關(guān)鍵詞：藍(lán)莓；柱頭；授粉強(qiáng)度；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；差異表達(dá)基因

藍(lán)莓（Vaccinium corymbosum L.）是杜鵑花科越橘屬植物，富含花青素、果膠、超氧化物歧化酶等物質(zhì)，有極高保健功能[12]。由于其獨(dú)特的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，藍(lán)莓鮮果及加工制品在世界各地廣受青睞，是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ墓δ苄允称穂3]。隨著人們對(duì)藍(lán)莓需求的增加，其種植面積越來(lái)越大，如何提高藍(lán)莓產(chǎn)量和品質(zhì)已成為主要研究熱點(diǎn)。

授粉對(duì)農(nóng)作物生產(chǎn)至關(guān)重要。研究表明，花粉具有群體效應(yīng)，即在柱頭所能承受的花粉數(shù)量范圍內(nèi)，沉降在柱頭上的花粉數(shù)量越多，花粉的萌發(fā)和花粉管的伸長(zhǎng)速度越快，對(duì)受精越有利[4-7]。Dogterom等[8]研究顯示，沉積在柱頭上的花粉粒數(shù)與藍(lán)莓的種子數(shù)量呈正相關(guān)，當(dāng)用于授粉的花粉四分體數(shù)量達(dá)到125粒時(shí)，果實(shí)達(dá)到最大的坐果和最短的成熟時(shí)間，而更多的花粉數(shù)量有助于藍(lán)莓種子萌發(fā)，受精胚珠或發(fā)育中種子分泌的生長(zhǎng)素會(huì)刺激果實(shí)的膨大?；ǚ叟c柱頭細(xì)胞間的信號(hào)識(shí)別、傳遞是決定植物能否進(jìn)行受精作用的前提條件，依賴(lài)于許多基因的協(xié)同激活，以確保果實(shí)的發(fā)育，但前人對(duì)藍(lán)莓不同授粉強(qiáng)度的研究大多集中于授粉后期的種子數(shù)量、果實(shí)質(zhì)量等方面，而關(guān)于藍(lán)莓花粉在柱頭沉降后基因水平上發(fā)生的變化并不十分清楚。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-seq）是基于二代高通量測(cè)序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法，通過(guò)RNA-seq可以準(zhǔn)確測(cè)定特定基因的表達(dá)水平，以解決生物學(xué)上的相關(guān)問(wèn)題[9]。RNA-seq常用于分析差異基因表達(dá)（differential gene expression，DGE），被認(rèn)為是一種常規(guī)的研究工具。Feng等[10]基于RNA-Seq獲得了楊梅的海量序列數(shù)據(jù)，對(duì)成熟過(guò)程中與果實(shí)質(zhì)量相關(guān)的基因及其在不同組織的表達(dá)譜進(jìn)行了分析，共發(fā)現(xiàn)3 600個(gè)差異基因的表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究該果樹(shù)的功能基因組提供了平臺(tái)，同時(shí)也為研究非模式多年生植物的復(fù)雜代謝提供了參考依據(jù)。Deng等[11]利用Illumina HiSeqTM平臺(tái)對(duì)野生蕉果皮紫色和綠色部分的表皮細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq，篩選和鑒定出75個(gè)與花青素苷合成的相關(guān)基因，為后續(xù)功能基因驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。近年來(lái)，對(duì)藍(lán)莓轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的研究日益廣泛。Liu等[12]對(duì)藍(lán)莓果實(shí)的不同發(fā)育階段進(jìn)行了RNAseq，獲得了約40.54 GB 的clean reads 和109 480個(gè)unigenes，并對(duì)藍(lán)莓中與碳水化合物代謝和類(lèi)黃酮生物合成有關(guān)的基因進(jìn)行了分析，為這些基因的功能研究和相關(guān)質(zhì)量性狀的調(diào)控機(jī)理提供了依據(jù)。

