摘 要：【目的】鋅指蛋白（ZFP，Zinc Finger Proteins）是植物中的一類重要的轉錄調控因子，在植物生長發(fā)育、逆境脅迫應答等方面具有重要的作用。通過分析剛毛檉柳Tamarix hispida鋅指蛋白基因ThZFP3的耐鹽、抗旱功能，為林木抗逆遺傳改良提供了理論基礎。【方法】在通過蘸花法獲得過表達ThZFP3轉基因擬南芥；在NaCl和Mannitol（甘露醇）脅迫下，觀察轉基因和對照擬南芥的萌芽成活率、根長、鮮質量和表型變化；在利用農(nóng)桿菌瞬時轉化體系獲得瞬時過表達（OE）、抑制表達（RNAi）和對照（Control）轉基因剛毛檉柳，脅迫下分別對三種轉基因檉柳進行組織化學染色和抗逆相關生理指標測定，鑒定ThZFP3基因的抗旱、耐鹽能力?！窘Y果】在脅迫條件下，轉基因擬南芥的萌芽成活率、根長、鮮質量和長勢均優(yōu)于野生型，表明ThZFP3基因可提高轉基因擬南芥的抗旱耐鹽能力；過表達ThZFP3基因顯著增強了剛毛檉柳中POD和SOD的活性，從而減少活性氧（ROS）的積累；過表達ThZFP3基因可以減少剛毛檉柳中MDA的積累、降低電解質滲透率，保護細胞膜的完整?！窘Y論】過表達ThZFP3基因可以提高剛毛檉柳體內ROS清除能力，降低細胞損傷程度，從而提高剛毛檉柳的抗旱耐鹽能力。

關鍵詞：剛毛檉柳；CCCH型鋅指蛋白；耐鹽；抗旱

中圖分類號：S718.43 文獻標志碼：A 文章編號：1673-923X（2024）08-0139-11

基金項目：國家自然科學基金項目（31870665）；黑龍江省自然科學基金項目（LH2021C013）。

Salt tolerance and drought resistance function of ThZFP3 gene in Tamarix hispida

HAN Gang， JIA Yuanyuan， ZHU Zhenyu， ZHAO Xin， NIU Yi， WANG Xiaodong， CUI Tianxiang， WANG Chao

（College of Forestry， Northeast Forestry University， State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding， Harbin 150040， Heilongjiang， China）

Abstract：【Objective】Zinc finger proteins are a major class of important transcription regulatory factors in plants， playing important roles in plant growth and development， and stress response. The salt tolerance and drought resistance function of ThZFP3 of Tamarix hispida zinc finger protein gene was analyzed to provide a theoretical basis for genetic improvement of tree resistance.【Method】Arabidopsis thaliana was transformed with ThZFP3 using the floral dip method. The germination survival rate， root length， fresh mass， and phenotypic changes of the transgenic and control A. thaliana were observed under NaCl and mannitol stress. Transient overexpression（OE）， inhibited expression （RNAi） and control transgenic Tamarix were obtained using the Agrobacterium transient transformation system. Three transgenic Tamarix plants were histochemically stained and stress-related physiological indexes were measured to identify the drought resistance and salt tolerance of the ThZFP3 gene.【Result】Under stress conditions， the germination survival rate， root length， fresh mass， and growth vigor of transgenic Arabidopsis were superior to wild-type strains， indicating that the ThZFP3 gene improved the drought and salt tolerance of transgenic Arabidopsis. Overexpression of the ThZFP3 gene significantly enhanced the activities of POD and SOD in T. hispida， thereby reducing the accumulation of reactive oxygen species （ROS）； Overexpression of the ThZFP3 gene reduced the accumulation of MDA and electrolyte permeability in T. hispida， protecting the integrity of cell membranes.【Conclusion】Overexpression of the ThZFP3 gene can improve the ROS scavenging ability within the body of T. hispida， reduce the degree of cell damage， and thus improve its drought resistance and salt tolerance.

