摘要：種質(zhì)創(chuàng)新是育種的關(guān)鍵，利用電子加速器產(chǎn)生的X射線作為誘變工具，探索并優(yōu)化這一技術(shù)在育種材料中的應(yīng)用策略。首先，通過(guò)精細(xì)調(diào)控確定了針對(duì)不同處理對(duì)象的半致死/半致矮劑量閾值，隨后逐步微調(diào)輻照強(qiáng)度，旨在誘發(fā)遺傳變異的同時(shí)保持處理對(duì)象的存活率。進(jìn)一步探討了處理材料的最佳處理時(shí)機(jī)與方式，以期最大化輻照誘導(dǎo)變異的效率。針對(duì)多種作物實(shí)施了輻照處理，初步成效顯著。玉米植株在輻照后表現(xiàn)出顯著的株高矮化現(xiàn)象，且矮化程度與處理強(qiáng)度呈正相關(guān)；大豆輻照后不僅株高降低，還展現(xiàn)出抗蟲(chóng)性增強(qiáng)，表明輻照誘導(dǎo)了有利性狀的產(chǎn)生；藜麥在輻照后株高、葉色、花色及穗形等多個(gè)性狀上展現(xiàn)出廣泛的遺傳變異；通過(guò)特定輻照處理并篩選，成功培育出具有顯著抗除草劑特性的水稻植株，為雜草管理提供了新策略。以上研究結(jié)果不僅豐富了誘變育種的理論體系，也為作物遺傳改良與品種創(chuàng)新開(kāi)辟了新途徑。

關(guān)鍵詞：電子加速器；輻照誘變；半致死劑量；育種doi：10.13304/j.nykjdb.2024.0726

中圖分類號(hào)：Q319+.33 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：10080864（2024）12021007

農(nóng)業(yè)育種的核心任務(wù)為變異的創(chuàng)造、固定與選擇，這一過(guò)程旨在培育遺傳性能優(yōu)越的新品種。傳統(tǒng)與現(xiàn)代技術(shù)并蓄，育種策略可細(xì)化為以下幾個(gè)關(guān)鍵維度。①人工雜交育種。作為歷史悠久且至今仍具重要地位的育種手段，人工雜交通過(guò)精確控制親本間的交配，以期在后代中誘發(fā)出有益的遺傳變異。②生物技術(shù)育種。隨著生物科技的飛速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因與基因編輯等現(xiàn)代生物技術(shù)已成為育種領(lǐng)域的重要工具。轉(zhuǎn)基因技術(shù)通過(guò)向生物體引入外源基因，賦予其新的遺傳特性[1]；而基因編輯技術(shù)則能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)生物體基因組的精準(zhǔn)修改，進(jìn)一步提升了育種的精確性和效率[23]。③誘變育種。該技術(shù)通過(guò)引入外部因素（包括化學(xué)與物理手段）來(lái)誘發(fā)生物體遺傳物質(zhì)的突變，進(jìn)而創(chuàng)造新的遺傳變異類型?；瘜W(xué)誘變利用特定化學(xué)物質(zhì)作用于生物體，引發(fā)其遺傳物質(zhì)發(fā)生隨機(jī)變化；而物理誘變則涵蓋了諸如鈷-60等核輻照、航空航天環(huán)境中的特殊條件處理、多種物理介質(zhì)的應(yīng)用以及電子加速器技術(shù)等多種手段，這些手段均能有效促進(jìn)遺傳變異的產(chǎn)生[45]。