授粉過(guò)程是植物進(jìn)行有性生殖的最初環(huán)節(jié)，也是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，它由許多基因協(xié)同激活來(lái)保證坐果和果實(shí)發(fā)育，因此尋找在授粉過(guò)程中起關(guān)鍵作用的基因?qū)μ岣咧参锸诜坌?、探明授粉增產(chǎn)機(jī)理、獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)果實(shí)等具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。Boavida等[13]通過(guò)比較擬南芥授粉0.5、3.5、8.0 h后雌蕊的表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，在花粉與雌蕊相互作用的過(guò)程中有1 373 個(gè)基因表達(dá)存在差異，基因富集表明與代謝產(chǎn)物和激素等保證正常生理和代謝環(huán)境密切相關(guān)。徐曉輝[14]分析了授粉20 和 180 min 的玉米柱頭表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，差異基因主要參與細(xì)胞骨架重建、DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)降解等過(guò)程。但關(guān)于藍(lán)莓柱頭在不同授粉強(qiáng)度處理下的轉(zhuǎn)錄組分析尚未見(jiàn)報(bào)道。

因此，本研究以‘藍(lán)源（M7）’藍(lán)莓為研究對(duì)象，利用Illumina測(cè)序技術(shù)對(duì)經(jīng)過(guò)不同授粉強(qiáng)度處理的藍(lán)莓柱頭進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，將得到的unigenes與公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，再進(jìn)行GO（gene ontology）功能注釋、分類(lèi)及KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路分析，為探索藍(lán)莓柱頭對(duì)不同授粉強(qiáng)度的響應(yīng)機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)于2022年1月至2023年3月在北京市密云區(qū)密西路北京軍興廣達(dá)農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)銷(xiāo)專(zhuān)業(yè)合作社的溫室（40°23′43″N，116°47′30″E）進(jìn)行。溫室類(lèi)型為標(biāo)準(zhǔn)型塑膜日光溫室，坐北朝南，溫室北、東、西面為磚墻結(jié)構(gòu)，朝陽(yáng)面由拱形圓形鋼架及2層透明塑料薄膜組成，冬季在塑料薄膜外安裝保溫被。

1.2 試驗(yàn)材料

本研究使用的品種是‘藍(lán)源（M7）’藍(lán)莓，樹(shù)齡10年，其母本為南方高叢品種Misty，父本未知。該品種的酸比和糖酸比較高，可滴定酸含量低，綜合品質(zhì)優(yōu)良，是適合中北部地區(qū)和大棚栽培的藍(lán)莓品種。溫室內(nèi)種植行距為1.80 m，間距為1.00 m。

1.3 藍(lán)莓柱頭可授性測(cè)定

采用聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫溶液法[15]測(cè)定柱頭可授性。選取長(zhǎng)勢(shì)一致的藍(lán)莓植株，在藍(lán)莓開(kāi)花前（0 d）套袋140朵，從開(kāi)花0 d到開(kāi)花6 d每隔24 h收集藍(lán)莓花20朵，用鑷子取下柱頭，在聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫溶液中浸入藍(lán)莓柱頭，觀察并記錄氣泡生成情況，通過(guò)氣泡涌出前時(shí)間、氣泡涌出速率和氣泡大小，評(píng)估藍(lán)莓柱頭的可授性。將柱頭的授粉能力評(píng)級(jí)如下：“ –”表示無(wú)授粉能力；“+/–”表示授粉能力弱；“+”表示授粉能力一般；“++”表示著授粉能力較佳；“+++”表示授粉能力最佳。

1.4 人工授粉花粉懸液制備

試驗(yàn)開(kāi)始前人工收集熊蜂采集的藍(lán)莓花粉團(tuán)，高溫干燥箱70 ℃、12 h進(jìn)行滅活處理，采用體外萌發(fā)培養(yǎng)方式并顯微鏡檢測(cè)確認(rèn)其全部失活后備用。試驗(yàn)當(dāng)日收集熊蜂采集的花粉團(tuán)，將花粉團(tuán)置于4～0 ℃條件下備用，并于短時(shí)間內(nèi)使用完畢，以保持其活力。取試驗(yàn)當(dāng)日采集的花粉團(tuán)3粒，加入10%的蔗糖溶液配置成0.4 mL的花粉母液，稀釋為1×106 cell·mL-1 的具活花粉懸液。取滅活花粉團(tuán)3粒，加入10%的蔗糖溶液配置成0.4 mL的花粉母液，同樣稀釋為1×106 cell·mL-1的滅活花粉懸液。

