摘要：為解析莓葉委陵菜葉綠體基因組特征，探究其在薔薇科物種中的發(fā)育關(guān)系，本研究通過莓葉委陵菜葉綠體基因組的測序、組裝、注釋以及結(jié)合生物信息方法獲得其葉綠體全基因組特征信息，并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結(jié)果表明，莓葉委陵菜葉綠體基因組全長156 844 bp，為一個典型的四分體結(jié)構(gòu)，GC含量GC3lt;GC2lt;GC1，密碼子偏好以A/T結(jié)尾，IR邊界分析表明，其基因組結(jié)構(gòu)較為保守。通過與薔薇科下草莓屬、薔薇屬、委陵菜屬的13個物種進行系統(tǒng)發(fā)育分析，得到莓葉委陵菜與蛇莓的親緣關(guān)系較近，以100%自舉值聚到一起。本研究將有助于莓葉委陵菜的系統(tǒng)發(fā)育和遺傳研究。

關(guān)鍵詞：莓葉委陵菜；葉綠體基因組；系統(tǒng)發(fā)育；瑤藥

中圖分類號：Q789""" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A"""" 文章編號：1007-0435（2024）11-3383-08

Chloroplast Genome Characteristics and Phylogenetic analysis of

Potentilla fragarioides

GUO Song^{1， 2*}， LIANG Xiang-lan1， PENG Zi3， LU Quan3， ZENG Zhen-gui3

（1. Smart Agriculture College（Internet of Things Engineering College） of Guangxi Science amp;Technology Normal University， Laibin，

Guangxi Province 546199， China; 2. Key Laboratory for Zhuang and Yao Pharmaceutical Quality Biology， Guangxi Science amp; Technology

Normal University， Laibin， Guangxi Province 546199， China; 3.College of Biology and Food Engnineering of Guangxi Science amp;

Technology University， Laibin， Guangxi Province 546199， China）

Abstract：In order to determine the chloroplast genome characteristics of Potentilla fragarioides and to investigate its phylogenetic relationship within Rosaceae species，this study performed sequencing，assembly，and annotation of the chloroplast DNA genome of P. fragarioides，and obtained comprehensive information about its chloroplast genome by integrating bioinformatics methods. Based on this，a phylogenetic tree was constructed. The results showed that P. fragarioides complete chloroplast genome is 156 844 bp，which has a typical quadripartite structure with GC content of GC3lt;GC2lt;GC1，and a codon usage bias with A/T ending. The analysis of the IR boundary indicated that the genome structure of P. fragarioides is relatively conservative. Through phylogenetic analysis of 13 species in the Rosaceae family，including Fragaria，Rosa，and Potentilla，P. fragarioides was found to be closely related to Potentilla indica，with a bootstrap value of 100%. This study will contribute to the systematic and genetic research of P. fragarioides.

Key words：Potentilla fragarioides;Chloroplast genome;Phylogeny;Yao traditional medicine

收稿日期：2024-03-19；修回日期：2024-04-22

基金項目：廣西高校中青年教師科研基礎(chǔ)能力提升項目（2021KY0862）；廣西科技師范學(xué)院壯瑤藥品質(zhì)生物學(xué)重點實驗室經(jīng)費（GXKSKYPT2021007）；廣西科技基地與人才專項（2021AC19423）資助

作者簡介：

郭松（1987-），男，漢族，河南信陽人，博士，副教授，主要從事瑤藥資源開發(fā)與利用，E-mail：lxl12311124@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：guosong0804@163.com

薔薇科（Rosaceae）委陵菜屬（Potentilla）植物莓葉委陵菜（Potentilla fragarioides）的干燥全草為瑤族經(jīng)典藥物鬼刺風(fēng)，在瑤醫(yī)藥文化中具有重要地位^［1］。莓葉委陵菜為多年生草本植物，在我國各地均有分布^［2-3］。瑤醫(yī)認(rèn)為，鬼刺風(fēng)具有益氣補虛、祛風(fēng)活血、消腫止血等功效，常用于風(fēng)濕痛、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、月經(jīng)不調(diào)的治療^［4］。藥理學(xué)研究表明，鬼刺風(fēng)中含有多種三萜、黃酮類化合物^［5］，具有抗腹瀉、抗腫瘤、保肝、解痙等藥理作用^［6］。莓葉委陵菜具備耐旱抗寒、病蟲害發(fā)生少^［3］，對土壤要求不高等良好特性，成為高寒草甸的常見優(yōu)勢草本^［7］。莓葉委陵菜具有一定的觀賞、藥用和營養(yǎng)價值，具有重要的研究意義。

