摘要：紫花苜蓿（Medicago sativa L.）作為一種營養(yǎng)價值高、適口性好的豆科牧草，在我國種植面積不斷擴大，其優(yōu)質(zhì)種子的需求量也逐年增多。因此，提高單位面積的種子產(chǎn)量對我國紫花苜蓿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。為挖掘調(diào)控種子產(chǎn)量與外形的相關(guān)基因，本研究中，利用從世界各地收集的220份紫花苜蓿種子材料，對其種子重量（Seed weight，SW）、種子面積（Seed area，SA）、種子周長（Seed perimeter，SP）進行全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-wide association study，GWAS）。表型分析表明3個性狀存在不同程度的變異，變異系數(shù)分別為10.96%（SW），8.31%（SA），4.43%（SP）。通過GWAS，共在7條染色體上發(fā)現(xiàn)20個與3個性狀相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）位點，單倍型分析證實了優(yōu)異等位基因的數(shù)量與SW，SA和SP之間存在正相關(guān)性。對這20個顯著SNP上下游各20 kb范圍內(nèi)的基因進行搜索注釋，最終篩選到4個與種子產(chǎn)量和大小相關(guān)的候選基因。本研究的結(jié)果可為優(yōu)化紫花苜蓿種子大小，提高種子產(chǎn)量的分子育種提供新的標記與候選基因。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；全基因組關(guān)聯(lián)分析；種子大?。环N子產(chǎn)量

中圖分類號：S963.22+3.3""" 文獻標識碼：A"""" 文章編號：1007-0435（2024）08-2419-09

Genome-Wide Association Study （GWAS） of Seed Yield and Size-Related

Traits of Alfalfa （Medicago sativa L.）

XU Ming1，2， JIANG Xue-qian2， HE Fei2， ZHANG Fan2， YANG Tian-hui3，

LONG Rui-cai2， YANG Qing-chuan2*， CONG Li-li1*

（1.College of Grassland Science， Qingdao Agricultural University， Qingdao， Shandong Province 266109， China；

2.Institute of Animal Sciences， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China；

3.Institute of Animal Science， Ningxia Academy of Agricultural and Forestry Sciences， Yinchuan， Ningxia 750002， China）

Abstract：Alfalfa （Medicago sativa L.），as a leguminous forage with high nutritional value and good palatability，has been grown in more areas of China，and the demand of high-quality seeds is increasing year by year. Therefore，increasing the seed yield per unit area is of great significance to the development of alfalfa industry in China. In order to explore the genes related to the regulation of seed yield and shape，in this study，220 alfalfa seed materials collected from all over the world were used to evaluate their seed weight （SW），seed area （SA） and seed perimeter （SP） using Genome-wide association study （GWAS）. Phenotypic analysis showed that the three traits had different degrees of variation，and the coefficients of variation were 10.96% （SW），8.31% （SA），and 4.43% （SP），respectively. Through GWAS，a total of 20 single nucleotide polymorphism （SNP） sites associated with three traits were found on 7 chromosomes. Haplotype analysis confirmed that there was a positive correlation between the number of excellent alleles and SW，SA and SP. Genes near these 20 significant SNPs were searched and labeled in the upstream and downstream 20 kb range，and finally 4 candidate genes related to seed yield and size were selected. The results of this study could provide new markers and candidate genes for molecular breeding to optimize alfalfa seed size and increase seed yield.

Key words：Alfalfa；GWAS；Seed size；Seed yield

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）作為一種廣泛種植且適口性好的多年生豆科牧草，有著“牧草之王”的美譽［1］。近年來，由于飼草的“增產(chǎn)節(jié)糧”作用，需求量不斷攀升，而苜蓿作為優(yōu)質(zhì)飼草，更是供不應(yīng)求［2］。隨著紫花苜蓿種植面積的不斷擴大，市場對優(yōu)質(zhì)紫花苜蓿種子的需求也在不斷增加［3］。2021年，我國紫花苜蓿種子產(chǎn)量為0.29萬噸，進口量為0.52萬噸［4］，為滿足我國紫花苜蓿種植需求，仍需從其他國家大量進口草種。另外，種子的質(zhì)量差，成本高也是中國紫花苜蓿種子生產(chǎn)面臨的主要問題［5］。因此，提高苜蓿種子產(chǎn)量是解決中國苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要途徑之一。