將上述具活花粉母液和滅活花粉母液分別按照0∶1（F0）、1∶1（F50）和1∶0（F100）的比例配置成花粉懸液用于人工授粉。用直徑1 mm的描線毛筆蘸取花粉懸液授粉，經(jīng)測(cè)定，每次授粉平均在柱頭上沉降花粉粒為133.6粒。

1.5 人工授粉

選取開(kāi)花0 d的藍(lán)莓花進(jìn)行標(biāo)記，并用白色尼龍網(wǎng)袋（8目）套花以避免傳粉者授粉。在開(kāi)花第2天，取下尼龍網(wǎng)袋，用直徑1 mm的描線毛筆分別蘸取上述F0、F50、F100處理的花粉懸液，點(diǎn)涂于藍(lán)莓柱頭上，每個(gè)處理5次重復(fù)，以6朵花為1次重復(fù)，共授粉90朵花，用于柱頭轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

在20～25 ℃的設(shè)施環(huán)境條件下，授粉4.0 h后花粉管在柱頭中大量萌發(fā)[1617]。因此在授粉后4.5 h使用鑷子取下授粉柱頭，樣品采集后立即放入液氮中，后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 花粉懸液活力測(cè)定

取上述用于人工授粉的F0、F50、F100處理花粉懸液，通過(guò)2種方式測(cè)定其花粉活力。

① 氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenytetrazoliumchloride，TTC）染色法。取適量花粉于1.5mL 離心管中，加入200 μL 0.5% TTC 染液，37 ℃避光孵育20 min，隨后在顯微鏡下觀察染色程度。被染成紅色的花粉具有較強(qiáng)活性；淡紅色次之；未染色花粉則無(wú)活性。

②體外培養(yǎng)法（培養(yǎng)基萌發(fā)法）。配制蔗糖含量10%、硼酸0.01%、瓊脂1%的培養(yǎng)基，取適量花粉用10%的蔗糖溶液混勻，將花粉懸液注入凝固的培養(yǎng)基中，26 ℃培養(yǎng)5 h后，觀察花粉管萌發(fā)情況。如果花粉管長(zhǎng)度大于花粉直徑，則視作花粉粒萌發(fā)[18-20]。

1.7 不同授粉強(qiáng)度下柱頭轉(zhuǎn)錄差異

1.7.1 RNA提取 采用TRIzol法（Invitrogen，CA，USA）提取柱頭RNA，提取過(guò)程中，用RNase-freeDNase I （Takara，Kusatsu，Japan）處理。在1% 瓊脂糖凝膠上監(jiān)測(cè)RNA 降解和污染情況。采用Agilent 2100 生物分析儀（Agilentl Technologies，CA，USA）定量RNA，對(duì)RNA片段長(zhǎng)度進(jìn)行檢測(cè)。采用NanoDrop分光光度計(jì)（Thermo Scientific，DE，USA）檢測(cè)RNA純度，評(píng)估質(zhì)量和完整性。

1.7.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)分析 RNA 提取完成后，樣品由北京奧維森基因科技有限公司使用Illumina Novaseq 6000平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)（raw reads）含有少量低質(zhì)量數(shù)據(jù)，為了保證數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量及可靠性，過(guò)濾帶有測(cè)序接頭（adapter）的reads、N（不確定堿基）含量比例大于10%的reads以及低質(zhì)量堿基（Q≤20）含量大于50%的reads，獲得clean reads。分別使用Star 和Cufflinks 軟件完成比對(duì)和轉(zhuǎn)錄本拼接，然后利用FPKM（fragments per kilobase of exon modelper million mapped reads）量化基因的表達(dá)水平。使用DESeq R軟件包（1.10.1）進(jìn)行差異表達(dá)分析，使用Benjamini和Hochberg控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率，調(diào)整P 值，將Padjlt; 0.05 的基因定義為差異表達(dá)基因。使用基于Wallenius non-central非中心超幾何分布的GOseq R軟件進(jìn)行差異表達(dá)基因的GO富集分析，利用KOBAS軟件進(jìn)行差異表達(dá)基因在KEGG通路上的富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 柱頭可授性分析