Keywords： Tamarix hispida； CCCH zinc finger protein； salt tolerance； drought resistance

植物在生長過程中會受到干旱、鹽堿等多種非生物逆境脅迫的影響[1-2]。在長期進化過程中，植物已經(jīng)形成了有效的保護機制，大量抗逆基因構成精密的分子調控網(wǎng)絡，共同參與調節(jié)植物的抗逆性。轉錄因子作為主要的調控因子，通過調節(jié)下游基因的表達來調節(jié)植物的抗逆反應，從而使植物感知并適應逆境脅迫。目前，一些轉錄因子，如AP2/EREBP、bZIP、MYB、NAC、bHLH等，已經(jīng)被證實在植物逆境脅迫應答過程中發(fā)揮重要作用[3]。因此，挖掘并鑒定抗逆相關的轉錄因子，對于利用基因工程進行植物抗逆遺傳改良具有重要意義。

鋅指蛋白是包含鋅指結構域的一類轉錄因子。鋅指結構域的特征是肽鏈中氨基酸殘基通過結合Zn2+后自我折疊形成的穩(wěn)定的、短的“手指狀”空間結構。鋅指蛋白通常由一系列鋅指結構組成，具有重復結構的氨基酸模式，相隔特定距離的胱氨酸結合鋅指，能與某些DNA、RNA、DNARNA結合，以及與自身或其他鋅指蛋白結合[4]。由于其自身的結構特點，可以選擇性地結合特異的靶結構，在轉錄和翻譯水平上調控基因的表達，在植物細胞分化、胚胎發(fā)育、應激響應等生命過程中發(fā)揮重要作用[4]。鋅指蛋白家族成員數(shù)量龐大，根據(jù)ZFP結構中半胱氨酸（Cys）和組氨酸（His）殘基的序列和數(shù)量，ZFP轉錄因子分為九個亞家族，即C2H2、C2HC、C2HC5、C3H、C3HC4、C4HC3、Cys4、C6和C8[5]。不同種屬間鋅指蛋白在鋅指結構數(shù)量和分布上存在很大差異，這也預示著鋅指蛋白轉錄因子在功能上的多樣性和調控機制上的復雜性。

大量研究表明，多種鋅指蛋白可以被高鹽、干旱、低溫以及病原菌等逆境脅迫誘導，參與植物的生物和非生物抗逆脅迫過程[6]。Sun等[7]通過水稻微陣列分析確定了一個含有兩個典型的C2H2鋅指結構域的鋅指蛋白基因（ZFP179），該基因被高鹽、干旱等脅迫誘導，說明ZFP179基因參與了植物逆境脅迫的響應過程。與非轉基因水稻相比，過表達水稻C2H2鋅指蛋白基因OsCTZFP8的轉基因植株表現(xiàn)出耐低溫表型[8]。擬南芥C2H2型鋅指蛋白AtZAT6通過直接結合防御相關基因（EDS1、PAD4、PR1、PR2和PR5）的啟動子區(qū)域中的TACAAT基序，正調控擬南芥對丁香假單胞桿菌Pseudomonas syringae的抗性[9]。以上研究表明，鋅指蛋白在植物應答環(huán)境脅迫的過程中發(fā)揮了重要的調控作用。目前，對植物鋅指蛋白的研究主要集中在C2H2型，其他類型的鋅指蛋白受到的關注相對較少，而在木本植物中相關信息更是十分有限。

剛毛檉柳Tamarix.hispida是一種鹽生木本植物，可在荒漠、鹽堿地上生長，是優(yōu)良的防風固沙植物[10]。剛毛檉柳具有極強的抗逆能力，其體內蘊藏著大量的抗逆基因資源，是分離抗旱、耐鹽基因的理想物種。在前期研究中，本課題組從剛毛檉柳中鑒定了一條響應鹽和干旱脅迫的CCCH型鋅指蛋白基因ThZFP3[11]。為了進一步明確ThZFP3的生物學功能，本研究將該基因轉入擬南芥和剛毛檉柳中，通過比較轉基因植株和對照植株在鹽和干旱脅迫下的表型及生理指標的差異，探究ThZFP3基因在剛毛檉柳抗旱、耐鹽過程中的作用及其參與的生理調節(jié)途徑。本研究為林木抗逆分子育種提供了理論依據(jù)和有效的基因資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料

野生型擬南芥和剛毛檉柳組培苗取自東北林業(yè)大學林木遺傳育種全國重點實驗室，在人工氣候室內（溫度22±2 ℃，光照時間16 h/d，光照強度400 μmol·m-2·s-1，相對濕度（65%～75%）培養(yǎng)。

1.2 植物表達載體與菌株

植物過表達載體pROKⅡ、植物抑制表達載體pFGC5941、大腸桿菌感受態(tài)DH5α和根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105保存于東北林業(yè)大學林木遺傳育種全國重點實驗室。