種子生產(chǎn)長期以來一直都是草業(yè)發(fā)展的重點領(lǐng)域，優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的種子是草地建設(shè)以及畜牧業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)物質(zhì)保障［6］。近年來，我國在增加紫花苜蓿種子產(chǎn)量方面的研究逐漸增多。王琴等［7］研究發(fā)現(xiàn)，對于寧夏干旱地區(qū)，紫花苜蓿種植株距15 cm，行距100 cm為提高紫花苜蓿種子產(chǎn)量的最佳配比。陳濤等［8］研究發(fā)現(xiàn)，對于蘭州大學(xué)培育的抗寒苜蓿新品系，種子生產(chǎn)最適灌溉次數(shù)為3次，灌溉時施硼肥濃度最適為0.6%。對于種子發(fā)育的遺傳機理，有報道稱，植物激素在種子發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，比如脫落酸與赤霉素［9-10］。Zhao等［11］為探究脫落酸和赤霉素在紫花苜蓿種子發(fā)育過程中作用機理，對紫花苜蓿種子的5個發(fā)育階段進行轉(zhuǎn)錄組分析，最終找到14個與脫落酸相關(guān)，20個與赤霉素相關(guān)的差異表達基因，揭示了這些差異表達基因在種子發(fā)育過程中的重要作用。MPK（絲裂原活化蛋白激酶）蛋白家族多種轉(zhuǎn)錄因子通過一系列磷酸化過程，也能正調(diào)控種子發(fā)育［12］。此外，如GRF4，KLU等轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控種子種皮細胞增殖和胚乳的生長等過程也能來調(diào)控植物種子大小［13-14］。相較于對特定地區(qū)或者特定品系的研究，探索控制種子產(chǎn)量構(gòu)成因素的遺傳機理及挖掘相關(guān)基因更是我國提高種子產(chǎn)量的迫切需求。

種子重量是種子產(chǎn)量重要的構(gòu)成因素，面積與大小是種子大小的重要性狀，均屬典型的數(shù)量性狀。數(shù)量性狀基因座（Quantitative trait loci，QTL）定位和GWAS是研究數(shù)量性狀的主要方法［15］。QTL定位是利用雙親雜交群體進行遺傳位點定位的方法，后期可以將關(guān)聯(lián)標記用分子標記輔助育種（Marker-assisted selection，MAS）或者結(jié)合GWAS進行分析。GWAS是以群體為研究對象，定位性狀關(guān)聯(lián)的標記，這個策略相比于QTL定位在群體構(gòu)建方面會節(jié)省時間，定位到的候選區(qū)間也更小，關(guān)聯(lián)標記可以直接用于MAS［16］。Chen等［17］對茶樹（Camellia spp.）葉片相關(guān)性狀進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，鑒定出6個與葉片大小等形態(tài)性狀相關(guān)的候選基因，并通過RT-qPCR驗證了2個葉片大小相關(guān)候選基因的表達，證實了它們的功能作用。近年來，GWAS被廣泛應(yīng)用于闡明紫花苜蓿數(shù)量性狀的遺傳位點，比如品質(zhì)［18］、黃萎病抗性［19］、抗旱性［20］和耐鹽性［21］。同樣，GWAS在籽粒性狀方面也取得了一定成就。嚴勇亮等［22］對298份小麥（Triticum aestivum L.）材料進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，找到84個顯著SNP位點，并篩選得到6個可能與小麥籽粒性狀相關(guān)的候選基因。楊丹丹等［23］對124份水稻（Oryza sativa L.）材料進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，找到22個與水稻籽粒性狀相關(guān)的顯著SNP位點。

由于紫花苜蓿是同源四倍體作物以及高度雜合性［24］，目前對紫花苜蓿種子產(chǎn)量與大小相關(guān)遺傳機理的研究少之又少。為了鑒定與種子產(chǎn)量與大小相關(guān)的顯著SNP，本研究從世界各地收集了220份紫花苜蓿種子材料，并測量了其千粒重、面積、周長。分析其大小、重量的自然變異，并基于875 023個高質(zhì)量SNP標記的全基因組關(guān)聯(lián)分析鑒定了一些與紫花苜蓿種子大小和產(chǎn)量有關(guān)的顯著相關(guān)位點和候選基因。該結(jié)果將有助于更好地理解控制紫花苜蓿種子大小和產(chǎn)量的遺傳和分子過程，以及為標記輔助育種提供新的分子標記。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究使用了一個由220個苜蓿種質(zhì)組成的關(guān)聯(lián)群體來分析SNP標記與種子產(chǎn)量和大小相關(guān)性狀之間的關(guān)系。該群體的材料來自于50個國家，由220個基因型組成，其中包括16個野生材料，93個地方品種，86個栽培品種，以及25個改良狀況不明確的材料［25］。194個種子材料來源于美國國家植物種質(zhì)資源系統(tǒng)（https：//npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/search），26個種子材料來源于全國畜牧總站國家牧草種質(zhì)資源中期庫。