由表1 可知，隨著花齡的不斷延長(zhǎng)，‘藍(lán)源M7’柱頭可授性表現(xiàn)為先升高后逐漸降低的趨勢(shì)。‘藍(lán)源M7’在開(kāi)花前就具備可授性，開(kāi)花1～2 d可授性較強(qiáng)，持續(xù)至4 d左右。由此表明，‘藍(lán)源（M7）’柱頭可授性在開(kāi)花2 d時(shí)最強(qiáng)，據(jù)此，選擇開(kāi)花第2天的藍(lán)莓花進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2 花粉懸液活力分析

人工授粉的花粉懸液經(jīng)TTC染色與體外培養(yǎng)后的結(jié)果如圖1所示。F0處理未被染色，不具備活力；F50處理約有47.1%的花粉被染色，花粉活力較高；F100處理約有92.3% 的花粉被染色，花粉活力最高。

將3個(gè)處理組的花粉懸液在26 ℃培養(yǎng)5 h后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)0處理的花粉管均不萌發(fā)；F50處理的花粉管萌發(fā)率約為41.6%；F100處理的花粉管萌發(fā)率約為96.8%。上述結(jié)果與TTC染色法所得結(jié)果基本一致，表明試驗(yàn)可行。

2.3 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

基于Illumina Novaseq 6000 測(cè)序平臺(tái)對(duì)3 個(gè)處理進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共測(cè)得264 425 618條原始序列，經(jīng)過(guò)質(zhì)控，得到256 715 064 條質(zhì)控序列。對(duì)DEGs進(jìn)行鑒定，共鑒定出4 325個(gè)DEGs，樣本的Q30 范圍為93.70%～94.59%。由此表明，測(cè)序結(jié)果可以覆蓋大部分表達(dá)基因，文庫(kù)構(gòu)建質(zhì)量較高，可進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.3.1 mRNA的差異表達(dá)分析 以Padjlt;0.05為閾值選擇DEGs，F(xiàn)100 和F50 處理間檢測(cè)到793 個(gè)DEGs，其中上調(diào)754個(gè)，下調(diào)39個(gè)；F50和F0處理間檢測(cè)到458個(gè)DEGs，其中上調(diào)411個(gè)，下調(diào)47個(gè)；F100和F0處理間檢測(cè)到4 237個(gè)DEGs，其中上調(diào)3 843個(gè)，下調(diào)394個(gè)。有143個(gè)基因在3個(gè)處理中均表達(dá)（圖2）。

2.3.2 GO功能注釋和富集分析 F50與F0處理相比，共202個(gè)DEGs得到注釋?zhuān)?其功能包括生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能3大類(lèi)。從排名前30位的統(tǒng)計(jì)結(jié)果（圖3）來(lái)看，在生物過(guò)程類(lèi)中，與碳水化合物代謝過(guò)程（carbohydrate metabolicprocess）相關(guān)的最多（23），其次碳水化合物分解代謝過(guò)程（carbohydrate catabolic process）（7），占比分別為11.4% 和3.5%；在分子功能類(lèi)中，與催化活性（catalytic activity）相關(guān)的最多（124），作用于糖基鍵（hydrolase activity，acting on glycosyl bonds）的水解酶活性次之（16），占比分別為61.4%和7.9%。