電子加速器是利用微波電磁場(chǎng)加速電子而產(chǎn)生高能量的裝置，其原理是使電子在真空中受到磁場(chǎng)力控制、電場(chǎng)力加速而產(chǎn)生高能量[6]。電子加速器產(chǎn)生的高能電子束和射線能夠作用于植物的遺傳物質(zhì)，誘發(fā)DNA 鏈斷裂、堿基突變等，從而產(chǎn)生新的性狀或變異體。電子加速器可通過(guò)精確控制電子束的能量、劑量和照射時(shí)間等參數(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)植物遺傳物質(zhì)的有效誘變，目前主要以電子直線加速器和高壓型加速器為主，用于農(nóng)業(yè)輻照育種的加速器能量一般為2～10 MeV。作為一種新型的輻射誘變工具，它具有誘變效果可控、輻射范圍可調(diào)、輻射劑量精確等特點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)育種領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景[7]。因此，本團(tuán)隊(duì)建立了專用于農(nóng)業(yè)育種的一體化電子加速器輻照誘變育種裝備（經(jīng)海南省工業(yè)和信息化組織的第三方論證），并獲得國(guó)家發(fā)明專利和實(shí)用新型專利[8-10]。

為了優(yōu)化電子加速器在育種材料創(chuàng)新中的應(yīng)用效能、精確調(diào)控輻照強(qiáng)度，本研究基于前期積累的經(jīng)驗(yàn)，采用從半致死/半致矮劑量起始的探索策略，旨在初步確定既能有效激發(fā)遺傳變異又不過(guò)度損害材料生長(zhǎng)潛能的輻照閾值；隨后，通過(guò)逐步遞減輻照劑量的方法，細(xì)致地調(diào)整處理?xiàng)l件，以期在保障材料存活率的同時(shí)，最大化提高遺傳變異的豐富度。此外，鑒于育種材料自身生長(zhǎng)和生理狀態(tài)的多樣性對(duì)輻照響應(yīng)影響顯著，本研究探討種子萌動(dòng)期和萌芽期的最佳輻照強(qiáng)度。通過(guò)一系列試驗(yàn)系統(tǒng)地評(píng)估不同狀態(tài)材料對(duì)輻照的敏感性和耐受性，進(jìn)而構(gòu)建一套針對(duì)不同材料狀態(tài)的輻照強(qiáng)度處理指南，不僅可為育種實(shí)踐提供科學(xué)依據(jù)，還有助于提升電子加速器在促進(jìn)育種材料遺傳變異方面的效率和精準(zhǔn)度。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用玉米（自主選育玉米雜交品種21-922，三亞鳴遙種質(zhì)創(chuàng)新科技有限公司提供）、大豆（黑豆81、臺(tái)灣64號(hào)，海南大學(xué)提供）、藜麥（淮藜3號(hào)，江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供）、水稻（黃華占，海南大學(xué)提供）萌動(dòng)期和萌芽期的種子作為材料，進(jìn)行輻照處理。種子經(jīng)過(guò)次氯酸鈉消毒后浸泡于清水中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中直至種子萌發(fā)，用于輻照誘變處理。誘變處理后的種子播種于裝有草炭土的培養(yǎng)盒中，在25 ℃、12 h光照/12 h黑暗條件下培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 輻照劑量?jī)?yōu)化處理 利用直線電子加速器（電子束能量2 MeV，平均功率1 kW，最小分辨劑量5 Gy；輻照試驗(yàn)于三亞誘變育種創(chuàng)新中心進(jìn)行）產(chǎn)生的電子束對(duì)上述育種材料實(shí)施不同劑量的輻照處理?；谇捌诘念A(yù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)確定各材料的半致死/半致矮輻照劑量，并以此作為后續(xù)劑量調(diào)整的基準(zhǔn)點(diǎn)，采用逐步遞減的策略精細(xì)調(diào)整輻照劑量，使之既能有效誘導(dǎo)材料產(chǎn)生遺傳變異，又能避免因劑量過(guò)高而導(dǎo)致材料死亡，將玉米21-922種子的輻照劑量分別設(shè)置為0（CK）、10、20、30 Gy，于播種后21 d，測(cè)定不同處理的存活率和株高；大豆品種黑農(nóng)81 種子的輻照劑量分別設(shè)置為0（CK）、40、60、80 Gy，每劑量處理100粒，每穴播種2粒，共計(jì)50穴，于播種后21 d統(tǒng)計(jì)不同處理的成活率，并調(diào)查開(kāi)花期、結(jié)莢期，播種后88 d統(tǒng)計(jì)不同處理的表型及株高；大豆品種臺(tái)灣64的輻照劑量分別設(shè)置為0（CK）、20、60、80 Gy，對(duì)M2代植株進(jìn)行全生育期跟蹤觀察；藜麥淮藜3號(hào)的輻照劑量分別設(shè)置為0（CK）、50 Gy，于播種后21 d統(tǒng)計(jì)不同處理的成活率，對(duì)M2代植株進(jìn)行全生育期跟蹤觀察；水稻黃華占種子的輻照劑量分別設(shè)置為0（CK）、30、50 Gy，當(dāng)水稻生長(zhǎng)至5～7葉時(shí)噴灑除草劑后統(tǒng)計(jì)存活率，并進(jìn)行全生育期跟蹤觀察。