1.2 表型數(shù)據(jù)收集與分析

對于每份材料，測量了三個與種子產(chǎn)量和大小相關(guān)的性狀：種子重量（Seed weight，SW），種子面積（Seed area，SA），種子周長（Seed perimeter，SP）。對于SW，測量千粒重作為表型值，每份材料測量5次，取平均值作為表型值。對于SA和SP，將種子平鋪到紙上進行拍照，采用ImageJ軟件對種子投影到紙上的面積與周長進行測定，每份材料測100粒種子，最終取平均值進行表型分析與全基因組關(guān)聯(lián)分析。使用EXCEL、SPSS19、R4.1.3進行數(shù)據(jù)處理與分析，變異系數(shù)為標準差與平均值的比值。

1.3 群體建立

對表型數(shù)據(jù)收集完畢之后，進行GWAS群體的建立。2017年，將種質(zhì)材料種植于河北廊坊中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院國際農(nóng)業(yè)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園溫室中，于2018年四月份移至田間。試驗設(shè)計采用隨機區(qū)組方式，共包含三個重復(fù)，每個重復(fù)5個單株，單株間距30 cm，不同種質(zhì)材料間行距和列距都為65 cm。田間管理根據(jù)生長情況人工除草，沒有進行額外施肥或者灌溉工作。

1.4 重測序與SNP標記開發(fā)

重測序和SNP標記開發(fā)根據(jù)課題組之前已報道的研究方法［25］。即基于田間表型觀察，從每份材料中選取有代表性的一株（一個種質(zhì)材料中生長跟其他個體相對一致的單株個體）進行DNA提取。每份材料取單株大約100 mg，然后使用康為植物基因組提取試劑盒按照說明書進行DNA提取。全基因組重測序首先是將DNA利用超聲波打斷，然后選擇片段大小大約300 bp的片段，接著末端修復(fù)，然后添加通用接頭，使用PCR方法擴增DNA。最后使用NovaSeq 6000測序平臺進行DNA測序。整個測序流程在北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司完成。每個樣品測序數(shù)據(jù)量大約10 Gb，測序質(zhì)量Q30達到85%。原始數(shù)據(jù)上傳至國家基因組科學(xué)數(shù)據(jù)中心（NGDC，https：//bigd.big.ac.cn/），BioProject編號為PRJCA004024。

測序數(shù)據(jù)首先使用Trimmomatic軟件進行過濾，去除測序接頭和引物序列，同時也會去掉測序質(zhì)量值較低的序列。然后使用BWA-MEM軟件進行序列比對，將重測序數(shù)據(jù)比對到‘中苜4號’參考基因組上，使用SAMtools軟件將上一步的SAM文件轉(zhuǎn)換為BAM文件并進行排序。Picard軟件用來標記重復(fù)序列，GATK軟件用來矯正小片段插入及缺失對SNP結(jié)果的干擾。利用SAMtools mpileup結(jié)合VarScan檢測SNP。以上軟件參數(shù)使用默認參數(shù)。最后使用VCFtools進行過濾，過濾條件缺失值小于10%，次等位基因頻率大于等于0.05，最小測序深度超過5。最終開發(fā)了875 023個高質(zhì)量SNP。

1.5 全基因組關(guān)聯(lián)分析

基于開發(fā)的875 023個高質(zhì)量SNP，本研究使用GAPIT3的BLINK模型進行全基因組關(guān)聯(lián)分析［26］。顯著性位點的閾值（-Log10（P），logarithm of odds，LOD）設(shè)置為5。使用R包“CMplot”進行GWAS結(jié)果可視化。另外，對所有LOD≥5的顯著SNP位點進行共定位SNP位點數(shù)量分析以及單倍型分析。使用R包“broom”“ggplot2”等進行單倍型顯著性分析，顯著性檢驗方式為T-test。對于每個SNP，選擇表型較為優(yōu)異的等位基因作為優(yōu)異等位基因。