1.3 檉柳ThZFP3基因植物表達載體的構建

根據(jù)植物過表達載體pROKⅡ和目的基因ThZFP3的融合特性引入了限制性內切酶SmaⅠ位點，設計引物pROKⅡ-ThZFP3-F和pROKⅡ-ThZFP3-R（表1），以pMD18-T-ThZFP3為模板進行PCR擴增ThZFP3基因，將目的基因連接到經(jīng)SmaⅠ酶切后的pROKⅡ載體上，轉化大腸桿菌，對陽性克隆進行測序鑒定。將測序成功的質粒命名為pROKⅡ-ThZFP3，并利用電擊法轉化至根癌農(nóng)桿菌EHA105中備用。

根據(jù)植物抑制表達載體pFGC5941和目的基因ThZFP3的融合特性分別設計引物pFGC5941-Cis-ThZFP3-F和pFGC5941-Cis-ThZFP3-R（表1），選擇AscⅠ作為酶切位點，用上述方法將ThZFP3正義鏈基因片段連接到pFGC5941載體上，對陽性克隆進行測序鑒定。將測序成功的質粒命名為pFGC5941-Cis-ThZFP3。設計引物pFGC5941-AntiThZFP3-F和pFGC5941-Anti-ThZFP3-R（表1），選擇XbaⅠ作為酶切位點，用上述方法將ThZFP3反義鏈基因片段連接到pFGC5941-ThZFP3-Cis載體上，對陽性克隆進行測序鑒定。將測序成功的質粒命名為pFGC5941-ThZFP3，并利用電擊法轉化至根癌農(nóng)桿菌EHA105中備用。

1.4 ThZFP3轉基因擬南芥的獲得

當擬南芥大量開花時用蘸花法侵染盛花期的擬南芥植株，約1個月時收集種子（即為T0代種子）。將種子消毒后在含50 mg/L卡那霉素的抗性培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周左右，篩選能夠發(fā)芽長出真葉并正常生長的陽性轉基因幼苗，記為T1代。將T1代擬南芥在人工土壤中培養(yǎng)4周左右，對T1代各轉基因擬南芥株系提取DNA進行驗證，選取鑒定成功的陽性植株并繼續(xù)進行T2和T3代轉基因擬南芥的培養(yǎng)與篩選，收取T3代純合種子用于后續(xù)試驗。

1.5 ThZFP3轉基因擬南芥的脅迫處理

首先對野生型和T3代純合擬南芥種子進行消毒處理，隨后在1/2MS固體培養(yǎng)基上播種培養(yǎng)。為了明確擬南芥種子在不同處理條件下的萌芽成活率，分別在含100 mmol/L NaCl及含150 mmol/L Mannitol的抗性培養(yǎng)基上播種培養(yǎng)，每次試驗大約用90粒種子，第6天統(tǒng)計擬南芥在不同處理條件下的萌芽成活率。為了進一步對擬南芥各轉基因株系進行觀察，將在1/2 MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d左右且長勢相同的各株系的幼苗分別轉移到上述抗性培養(yǎng)基和人工土壤中豎直培養(yǎng)，7 d后對抗性培養(yǎng)基中各株系在不同處理條件下的根長和鮮質量進行統(tǒng)計。4周左右分別對人工土壤中的擬南芥土培苗進行250 mmol/L NaCl和350 mmol/L Mannitol脅迫處理，并以清水處理作為對照，第7天觀察處理后的不同株系的脅迫表型并拍照。

1.6 ThZFP3瞬時表達剛毛檉柳的獲得

為了研究ThZFP3基因在瞬時表達剛毛檉柳中的表達情況，取EHA105-pROKⅡ-ThZFP3（OE）、EHA105-pFGC5941-ThZFP3（RNAi）和陽性對照EHA105-pROKⅡ（Control）菌種瞬時侵染4周左右、大小和生長狀態(tài)一致的剛毛檉柳組培苗，用CTAB法分別在0、12、24、48、72 h對侵染后的過表達（OE）、抑制表達（RNAi）和對照（Control）瞬時轉化植株提取總RNA（每個株系植株不少于3株），并用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA。設計ThZFP3基因定量引物RTThZFP3-F和RT-ThZFP3-R（表1），選取剛毛檉柳Actin（GenBank登錄號：FJ618517）和β-tubulin（GenBank登錄號：FJ618519）為內參基因[12]，引物序列見表1。將cDNA稀釋十倍作為模板，進行實時熒光定量RT-PCR，每個樣品重復3次，用2-ΔΔCT方法進行基因的相對定量分析[13]。