1.2.2 生育期特異性處理 針對(duì)各材料的生物學(xué)特性，將種子含水量作為評(píng)估萌動(dòng)狀態(tài)的關(guān)鍵指標(biāo)，進(jìn)一步實(shí)施基于生育期的特異性輻照處理。種子萌動(dòng)期、萌發(fā)期及發(fā)芽期是遺傳物質(zhì)最為活躍、易于接受外界刺激并產(chǎn)生變異的關(guān)鍵期，因此，在以上3個(gè)時(shí)期對(duì)材料進(jìn)行處理。將種子在自然環(huán)境下吸水后測(cè)定種子含水量，以確定最佳輻照處理時(shí)間。采用高恒溫烘干法測(cè)定種子含水量，首先稱取烘干前的種子質(zhì)量，然后將吸水后的種子置于130 ℃的恒溫烘箱中烘1 h，再稱取烘干后的種子質(zhì)量，計(jì)算種子含水量，重復(fù)3次。

1.2.3 基因組變異分析 將輻照處理后的種子播種于25 ℃、12 h光照/12 h黑暗的光照培養(yǎng)室，每份種質(zhì)取15株幼苗葉片，立即置于液氮速凍，保存于實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱備用。采用植物DNA試劑盒（DP305，北京天根生化科技有限公司）提取基因組DNA，利用Nanodrop 8000（美國(guó)賽默飛）檢測(cè)DNA的質(zhì)量和含量后，送至武漢貝納科技有限公司進(jìn)行DNA文庫(kù)構(gòu)建、全基因組范圍SNP篩查和分型分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米最佳處理時(shí)期分析

由圖1 可知，21-922 玉米種子浸泡時(shí)間為12 h時(shí)，種子含水量達(dá)到飽和，可作為萌動(dòng)期開(kāi)始進(jìn)行種子處理。

不同輻照處理下21-922的表型如圖2所示。各處理的成活率均在93%左右； CK處理的平均株高為31 cm，10 Gy 處理的平均株高為24 cm，20 Gy 處理的平均株高為19 cm，30 Gy 處理的平均株高僅8 cm，不同處理間差異極顯著（圖2）。由此說(shuō)明，玉米幼苗在輻照后表現(xiàn)出顯著的株高矮化現(xiàn)象，且矮化程度與輻照強(qiáng)度呈正相關(guān)。

對(duì)30 Gy處理幼苗的葉片DNA進(jìn)行基因測(cè)序分析，將測(cè)序結(jié)果與CK進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果（圖3）表明，誘變后變異位點(diǎn)明顯增多，突變熱區(qū)位于染色體前段34～68 Mb 以及后段170～272 Mb 位置，其中6號(hào)染色體起始前段的突變尤為明顯；10號(hào)染色體的突變明顯多于其他染色體。