1.6 候選基因分析

根據(jù)顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點信息以及連鎖不平衡鑒定候選基因?；凇熊?號’參考基因組，在顯著SNP位點上下游各20 kb范圍內(nèi)鑒定所有基因。使用美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的Protein BLAST功能對這些基因進行搜索。與種子形態(tài)和植物發(fā)育相關(guān)的已知基因被優(yōu)先考慮為影響種子產(chǎn)量與大小的候選基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型分析

220份材料在三個表型中出現(xiàn)了不同程度的變異（表1）。其中，SW的分布范圍為1.417～3.013 g，SA的分布范圍為1.995～3.070 mm2，SP的分布范圍為5.572～7.072 mm。三個表型的變異系數(shù)分別為10.96%（SW），8.31%（SA），4.43%（SP），SW的變異系數(shù)最大，SP的變異系數(shù)最小。其他統(tǒng)計信息比如平均值、極大值、極小值、峰度、偏度如表1所示。SW，SA和SP均呈正態(tài)分布（圖1），證實了3個表型遵循典型的數(shù)量性狀的遺傳模式。相關(guān)性分析表明（圖2），三個表型之間存在正相關(guān)關(guān)系（Plt;0.001），SW與SA和SP之間的R2分別為0.3818和0.3616，SA與SP之間的R2達到了0.9780。

2.2 全基因組關(guān)聯(lián)分析

基于SW，SA和SP與之前研究得到的875 023個高質(zhì)量SNP位點，對220份材料進行全基因組關(guān)聯(lián)分析。本研究采用GAPIT3的BLINK模型，以LOD≥5作為閾值，共得到20個與這三個種子產(chǎn)量相關(guān)性狀關(guān)聯(lián)的SNP位點（圖3和表2）。其中，與SW相關(guān)聯(lián)的有6個，與SA相關(guān)聯(lián)的8個，與SP相關(guān)聯(lián)的有6個。這20個顯著SNP分布于除2號染色體以外的7條染色體上。在這20個顯著SNP中，C/T等位基因出現(xiàn)的頻率最高，總共出現(xiàn)7次，占35%。

進一步對GWAS結(jié)果進行分析，發(fā)現(xiàn)在這20個顯著SNP中有5個SNP（chr7__10556808，chr1__75410059，chr6__20720026，chr7__54495445和chr4__11495564）共同出現(xiàn)在SA與SP中（圖4）。然而，SW并沒有出現(xiàn)與其他2個性狀共同定位的SNP位點，可能是因為種子重量與種子大小存在不同的遺傳機制。

對于顯著SNP位點，對其進行單倍型分析。選取每個SNP位點表型較為優(yōu)異的等位基因作為優(yōu)異等位基因。最終獲得每份材料中所含優(yōu)異等位基因數(shù)量與各表型之間關(guān)系散點圖（圖5），通過線性回歸曲線顯示，每份材料中所含有的優(yōu)異等位基因數(shù)量與各表型之間均存在正相關(guān)關(guān)系（Plt;0.001）。其中，每份材料中優(yōu)異等位基因的數(shù)量與SA的擬合度最高（R2=0.3762），與SW的擬合度最小（R2=0.2752）。

2.3 候選基因分析

基于‘中苜4號’參考基因組，在20個顯著SNP上下游各20 kb范圍內(nèi)共檢測到42個基因。通過基因注釋以及前人對基因功能的報道，篩選到21個參與植物發(fā)育或者生殖相關(guān)的基因（表3）。在這21個基因中，有4個基因已被報道與種子或者籽粒性狀相關(guān)。其中，與SW相關(guān)的基因有Msa0385030（FHA結(jié)構(gòu)域蛋白）、Msa0385050（MADS-box蛋白）、Msa0013950（咖啡酸甲基轉(zhuǎn)移酶）。與SA和SP相關(guān)的基因有Msa0043950（LOB結(jié)構(gòu)域蛋白）。值得注意的是，我們篩選到的與SW相關(guān)的其中2個候選基因都位于同一個SNP位點（chr3__88499752）附近。而基因Msa0043950則是位于SA與SP共定位的chr1__75410059附近。