葉綠體是大多數(shù)綠色植物進行光合作用的細(xì)胞器，具有半自主性質(zhì)^［8］，對維持地球上生物的生命活動起著至關(guān)重要的作用。葉綠體參與植物發(fā)育，能夠調(diào)節(jié)植物次生代謝，協(xié)調(diào)植物核基因和質(zhì)基因的交流，在葉綠體中合成的代謝物可以調(diào)節(jié)植物與環(huán)境的相互作用以及防御病原體的入侵^［9］。與核基因組和線粒體基因組相比，葉綠體因基因組較小、不易發(fā)生重組、進化速率較慢且序列較為保守等特征，在探究物種起源、演化以及物種間親緣關(guān)系分析等方面具有重要應(yīng)用。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展和普及，越來越多的植物細(xì)胞質(zhì)基因組被解析。例如，薔薇科多種植物等^［10-12］均已經(jīng)開展了葉綠體基因組的測序工作，并將其用于植物系統(tǒng)發(fā)育和親緣關(guān)系等方面的研究。

本研究對莓葉委陵菜葉綠體基因組進行測序、組裝和注釋，分析其葉綠體基因組特征，并與薔薇科下的其他物種進行IR邊界比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，為莓葉委陵菜的開發(fā)利用和研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

用于研究的莓葉委陵菜（P. fragarioides L.）采摘于廣西壯族自治區(qū)金秀瑤族自治縣大瑤山中（110.25696，23.927306），采摘在相同生長條件下的莓葉委陵菜葉子60片用于DNA提取，憑證標(biāo)本存放于廣西科技師范學(xué)院食品與生化工程學(xué)院工科樓實驗室404室。

1.2 基因組的組裝和注釋

使用試劑盒（TAKARA，日本）提取莓葉委陵菜葉片DNA，并使用超微量熒光風(fēng)光光度計對提取的DNA進行純度檢測，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。符合建庫要求的DNA樣品送至百邁克生物科技有限公司（北京）進行測序。測序使用HiSeq 1000 （Illumina，San Diego，CA）平臺。選擇具有高覆蓋深度和組裝長度的序列作為候選序列，使用NOVOPlasty軟件^［13］對莓葉委陵菜葉綠體進行組裝，注釋以及可視化使用CPGAVAS2，GeSeq等在線工具^［14-15］對序列進行。將原始測序結(jié)果和組裝、注釋好莓葉委陵菜葉綠體基因組提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，登錄號分別為SRR28351070和PP492708。

1.3 密碼子組成分析

使用PhyloSuite軟件^［16］提取編碼蛋白基因的序列，采用EMBOSS計算莓葉委陵菜葉綠體基因組密碼子第一位、第二位、第三位的GC含量，使用Codon W 1.4.4計算基因編碼蛋白序列的有效密碼子數(shù)（Effective Number of Codons，ENC）和相對同義密碼子使用度（Relative Synonymous Codon Usage，RSCU）。

1.4 重復(fù)序列分析

使用MISA在線軟件^［17］分析莓葉委陵菜葉綠體基因組的簡單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeats，SSR），參數(shù)選擇10-5-4-3-3-3。莓葉委陵菜葉綠體基因組中的正向（Forward，F(xiàn)）、反向（Reverse，R）、回文（Palindrome，P）和互補（Complementary，C）重復(fù)序列采用REPuter軟件鑒定^［18］，參數(shù)選擇默認(rèn)。Tandem Repeats Finder軟件^［19］使用默認(rèn)參數(shù)檢測串聯(lián)重復(fù)（Tandem repeat）。

1.5 葉綠體基因組的比較分析

使用IRscope在線工具^［20］，與現(xiàn)代月季（Rosa hybrida）、蛇莓（Potentilla indica）、滇藏草莓（Fragaria tibetica）之間的連接位點進行比較，查看大單拷貝區(qū)（Large Single-Copy，LSC）、小單拷貝區(qū)（Small Single-Copy，SSC）、反向重復(fù)區(qū)（Inverted Repeat a/b，IRa/b）的收縮與擴張。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中選擇薔薇科下草莓屬、薔薇屬、委陵菜屬13個物種的完整葉綠體基因組序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析。使用PhyloSuite軟件^［16］提取進行比對物種中具有相同編碼蛋白基因的序列，使用MAFFT v7.471軟件^［21］進行序列比對，利用MEGA 7.0.26^［22］采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，設(shè)置Bootstrap為1000。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用R語言對測得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析處理。統(tǒng)計每個基因密碼子第一位、第二位、第三位的GC含量、以及總的GC含量和ENC值，繪制箱線圖。統(tǒng)計編碼蛋白RSCU值和莓葉萎陵菜不同重復(fù)類型中各重復(fù)序列數(shù)目，使用ggplot2包，分別繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 莓葉委陵菜的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)