1.7 非生物脅迫下ThZFP3瞬時表達剛毛檉柳的組織化學染色

根據(jù)實時熒光定量RT-PCR的分析結果，在含150 mmol/L NaCl及200 mmol/L Mannitol的抗性培養(yǎng)基上對瞬時浸染后共培養(yǎng)24 h的剛毛檉柳脅迫處理0、1和2 h，以1/2 MS固體培養(yǎng)基上的剛毛檉柳作為對照處理。用蒸餾水將處理后的剛毛檉柳洗涮干凈，各處理各時間點各株系各取3棵剛毛檉柳分別放入含100 mL DAB、NBT和Evans blue化學染色液的200 mL錐形瓶中，25 ℃過夜染色。用75%乙醇加醋酸進行過夜脫色、拍照[14]。

1.8 非生物脅迫下ThZFP3瞬時表達剛毛檉柳的生理生化指標測定

根據(jù)實時熒光定量RT-PCR的分析結果，在含150 mmol/L NaCl及200 mmol/L Mannitol的抗性培養(yǎng)基上對瞬時侵染后共培養(yǎng)24 h的剛毛檉柳脅迫處理48 h，以1/2 MS固體培養(yǎng)基上的剛毛檉柳作為對照處理。對處理后的剛毛檉柳的生理生化指標如：過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量及電解質滲透率進行測定[14]。

2 結果與分析

2.1 植物表達載體構建及農(nóng)桿菌轉化

將重組質粒pROKⅡ-ThZFP3和pFGC5941-ThZFP3轉入根癌農(nóng)桿菌EHA105。選取陽性克隆，分別用載體引物進行PCR驗證，電泳條帶長度與預期長度一致（圖1）。提取陽性克隆質粒進行測序，經(jīng)比對，測序結果與ThZFP3基因序列相同，說明過表達載體pROKⅡ-ThZFP3和抑制表達載體pFGC5941-ThZFP3構建成功。

2.2 ThZFP3轉基因擬南芥的抗逆能力分析

2.2.1 過表達ThZFP3轉基因擬南芥的獲得

用蘸花法將植物過表達載體EHA105-pROKⅡ-ThZFP3轉化至野生型擬南芥，即為T0代擬南芥，收取種子。隨后在含卡那霉素的1/2MS固體培養(yǎng)基上篩選T1代陽性植株（圖2）。選取鑒定成功的陽性植株（OE3和OE15）繼續(xù)培養(yǎng)到T3代，收取T3代種子用于后續(xù)試驗。

2.2.2 鹽和干旱脅迫下轉基因擬南芥的種子萌芽成活率

在1/2MS培養(yǎng)基上，轉基因擬南芥（OE3和 OE15）與野生型擬南芥（WT）種子的萌芽成活率基本相同。在含有NaCl和Mannitol的1/2 MS固體培養(yǎng)基上，轉基因和野生型擬南芥種子都能夠萌發(fā)。但野生型種子萌發(fā)后子葉變黃，逐漸死亡，而轉基因擬南芥OE3和OE15兩個株系的種子萌芽成活率較高，明顯高于WT（圖3），表明ThZFP3基因提高了轉基因擬南芥種子在鹽和干旱脅迫下的萌芽成活能力。

2.2.3 鹽和干旱脅迫下轉基因擬南芥的生長表型

在正常生長條件下，野生型和轉基因擬南芥種子的根長、鮮質量以及植株長勢均無顯著區(qū)別。在NaCl和Mannitol脅迫下，轉基因株系OE3和OE15兩個株系的植株長勢、根長及鮮質量明顯強于WT（圖4）。研究結果表明，過表達ThZFP3基因提高了轉基因擬南芥對鹽和干旱脅迫的耐受性。