3 討論

為解決我國紫花苜蓿種子供不應(yīng)求、仍需從國外進口草種的問題，提高種子產(chǎn)量是可行的方法之一。種子重量與種子大小是種子產(chǎn)量的重要構(gòu)成因素。探索種子發(fā)育的遺傳機理是提高種子產(chǎn)量的首要目標。有報道稱，在大豆（Glycine max）中，較大的種子不一定能提高種子產(chǎn)量，對比較小的種子，有時甚至?xí)档头N子產(chǎn)量［27］。但是，較大的種子被認為能量儲備較多，并擁有較大的子葉與初始活力，種子的品質(zhì)也就比較好［28］，所以本研究以種子重量、種子面積與周長較大為優(yōu)異表型。對于表型分析，三個性狀之間存在正相關(guān)關(guān)系，這與之前的研究一致［29］。另外，種子周長的變異系數(shù)在三個性狀中最小（4.43%），千粒重、種子面積也存在不同程度的表型變異，表明不同苜蓿品種間存在表型多樣性，這種變異為通過優(yōu)化種子形態(tài)來育種提供了有用的遺傳潛力。

本研究選擇GAPIT3的BLINK模型進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，BLINK模型能更好的控制假陽性，且BLINK模型會考慮顯著SNP的連鎖性，從而去除部分顯著SNP，只保留與性狀最相關(guān)的SNP位點，所以不會出現(xiàn)某一染色體區(qū)域成簇關(guān)聯(lián)的SNP標記［30］。本研究使用BLINK模型共在除2號染色體以外的7條染色體上發(fā)現(xiàn)20個與種子產(chǎn)量相關(guān)的顯著SNP位點，其中5個顯著SNP位點在SA與SP中被同時定位到，是值得注意的SNP位點。由于對紫花苜蓿種子產(chǎn)量與大小相關(guān)性狀的GWAS分析較少，本研究的發(fā)現(xiàn)將為標記輔助育種提供新的分子標記。通過對GWAS在三個性狀中找到的顯著SNP位點進行單倍型分析，證實了每份材料中存在的優(yōu)異等位基因的數(shù)量與表型之間存在正相關(guān)關(guān)系。

本研究一共鑒定出了20個顯著SNP與4個與種子產(chǎn)量相關(guān)的候選基因。chr3__88499752周圍發(fā)現(xiàn)2個候選基因，其中Msa0385030的功能注釋為FHA結(jié)構(gòu)域蛋白，Morris等［31］發(fā)現(xiàn)，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）含有FHA結(jié)構(gòu)域蛋白的區(qū)域插入T-DNA破壞后，產(chǎn)生了一個功能缺失的突變體，該突變體對比期野生型表現(xiàn)出嚴重的營養(yǎng)和生殖器官缺陷，且結(jié)實率大幅降低，該試驗證實了FHA結(jié)構(gòu)域蛋白在種子生產(chǎn)中的重要作用。chr3__88499752周圍的另一個候選基因Msa0385050的功能注釋為MADS-box蛋白，該蛋白報道的與種子相關(guān)的研究較多。MADS-box基因在植物中主要分為I型和II型MADS-box基因，部分I型MADS-box基因影響配子和種子的發(fā)育［32］，它們能夠通過促進胚乳細胞增殖而抑制細胞化的發(fā)生來影響種子的發(fā)育［33］。Zhang等［34］在小麥中發(fā)現(xiàn)基因TaMADS-GS編碼MADS-box轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄因子在小麥籽粒發(fā)育早期調(diào)控細胞分裂素信號通路，從而調(diào)節(jié)籽粒大小和重量。chr1__21815402周圍的Msa0013950功能注釋為咖啡酸甲基轉(zhuǎn)移酶，Huangfu等［35］研究發(fā)現(xiàn)，咖啡酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因是水稻籽粒產(chǎn)量的正調(diào)節(jié)因子，即使在高產(chǎn)品種背景下，過表達該基因也能提高單株籽粒產(chǎn)量。與SA和SP相關(guān)的chr1__75410059，在其附近發(fā)現(xiàn)的Msa0043950，其功能注釋為LOB結(jié)構(gòu)域蛋白，Bajaj等［36］曾將轉(zhuǎn)錄組分析、種子重量QTL/eQTL定位、分子單倍型和關(guān)聯(lián)分析相結(jié)合，確定了LOB結(jié)構(gòu)域蛋白正向調(diào)控鷹嘴豆（Cicer arietinum）種子重量。本研究中鑒定的這4個基因可為紫花苜蓿種子產(chǎn)量與大小的分子研究提供重要的候選基因。