莓葉委陵菜葉綠體基因組全長為156 844 bp，為典型的雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)（圖1），由一個大單拷貝區(qū)（LSC）、一個小單拷貝區(qū)（SSC）和一對反向重復(fù)區(qū)域（IR）組成。共包含128個基因，其中編碼蛋白質(zhì)的基因有83個，rRNA基因有8個，tRNA基因37個。根據(jù)不同功能，可將其蛋白編碼基因分成4類（表2），分別是atpA，atpB，atpE，atpF等45個光合作用基因，rpl14，rpl16，rpl2，rpl20等29個自我復(fù)制基因，5個accD，ccsA，cemA，clpP，matK其他基因以及4個ycf1，ycf2（2），ycf4未知功能基因。

2.2 莓葉委陵菜葉綠體基因組重復(fù)序列分析

使用在線軟件MISA軟件檢測莓葉委陵菜葉綠體基因組的SSR序列，共檢測到77個SSR，其中，單核苷酸的SSR最多，一共有53個SSR，其余的二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸數(shù)目分別為10，5，7，2，并沒有發(fā)現(xiàn)六核苷酸。莓葉委陵菜的葉綠體基因組SSR主要位于LSC區(qū)，共含有57個SSR。共鑒定出五種類型的長重復(fù)序列，分別為正向、反向、互補、回文和串聯(lián)重復(fù)序列。正向、反向、回文和互補序列通過REPuter軟件確定，串聯(lián)重復(fù)序列使用Tandem Repeats Finder軟件查找，一共找到124個長重復(fù)序列（圖2）。

2.3 密碼子組成分析

各個基因不同位置的密碼子GC含量及ENC值大小不同（圖3）。其中GC含量為37.8%，密碼子第一位（GC1）、第二位（GC2）、密碼子第三位（GC3）含量分別為46.10%，37.79%，29.39%。由圖中每個基因中的GC含量分布可知，密碼子第一位的GC含量普遍較高，第三位密碼子的GC含量較低，說明密碼子偏好以A/U結(jié)尾。莓葉委陵菜的ENC在36.38～58.72之間，平均ENC值為49.47。ENC是對同義密碼子組之間不均勻使用的評估，其范圍為20～61，其中ENC值為20時，屬于極端偏差，每個氨基酸僅使用一個密碼子，而ENC值為61時，屬于無偏差，密碼子隨機使用。從圖中可知，莓葉委陵菜的ENC值更偏向于61一端，可見其密碼子的偏好性不強（圖3）。

2.4 RSCU分析

選擇莓葉委陵菜中的蛋白質(zhì)編碼序列，使用Codon W 1.4.4進行各個氨基酸中密碼子的RSCU值計算，結(jié)果使用R語言繪堆積柱狀圖。在編碼同一氨基酸的密碼子中，其RSCU值越大，其密碼子越被偏好使用。在莓葉委陵菜RSCU值相對較大的密碼子中，更多以A/U結(jié)尾。在所有密碼子中，編碼亮氨酸的密碼子UUA的RSCU值最大2.02，也是莓葉委陵菜葉綠體基因組所有密碼子唯一RSCU值大于2的密碼子（圖4）。

2.5 莓葉委陵菜葉綠體基因組比較分析

選取薔薇科下的草莓屬、薔薇屬、委陵菜屬中的代表性物種滇藏草莓（Fragaria tibetica）、現(xiàn)代月季（Rosa hybrida）、蛇莓（Potentilla indica）與莓葉委陵菜進行IR邊界比較。IR/SC邊界處的擴增和收縮在葉綠體基因組中更為常見，與蛇莓相比，其IR邊界存在收縮，而與滇藏草莓和現(xiàn)代月季相比，其IR邊界存在一定的擴張。除了現(xiàn)代月季外，rpl2基因全部位于IR區(qū)內(nèi)，假基因ycf1在滇藏草莓、現(xiàn)代月季、蛇莓中位于IR區(qū)或者橫跨IR/SSC邊界區(qū)，而莓葉委陵菜的ycf1基因只存在于SSC區(qū)，四個物種的ndhF基因均全部位于SSC區(qū)內(nèi)（圖5）。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

選取薔薇科下草莓屬、薔薇屬、委陵菜屬下的13個物種進行系統(tǒng)發(fā)育分析，選取胡頹子科下的兩個物種作為外類群，使用MAFFT v7.471進行多序列比對，比對之后的結(jié)果用MEGA 7.0.26最大似然法（Maximum likelihood，ML）構(gòu)建進化樹，該方法與貝葉斯法構(gòu)建的進化樹結(jié)果一致。草莓屬的物種滇藏草莓（Fragaria tibetica）先聚成一支，被分類出來。在所選的物種中，莓葉委陵菜與蛇莓（Potentilla indica）親緣關(guān)系最近，以100%自舉值聚在一起，與委陵菜屬下的匍匐委陵菜（Potentilla stolonifera var. quelpaertensis）、三葉委陵菜（Potentilla freyniana）、鵝肝萎陵菜（Potentilla gageodoensis）、釘柱委陵菜（Potentilla saundersiana）屬于姐妹分支（圖6）。