F100 與F0 處理相比，有1 850 個(gè)DEGs 被注釋到，其功能包括3大類(lèi)：生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能。從排名前30的統(tǒng)計(jì)結(jié)果（圖4）看，在生物過(guò)程類(lèi)中，28 個(gè)與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)（cell wallorganization）有關(guān)，28 個(gè)與外部封裝結(jié)構(gòu)組織（external encapsulating structure organization）有關(guān)，占比均為1.5%；在分子功能類(lèi)中，84個(gè)與作用于糖基鍵的水解酶活性（hydrolase activity，actingon glycosyl bonds）有關(guān)，76個(gè)與水解酶活性、水解O 糖基化合物（hydrolase activity，hydrolyzing Oglycosylcompounds）有關(guān)，76 個(gè)與酶調(diào)節(jié)劑活性（enzyme regulator activity）有關(guān)，占比分別為4.5%、4.1%和4.1%。

F100 與F50 處理相比，共注釋到316 個(gè)DEGs，其功能包括生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能3大類(lèi)。從排名前30的統(tǒng)計(jì)結(jié)果（圖5）看，在生物過(guò)程類(lèi)中，13個(gè)與細(xì)胞碳水化合物代謝過(guò)程（cellular carbohydrate metabolic process）有關(guān)，12個(gè)與有機(jī)羥基化合物代謝過(guò)程（organic hydroxycompound metabolic process）有關(guān)，12個(gè)與碳水化合物分解代謝過(guò)程（carbohydrate catabolicprocess）有關(guān)，占比分別為4.1%、3.8%和3.8%；在分子功能類(lèi)中，有8個(gè)與肌醇加氧酶活性（inositoloxygenase activity）有關(guān)，有3個(gè)與乙酰乳酸脫羧酶活性（acetolactate decarboxylase activity）有關(guān)，有3個(gè)與甲狀腺素5-脫碘酶活性（thyroxine 5-deiodinaseactivity）有關(guān)，占比分別為2.5%、0.9%和0.9%。

2.3.3 KEGG代謝通路和富集分析 對(duì)兩兩處理間的DEGs進(jìn)行KEGG通路富集分析，其中F50和F0處理間的DEGs富集到60條KEGG通路，如表2所示。Padjlt;0.05的通路有1條，為戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化（pentose and glucuronate interconversions），其P值最小，表明富集程度較高。

F100 和F0 處理間的DEGs 富集到115 條KEGG通路，進(jìn)一步對(duì)Padjlt;0.05的結(jié)果（表3）統(tǒng)計(jì)表明，涉及代謝途徑（metabolic pathways）最多，為454個(gè)，其中404個(gè)基因上調(diào)表達(dá)；其次是戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化（61個(gè)）和植物?病原體互作（plant-pathogen interaction）（55 個(gè)），其中52 個(gè)基因上調(diào)表達(dá)。富集通路中，戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化的Padj值最小，表明富集程度較高。

F100 和F50 處理間的DEGs 富集到55 條KEGG通路，進(jìn)一步對(duì)Padjlt;0.05的結(jié)果統(tǒng)計(jì)（表4）表明，涉及代謝途徑（metabolic pathways）的DEGs最多，為68個(gè)，其中67個(gè)基因上調(diào)表達(dá)；其次是植物病原體互作，為15個(gè)，其中13個(gè)基因上調(diào)表達(dá)。在富集通路中，肌醇膦酸代謝通路（inositolphosphate metabolism）的Padj 值最小，表明富集程度較高。

綜上所述，肌醇膦酸代謝、植物?病原體互作、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化等通路在3個(gè)處理均有差異基因富集，且隨著授粉強(qiáng)度的增加DEGs中多數(shù)為上調(diào)表達(dá)。其中，參與花粉管生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的鈣依賴(lài)蛋白激酶17（Cpk17）、涉及肌醇含量的肌醇加氧酶（MIOX1）、參與果膠分解代謝過(guò)程的果膠甲基酯酶抑制劑（AT5G49180）等的基因表達(dá)量均隨著授粉強(qiáng)度的增加顯著提高。由此推測(cè)，授粉強(qiáng)度的增加會(huì)影響植物體內(nèi)的內(nèi)肌醇含量，進(jìn)而對(duì)花粉管生長(zhǎng)起調(diào)控作用。