4 結(jié)論

在本研究中，使用來自世界各地的220份紫花苜蓿種子材料，基于篩選到的875 023個高質(zhì)量SNP，對種子種子重量、種子面積、種子周長3個性狀進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，共檢測到20個顯著SNP和4個與種子產(chǎn)量和大小相關(guān)的候選基因，其功能有待進一步驗證。本研究旨在更好地理解控制紫花苜蓿種子大小與產(chǎn)量的遺傳和分子過程，以及為標記輔助育種提供新的分子標記。

參考文獻

［1］ 孫啟忠，柳茜，李峰，等. 我國古代苜蓿物種考述［J］. 草業(yè)學(xué)報，2018，27（8）：155-174

［2］ 楊富裕. 樹立“飼草就是糧食”理念，大力發(fā)展飼草產(chǎn)業(yè)［J］. 草地學(xué)報，2023，31（2）：311-313

［3］ 李小云，余淑艷，黃薇，等. 覆膜對寧夏干旱區(qū)苜蓿種子產(chǎn)量及構(gòu)成因素的影響［J］. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2022，50（2）：67-74

［4］ 國家林草局國有林場和種苗管理司. 2023年度全國草種供需分析報告［EB/OL］. https：//www.forestry.gov.cn/main/586/20221120/215148550687091.html. 2022-11-20/2024-3-20

［5］ 俞鴻，歐成明，王占軍，等. 農(nóng)藝措施對紫花苜蓿種子產(chǎn)量組分的影響［J］. 草地學(xué)報，2021，29（12）：2853-2861

［6］ 毛培勝，歐成明，賈志程，等. 我國牧草與草坪草種子生產(chǎn)技術(shù)的研究進展［J］. 中國草地學(xué)報，2023，45（1）：1-11

［7］ 王琴，李小云，黃淑迪，等. 株行距對寧夏干旱區(qū)苜蓿種子產(chǎn)量及構(gòu)成因素的影響［J］. 中國草地學(xué)報，2023，45（8）：31-40

［8］ 陳濤. 灌溉與硼肥對河西地區(qū)紫花苜蓿和紅豆草新品系種子產(chǎn)量及質(zhì)量的影響［D］. 蘭州：蘭州大學(xué)，2023：18-44

［9］ NYKIEL M，GIETLER M，F(xiàn)IDLER J，et al. Abiotic stress signaling and responses in plants［J］. Plants （Basel），2023，12（19）：3405

［10］LIU H，ZHANG C，YANG J，et al. Hormone modulation of legume-rhizobial symbiosis［J］. Journal of Integrative Plant Biology，2018，60（8）：632-648

［11］ZHAO L，LI M，MA X，et al. Transcriptome analysis and identification of abscisic acid and gibberellin-related genes during seed development of alfalfa （Medicago sativa L.）［J］. BMC Genomics，2022，23（1）：651

［12］LPEZ-BUCIO J S，DUBROVSKY J G，RAYA-GONZLEZ J，et al. Arabidopsis thaliana mitogen-activated protein kinase 6 is involved in seed formation and modulation of primary and lateral root development［J］. Journal of Experimental Botany，2014，65（1）：169-183

［13］HU J，WANG Y，F(xiàn)ANG Y，et al. A rare allele of GS2 enhances grain size and grain yield in rice［J］. Molecular Plant，2015，8（10）：1455-1465

［14］LIANG G，HE H，LI Y，et al. Molecular mechanism of microRNA396 mediating pistil development in arabidopsis［J］. Plant Physiology and Biochemistry，2014，164（1）：249-258

［15］GUPTA P K，KULWAL P L，JAISWAL V. Association mapping in plants in the post-GWAS genomics era［J］. Advances in Genetics，2019（104）：75-154

［16］周艷春，劉建，徐安凱，等. 93份無芒雀麥種質(zhì)資源產(chǎn)量性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析［J］. 草地學(xué)報，2020，28（3）：623-632

［17］CHEN Y，NIU S，DENG X，et al. Genome-wide association study of leaf-related traits in tea plant in Guizhou based on genotyping-by-sequencing［J］. BMC Plant Biology，2023，23（1）：1-19