3 討論

葉綠體是自我復(fù)制和母系遺傳的植物特異性細(xì)胞器，可調(diào)節(jié)光合作用以在植物和藻類中提供所需的能量，在陸地植物中，其葉綠體是高度保守的，均為典型的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，含有約80種蛋白質(zhì)編碼基因^［9］。與核基因組和線粒體基因組相比，葉綠體基因組在結(jié)構(gòu)和功能上具有特殊性，如體積小、保守性強、結(jié)構(gòu)簡單、單親遺傳等。這些特征在遺傳轉(zhuǎn)化中具有優(yōu)勢。莓葉委陵菜葉綠體基因組為典型的四分結(jié)構(gòu)，即一對反向重度IR區(qū)和LSC區(qū)、SSC區(qū)，該結(jié)構(gòu)與已經(jīng)發(fā)表的葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)相一致^{［8，23-24］}。該葉綠體基因組一共含有128個基因，其中有20個基因為重復(fù)基因，類屬tRNA的trnE-UUC基因在該葉綠體基因組中的重復(fù)次數(shù)達(dá)到3次。

重復(fù)序列在基因組重排和提供穩(wěn)定的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)中起重要作用^［25］。由于拷貝數(shù)和長度的變化，重復(fù)序列在理解物種、生物地理學(xué)和種群遺傳學(xué)之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系方面引起了相當(dāng)大的關(guān)注。從莓葉委陵菜葉綠體基因組中共鑒定出來107個長的重復(fù)序列和63個簡單重復(fù)序列。長重復(fù)序列中，串聯(lián)重復(fù)序列最多，一共鑒定出來67個，而互補重復(fù)序列只有1個。我們發(fā)現(xiàn)SSR在葉綠體基因組中偏向AT核苷酸重復(fù)，從而產(chǎn)生富含AT的葉綠體基因組，該結(jié)果與雜花苜蓿（Medicago varia）^［26］、Prunus triloba var. plena^［27］等SSR的單核苷酸重復(fù)A/T含量較高一致。IR區(qū)域邊界的收縮和擴張被認(rèn)為是導(dǎo)致基因組大小變化的最有效過程，這些收縮和擴增是葉綠體基因組中重要的進化事件，對基因組大小有影響^［8］。在所選的物種中蛇莓具有最大的IR區(qū)，表現(xiàn)為明顯的擴增。

編碼序列中的密碼子使用模式對于植物的識別具有重要作用，密碼子使用偏差主要受自然選擇和突變壓力的影響^［28］。然而，決定密碼子使用偏差的主要因素在許多物種之間是不同的。同義密碼子使用偏差是生物分類群中不可避免的現(xiàn)象，通常是指不同物種之間或同一物種基因組內(nèi)密碼子發(fā)生頻率的差異^［29］。密碼子第三位堿基的同義突變不能改變氨基酸的類型，但它仍然被認(rèn)為是確定氨基酸類型的重要特征，因此GC3常被用作密碼子偏差的重要指標(biāo)。在本研究中，GC3 lt;GC2lt;GC1，其GC3含量僅為29.39%，含量較低，也說明了密碼子偏好以A/T結(jié)尾，該結(jié)果與Mesona chinensis Benth^［28］、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）^［30］等的結(jié)果一致。

葉綠體基因組序列可以推斷不同分類學(xué)分類水平的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系^{［23，31］}，基于整個葉綠體基因組序列，已經(jīng)解決了深部節(jié)點水平的許多系統(tǒng)發(fā)育問題，例如，山茶科物種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系^［32］，葉綠體基因組數(shù)據(jù)集也可以解決淺層系統(tǒng)發(fā)育問題。本研究中，莓葉委陵菜與釘柱委陵菜（Potentilla saundersiana）屬于姐妹分支，與蛇莓（Potentilla indica）親緣關(guān)系最近，得到了100%自舉值支持。

4 結(jié)論

本研究對莓葉委陵菜的葉綠體基因組進行了組裝和注釋，分析了其葉綠體基因組結(jié)構(gòu)相關(guān)特征，并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。莓葉委陵菜葉綠體基因組全長為156 844 bp，共包含128個基因，檢測到77個SSR，其中，單核苷酸的SSR最多，RSCU值相對較大的密碼子中，多以A/U結(jié)尾；莓葉委陵菜葉綠體基因組邊界存在一定的擴張，在進化關(guān)系上與蛇莓（Potentilla indica）親緣關(guān)系最近，為莓葉委陵菜的系統(tǒng)發(fā)育和遺傳研究提供了一定參考。

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（責(zé)任編輯 彭露茜）