2.3.4 差異基因在不同授粉強(qiáng)度下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平 從差異基因富集程度較高的肌醇膦酸代謝通路、植物?病原體互作、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化等通路中選取5個(gè)基因，比較在不同組間的表達(dá)水平，結(jié)果（圖6）表明，表達(dá)量隨授粉強(qiáng)度的增加而升高。

3 討論

本研究通過(guò)不同授粉強(qiáng)度處理下藍(lán)莓柱頭的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，柱頭對(duì)授粉強(qiáng)度增加的響應(yīng)基因顯著富集于肌醇膦酸代謝通路、植物?病原體互作等通路，除此之外，色氨酸代謝、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化等通路的富集程度也較高，且在不同處理中表現(xiàn)出顯著差異。

研究表明，花粉和柱頭的識(shí)別機(jī)制類(lèi)似于植物體區(qū)分損傷和外來(lái)病原體入侵的機(jī)制[21]，且有研究者推測(cè)植物自交不親和是由病原防御進(jìn)化而來(lái)[17]。藍(lán)莓存在自交不親和現(xiàn)象，因此柱頭和花粉間的識(shí)別至關(guān)重要。KEGG 富集分析結(jié)果表明，隨著授粉強(qiáng)度的增加，環(huán)境適應(yīng)分類(lèi)中的植物-病原體互作通路上富集的DEGs 較多，其中LOC103636213、PC1 等涉及Ca2+結(jié)合的基因隨授粉強(qiáng)度的增加顯著上調(diào)，這與前人的研究結(jié)果相似[2224]。研究表明，植物?病原互作通路在龍葵、番茄、梨等作物的柱頭識(shí)別花粉的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[22， 25-27]，由此推測(cè)授粉強(qiáng)度的增加可直接或者間接影響柱頭對(duì)花粉的識(shí)別過(guò)程。

花粉與柱頭的相互作用是植物完成授粉與受精過(guò)程的首要步驟，當(dāng)花粉到達(dá)雌蕊的柱頭時(shí)，首先進(jìn)行花粉與柱頭的識(shí)別，隨后花粉管導(dǎo)向生長(zhǎng)，進(jìn)而完成授粉受精過(guò)程。能夠完成受精作用的關(guān)鍵要素之一是信號(hào)能否被有效轉(zhuǎn)導(dǎo)[28]。Ca2+作為植物進(jìn)行各項(xiàng)生物過(guò)程中的關(guān)鍵信號(hào)分子，能夠與調(diào)控花粉管生長(zhǎng)的其他信號(hào)系統(tǒng)共同參與花粉管定向生長(zhǎng)，啟動(dòng)花粉正常萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)[29-31]。花粉管頂端Ca2+梯度的形成和保持一般認(rèn)為來(lái)自于兩方面：一是胞外Ca2+內(nèi)流；二是胞內(nèi)Ca2+庫(kù)的調(diào)控。胞內(nèi)Ca2+庫(kù)中的Ca2+主要由三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）信號(hào)系統(tǒng)調(diào)節(jié)釋放，IP3作為重要的二級(jí)信使被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，誘導(dǎo)內(nèi)源Ca2+的釋放，進(jìn)而調(diào)節(jié)Ca2+水平，對(duì)花粉管的導(dǎo)向生長(zhǎng)起著重要作用[32-34]。本研究基于KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，隨著授粉強(qiáng)度的增加，肌醇膦酸代謝通路的富集程度較高，其中F100和F50處理間的DEGs有14個(gè)富集到該通路；F100和F0處理間有29個(gè)富集到該通路；F50和F0處理間有5 個(gè)富集到該通路。其中肌醇加氧酶基因（MIOX1）在不同處理間的表達(dá)量存在顯著差異，且隨著授粉強(qiáng)度的增加表達(dá)量顯著提高。磷酸肌醇是生物體內(nèi)一類(lèi)重要的信使分子，花粉管生長(zhǎng)過(guò)程中受到多種磷酸肌醇信號(hào)的調(diào)控，這些信號(hào)與Ca2+等信號(hào)分子共同作用，通過(guò)改變花粉內(nèi)的囊泡運(yùn)輸、調(diào)控微絲骨架排布及胞質(zhì)環(huán)流，進(jìn)而影響花粉管生長(zhǎng)[35-37]。隨著授粉強(qiáng)度的增加，MIOX1基因在藍(lán)莓柱頭中上調(diào)表達(dá)，肌醇含量受肌醇加氧酶調(diào)控[38]，而肌醇是IP3 的前體物質(zhì)。因此，MIOX1 基因上調(diào)表達(dá)可能是受精信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的先決條件。