［18］LIN S，MEDINA C A，NORBERG O S，et al. Genome-wide association studies identifying multiple loci associated with alfalfa forage quality［J］. Frontiers in Plant Science，2021（12）：1-15

［19］YU L X，ZHENG P，BHAMIDIMARRI S，et al. The impact of genotyping-by-sequencing pipelines on SNP discovery and identification of markers associated with verticillium wilt resistance in autotetraploid alfalfa （Medicago sativa L.）［J］. Frontiers in Plant Science，2017（8）：1-13

［20］YU L X. Identification of single-nucleotide polymorphic loci associated with biomass yield under water deficit in alfalfa （Medicago sativa L.） using genome-wide sequencing and association mapping［J］. Frontiers in Plant Science，2017（8）：1-11

［21］MEDINA C A，HAWKINS C，LIU X P，et al. Genome-wide association and prediction of traits related to salt tolerance in autotetraploid alfalfa （Medicago sativa L.）［J］. International Journal of Molecular Sciences，2020，21（9）：3361

［22］嚴勇亮，張恒，張金波，等. 春小麥主要籽粒性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析［J］. 麥類作物學(xué)報，2022，42（10）：1182-1191

［23］楊丹丹，李小林，呂瑩，等. 云南水稻新品系重要農(nóng)藝性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析［J］. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2023，36（9）：1825-1834

［24］CHEN H，ZENG Y，YANG Y，et al. Allele-aware chromosome-level genome assembly and efficient transgene-free genome editing for the autotetraploid cultivated alfalfa［J］. Nature Communications，2020，11（1）：1-11

［25］CHEN L，HE F，LONG R，et al. A global alfalfa diversity panel reveals genomic selection signatures in Chinese varieties and genomic associations with root development［J］. Journal of Integrative Plant Biology，2021，63（11）：1937-1951

［26］HUANG M，LIU X，ZHOU Y，et al. BLINK：a package for the next level of genome-wide association studies with both individuals and markers in the millions［J］. Gigascience，2019，8（2）：1-12

［27］XU C，WU T，YUAN S，et al. Can soybean cultivars with larger seed size produce more protein，lipids，and seed yield？ A meta-analysis［J］. Foods，2022，11（24）：40-59

［28］AMBIKA S，MANONMANI V，SOMASUNDARAM G. Review on effect of seed size on seedling vigour and seed yield［J］. Research Journal of Seed Science，2014，7（2）：31-38

［29］尹淑英. 紫花苜蓿的種子功能性狀及SSR分子標記的遺傳多樣性［D］. 蘭州：蘭州大學(xué)，2018：19-26

［30］WANG J，ZHANG Z. GAPIT version 3：boosting power and accuracy for genomic association and prediction［J］. Genomics Proteomics Bioinformatics，2021，19（4）：629-640

［31］MORRIS E R，CHEVALIER D，WALKER J C. DAWDLE，a forkhead-associated domain gene，regulates multiple aspects of plant development［J］. Plant Physiology，2006，141（3）：932-941

［32］KAPAZOGLOU A，ENGINEER C，DROSOU V，et al. The study of two barley type I-like MADS-box genes as potential targets of epigenetic regulation during seed development［J］. BMC Plant Biology，2012，12：166

［33］LAFON-PLACETTE C，KHLER C. Embryo and endosperm，partners in seed development［J］. Current Opinion in Plant Biology，2014（17）：64-69

［34］ZHANG J，ZHANG Z，ZHANG R，et al. Type I MADS-box transcription factor TaMADS-GS regulates grain size by stabilizing cytokinin signalling during endosperm cellularization in wheat［J］. Plant Biotechnology Journal，2024，22（1）：200-215

［35］HUANGFU L，CHEN R，LU Y，et al. OsCOMT，encoding a caffeic acid O-methyltransferase in melatonin biosynthesis，increases rice grain yield through dual regulation of leaf senescence and vascular development［J］. Plant Biotechnology Journal，2022，20（6）：1122-1139

［36］BAJAJ D，SAXENA M S，KUJUR A，et al，Genome-wide conserved non-coding microsatellite （CNMS） marker-based integrative genetical genomics for quantitative dissection of seed weight in chickpea［J］. Journal of Experimental Botany，2015，66（5）：1271-1290

（責(zé)任編輯 劉婷婷）