2.2 大豆

由圖4可知，黑農(nóng)81種子浸泡6～8 h進(jìn)入萌動(dòng)期，此時(shí)可開(kāi)始進(jìn)行種子輻照處理。

播種后21 d，40、60 和80 Gy 處理的存活率分分別為72.7%、69.1%、56.4%；CK 和輻照處理的開(kāi)花期均集中于播種后23～25 d，結(jié)莢期均為播種后37 d左右，即不同處理的花期、結(jié)莢期無(wú)顯著差異。播種后88 d，CK 處理的平均株高為32.4 cm，40 Gy處理的平均株高為27.2 cm，60 Gy處理的平均株高為24.9 cm，80 Gy處理的平均株高為20.25 cm，均極顯著低于CK（圖5）。由此說(shuō)明，隨著輻照強(qiáng)度的增加，大豆植株的株高受輻照抑制作用增強(qiáng)而矮化；同時(shí)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，80 Gy處理中有2 株雙主莖植株表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗蟲(chóng)性。

對(duì)黑農(nóng)81的輻照處理株進(jìn)行基因測(cè)序分析，與CK相比，40 Gy處理在6、11、15號(hào)染色體的突變較多，突變熱區(qū)位于20～45 Mb區(qū)間；60 Gy處理也表現(xiàn)出在6、11、15號(hào)染色體的突變較多，突變熱區(qū)位于26～39 Mb區(qū)間；80 Gy處理在6、15號(hào)染色體的突變明較多，突變熱區(qū)位于25～38.4 Mb區(qū)間（圖6）。

對(duì)臺(tái)灣64的M2代植株進(jìn)行全生育期跟蹤觀察，在出苗期發(fā)現(xiàn)葉片黃化突變株8株；在生長(zhǎng)后期發(fā)現(xiàn)葉片由綠轉(zhuǎn)黃化突變株1株，葉片表現(xiàn)不均衡缺綠、花葉突變株1株（圖7），葉綠素突變株占比達(dá)0.1%；植株高桿突變株2株，矮桿突變株5株；不育、半不育突變株17株。由此表明，輻照處理可創(chuàng)造豐富的性狀變異表型。

2.3 藜麥

淮藜3號(hào)種子經(jīng)過(guò)浸種萌發(fā)后在50 Gy劑量下進(jìn)行輻照處理，獲得6 000份M1單株，相對(duì)存活率49.58%，其中有變異性狀的植株80株。通過(guò)對(duì)M1突變體進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，突變類型有點(diǎn)突變（single base substitutions，SBSs）、插入/缺失（insertions and deletions，InDels）和結(jié)構(gòu)變異等，類型十分豐富，其中4、8、10號(hào)染色體上的突變明顯多于其他染色體，且熱點(diǎn)突變區(qū)域主要在這些染色體的前端與末端（圖8）。

在江蘇淮安和新疆奎屯分別建立了M2突變體庫(kù)，對(duì)M2突變體庫(kù)進(jìn)行全生育期性狀調(diào)查，結(jié)果（圖9）表明，穗型突變是發(fā)生頻率最高的突變類型之一，成功篩選到了穗型松散、每穗粒數(shù)增加的有益突變株HFL1；高株、長(zhǎng)生育期和紅花色是藜麥強(qiáng)連鎖性狀，而突變株HFL2的株高較對(duì)照植株降低22.1%，生育期縮短24 d，一定程度上打破了連鎖；突變株HFL3的分支減少，其分支生物量較CK降低89.2%，但千粒重和單株產(chǎn)量分別提高13.5% 和5.3%，具有重要利用價(jià)值；突變株HFL4的生物量較CK提高310.9%，單株產(chǎn)量提高263.3%，但其生育期較CK增加了21 d。

2.4 水稻

將水稻品種黃華占種子浸泡36 h，用不同輻照強(qiáng)度處理后，絕大多數(shù)能萌芽出土；噴施2倍除草劑后，與CK相比，在約1萬(wàn)株輻照處理植株中，僅50株存活，其余均枯死（圖10）。將這50株移栽后再次噴施2倍除草劑發(fā)現(xiàn)，這50株分蘗正常、花粉具有活性；M1代種子存在癟粒現(xiàn)象、幼苗植株明顯矮化。