在細(xì)胞壁的生物合成中，肌醇加氧酶具有重要作用[39]。植物細(xì)胞壁是由纖維素、半纖維素、果膠及少量結(jié)構(gòu)蛋白等組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與植物生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)[40]。植物細(xì)胞形態(tài)是由細(xì)胞壁的形成空間來(lái)定義的，花粉管的生長(zhǎng)限定在頂端部位，在花粉管生長(zhǎng)過(guò)程中，頂端細(xì)胞壁不斷更新，花粉管細(xì)胞壁的更新對(duì)花粉管生長(zhǎng)十分重要。高爾基體分泌含細(xì)胞壁前體物質(zhì)的囊泡，通過(guò)將細(xì)胞壁組分以及相關(guān)信號(hào)分子內(nèi)化，形成新的細(xì)胞壁，進(jìn)而協(xié)調(diào)花粉管生長(zhǎng)[4142]。MIOX1 是肌醇分解代謝途徑的關(guān)鍵酶，肌醇通過(guò)MIOX1 氧合裂解轉(zhuǎn)化為游離的D-葡萄糖醛酸（D-glucuronic acid，D-GlcA），隨后生成不同的代謝物參與植物細(xì)胞壁合成[39]。由此推測(cè)，MIOX1 參與細(xì)胞壁多糖生物合成，其上調(diào)表達(dá)有助于花粉管快速生長(zhǎng)，從而完成受精作用。同時(shí)，KEGG分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化途徑顯著富集，且主要集中于果膠的降解?；ǚ哿Ｍ鈱泳哂刑厥獾募?xì)胞壁組織（花粉壁），主要成分為纖維素、果膠和結(jié)構(gòu)蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，參與果膠降解的基因如VDG1 和PPM1 對(duì)花粉管生長(zhǎng)至關(guān)重要[43]。進(jìn)一步對(duì)富集到的DEGs分析發(fā)現(xiàn)，果膠裂解酶家族蛋白基因的表達(dá)顯著上調(diào)，有助于花粉發(fā)育[4445]，其上調(diào)表達(dá)可能與細(xì)胞壁形成的生物學(xué)功能是一致的。

隨著授粉強(qiáng)度的增大，柱頭內(nèi)包括TAR2、TAA1、CYP79B2 在內(nèi)的基因顯著上調(diào)，它們與生長(zhǎng)素合成密切相關(guān)。TAA1 參與生長(zhǎng)素前體吲哚-3- 丙酮酸（indole-3-pyruvic acid，IPA）的生成[46]；TAR2 和CYP79B2 基因參與色氨酸代謝，在生長(zhǎng)素的生物合成中發(fā)揮作用[4748]。本研究結(jié)果表明，TAR2、TAA1、CYP79B2 顯著富集到色氨酸代謝通路。色氨酸是植物合成生長(zhǎng)素的前體物質(zhì)，雖然植物體內(nèi)內(nèi)源激素含量很少，但其作用廣泛，生長(zhǎng)素作為一種重要的植物激素，能調(diào)節(jié)花粉萌發(fā)和花粉管伸長(zhǎng)[4950]。因此推測(cè)，授粉強(qiáng)度的增大可能會(huì)影響植物生長(zhǎng)素的生物合成，進(jìn)而影響受精過(guò)程。

綜上，授粉強(qiáng)度的增加可能對(duì)柱頭和花粉的識(shí)別過(guò)程產(chǎn)生影響，通過(guò)參與柱頭和花粉間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、激素合成等過(guò)程對(duì)花粉管生長(zhǎng)起促進(jìn)作用，這將是今后研究的重點(diǎn)。