(chǎn)物的含量總體表現(xiàn)為德雪3 號(hào)gt;德雪1 號(hào)gt;德雪5 號(hào)，但品種間差異不顯著，表明基因型對(duì)棕色化反應(yīng)產(chǎn)物影響較小。相較于其他3 類物質(zhì)，棕色化反應(yīng)產(chǎn)物含量較低，這可能是因?yàn)樽厣磻?yīng)產(chǎn)物多數(shù)為堿性致香物質(zhì)[21]，而本研究測(cè)定的香氣成分以中性物質(zhì)為主，導(dǎo)致棕色化反應(yīng)產(chǎn)物含量較低。苯丙氨酸降解產(chǎn)物是煙草中重要香氣物質(zhì)，本研究中不同品種雪茄煙葉苯丙酸降解產(chǎn)物含量表現(xiàn)為德雪3號(hào)gt;德雪1號(hào)gt;德雪5號(hào)，且品種間差異顯著，表明品種特性對(duì)苯丙酸降解產(chǎn)物含量影響較大。在苯丙氨酸代謝產(chǎn)物中苯甲醛和苯甲醇含量最為豐富，而本研究中這2 種物質(zhì)含量較低，可能與某些不利于這些成分含量增加的因素有關(guān)[22]。研究發(fā)現(xiàn)，新植二烯是決定基因型揮發(fā)性香氣成分總量高低的關(guān)鍵物質(zhì)[23]。本研究表明，在所有香氣物質(zhì)中新植二烯含量最高，不同品種間表現(xiàn)為德雪3 號(hào)最高，德雪1號(hào)最低，且品種間差異顯著，與前人研究結(jié)果一致，說(shuō)明基因型是決定新植二烯含量的重要因素。

OPLS-DA 是一種處理高維度數(shù)據(jù)的判別分析方法，該方法利用正交校正的思維，將數(shù)據(jù)集分為兩部分，即正交變量及非正交變量，并移除正交變量，對(duì)修正后的數(shù)據(jù)進(jìn)行偏最小二乘法分析，從而得到更好的模型識(shí)別精度[24]。趙華武等[25]采用主成分分析法（principal component analysis，PCA）分析了20個(gè)烤煙樣品的69個(gè)香氣成分指標(biāo)，篩選出19個(gè)貢獻(xiàn)率高的香氣指標(biāo)，由于PCA本質(zhì)是一種無(wú)監(jiān)督的模型，在分析時(shí)不明確每個(gè)樣本的分組，因此并不能明確各品種的主要特征香氣物質(zhì)[26]。本研究構(gòu)建的OPLS-DA 模型分別提取了2、3和3個(gè)指標(biāo)分別作為德雪1號(hào)、德雪3號(hào)和德雪5號(hào)的特征香氣指標(biāo)，特征指數(shù)數(shù)量與樣本容量間不相關(guān)，所提取的特征香氣指標(biāo)具有唯一性，各品種間不存在重疊。王俊[27]通過(guò)OPLS-DA 模型對(duì)烤煙的香氣特征成分進(jìn)行了提取，其結(jié)果與本研究結(jié)果差異較大，這可能是因?yàn)槟Ｐ秃Y選的特征指標(biāo)只是相對(duì)的特征指標(biāo)，不同類型煙葉分析模型的特征香氣成分會(huì)存在差異。本研究對(duì)不同品種雪茄煙葉的香氣成分進(jìn)行了比較分析，由于不同品種雪茄煙葉的香氣品質(zhì)可能受到其他因素的影響，還需增加進(jìn)一步控制變量并增大試驗(yàn)樣本，有助于提高模型的精度和可靠性[28]。

參 考 文 獻(xiàn)

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