3 討論

種質(zhì)資源是品種選育的材料基礎(chǔ)，運(yùn)用誘變的方法能快速創(chuàng)制類型豐富的新種質(zhì)。電子加速器是一種先進(jìn)的誘變工具，在育種材料誘變和品種改良中具有卓越潛力和廣泛應(yīng)用價(jià)值。通過(guò)60Co-γ射線輻照創(chuàng)制并選育出了許多品種，如棉花高產(chǎn)品種魯棉1號(hào)等。但γ射線具有明顯的技術(shù)弊端，如無(wú)法準(zhǔn)確把控劑量，劑量過(guò)低會(huì)導(dǎo)致難以得到突變體，而劑量過(guò)高則會(huì)過(guò)度損傷誘變材料使其不能正常生長(zhǎng)甚至死亡[11]；γ射線的輻射持續(xù)性與安全性問(wèn)題也一直存在爭(zhēng)議，它可能會(huì)對(duì)工作人員和環(huán)境造成嚴(yán)重的輻照傷害。相較于60Co-γ射線，電子加速器具有穩(wěn)定性強(qiáng)、突變譜廣、生物效應(yīng)高等特點(diǎn)，同時(shí)還解決了60Co-γ射線劑量無(wú)法準(zhǔn)確把控的問(wèn)題。本研究聚焦電子加速器在誘變育種中的精準(zhǔn)調(diào)控能力，通過(guò)精確設(shè)定輻照劑量與強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同作物種類及其遺傳特性的定制化處理。這種高度靈活的調(diào)控策略，極大地拓寬了誘變育種的范圍，并顯著提升了誘變效率，為育種工作帶來(lái)便利。

自2023年8月底至2024年7月底的運(yùn)行周期內(nèi)，三亞電子加速器誘變育種裝置已成功服務(wù)于眾多科研團(tuán)隊(duì)與企業(yè)，充分展示了其在科研與產(chǎn)業(yè)應(yīng)用中的廣泛接納度。在此期間，針對(duì)包括水稻、小麥、高粱、谷子、藜麥、青稞、馬鈴薯、棉花、香料（如茴香、孜然）、蔬菜（如菠菜、辣椒、白菜籽、蘿卜）、豆類（如綠豆、豌豆）、瓜類（如絲瓜）、食用菌（如羊肚菌）、果樹(shù)種子（如蘋(píng)果籽、香蕉籽）、林木種苗（如花梨樹(shù)苗、橡膠樹(shù)籽、楊樹(shù)苗）、觀賞植物（如黃花梨、三角梅、棕櫚苗）以及多種野生植物（如菥蓂、亞麻薺、諸葛菜）在內(nèi)的40余種農(nóng)業(yè)作物進(jìn)行了誘變處理。通過(guò)采用多樣化的輻照劑量與強(qiáng)度組合，成功處理了近3 000份育種材料，涵蓋數(shù)十萬(wàn)份種子與種苗，為遺傳改良與新品種培育奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

本研究成果不僅驗(yàn)證了電子加速器在誘變育種中的高效性與可靠性，還預(yù)示了其在推動(dòng)種業(yè)創(chuàng)新、促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展方面具有廣闊前景。電子加速器誘變技術(shù)以其環(huán)保、無(wú)化學(xué)殘留等特點(diǎn)，符合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展的要求，有望在未來(lái)與基因編輯、合成生物學(xué)等前沿技術(shù)深度融合，形成更加高效、精準(zhǔn)的現(xiàn)代育種體系。同時(shí)，隨著大數(shù)據(jù)與人工智能技術(shù)的不斷融入，電子加速器誘變育種將邁向更加智能化、個(gè)性化的新階段，為全球農(nóng)業(yè)科技進(jìn)步貢獻(xiàn)重要力量。

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