2.3 ThZFP3在剛毛檉柳中的抗逆生理功能分析

2.3.1 瞬時表達ThZFP3轉基因剛毛檉柳的獲得

為了進一步研究ThZFP3基因在剛毛檉柳中的抗逆功能，利用瞬時轉化技術將pROKⅡ空載體、ThZFP3基因過表達載體和抑制表達載體轉入剛毛檉柳中，并以轉空pROKⅡ載體的剛毛檉柳植株作為對照。利用實時熒光定量RT-PCR技術檢測過表達（OE）、抑制表達（RNAi）和對照（Control）植株中ThZFP3基因的表達情況。相對于對照剛毛檉柳植株，ThZFP3在過表達植株中的相對表達量隨著瞬時轉化后時間的延長逐漸上升，在24 h達到最高；抑制表達植株中的相對表達量則隨時間的延長逐漸降低，在24 h時降至最低（圖5）。結果表明，ThZFP3基因在瞬時過表達植株中可實現(xiàn)過量表達，在抑制表達植株中成功被抑制，三種瞬時轉化剛毛檉柳植株可作為分析轉基因剛毛檉柳抗逆功能的材料。同時，在瞬時轉化后24 h，是進行抗逆功能分析的理想時間點，后續(xù)試驗中在瞬時轉化24 h后進行脅迫處理，抗逆生理指標測定。

2.3.2 鹽和干旱脅迫下轉基因剛毛檉柳ROS水平檢測

DAB、NBT染色能夠反映出剛毛檉柳體內的過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（O2·-）的含量，進而反映出植株體內ROS積累情況。在正常生長條件下，過表達、抑制表達和對照植株基本上沒有顏色差異，說明3種株系中的H2O2和O2·-含量幾乎相同，細胞內沒有過量積累ROS。但在鹽、干旱脅迫條件下，相比于對照植株，過表達植株上的顏色相對較淺，抑制表達植株上的顏色相對較深，且隨著脅迫時間的延長3種株系上的顏色逐漸變深（圖6）。結果表明，過表達ThZFP3基因降低了植株內的H2O2和O2·-含量。

進一步研究轉基因和對照剛毛檉柳在鹽、干旱脅迫下的過氧化物酶（POD）以及超氧化物歧化酶（SOD）活性。在正常生長條件下，過表達、抑制表達和對照株系的POD、SOD活性基本相同。在鹽、干旱脅迫下，3種轉基因株系的POD、SOD活性顯著提高，相比于對照植株，過表達植株的POD、SOD活性相對較高（圖6）。結果表明，過表達ThZFP3基因使剛毛檉柳體內POD、SOD活性增加，ROS清除能力增強，降低了剛毛檉柳由ROS過度積累所導致的氧化損傷。

2.3.3 鹽和干旱脅迫下轉基因剛毛檉柳的細胞膜受損程度分析

Evans blue染色、丙二醛（MDA）含量和電解質滲透率可以反映細胞膜受損傷情況進而反映植物遭受逆境傷害的程度。在正常生長條件下，3種轉基因株系染色區(qū)別較小，植株中的MDA含量及電解質滲透率基本相同。在鹽和干旱脅迫下，過表達植株上Evans blue染色的藍色斑點較對照植株上的藍色斑點少，且顏色較淺（圖7）；MDA含量及電解質滲透率明顯增加，且3種株系中的MDA含量及電解質滲透率差異較大，過表達植株的MDA含量及電解質滲透率明顯低于對照植株（圖7）。結果表明，過表達ThZFP3基因能夠降低逆境脅迫對細胞膜造成的損傷，從而增強剛毛檉柳耐鹽、抗旱能力。

3 討 論

鋅指蛋白是植物中一類重要的轉錄因子，不僅在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮作用，也參與調控植物對生物和非生物脅迫的應答過程。Wang等[15]研究了68個擬南芥CCCH型鋅指蛋白基因在多種環(huán)境刺激下的表達，其中11個IX亞家族基因能夠參與植物不同的逆境脅迫響應，如鹽、干旱、冷及ABA等。劉佳麗等[16]研究發(fā)現(xiàn)水稻中過表達OsZFP6的水稻轉基因植株在進行NaHCO3脅迫處理時表現(xiàn)更強耐受性，并且在株高、鮮質量生理指標上過表達OsZFP6植株高于野生型植株。Jan等[17]研究發(fā)現(xiàn)水稻基因OsTZF1的表達受高鹽和干旱脅迫的誘導，過表達OsTZF1能顯著地增強水稻對高鹽和干旱的耐性。這些研究結果表明，鋅指蛋白家族中部分成員在植物逆境脅迫應答過程中發(fā)揮了重要作用。剛毛檉柳是一種具有很強抗逆性的木本植物，已在其體內鑒定了多個具有抗逆功能的轉錄因子，如ThWRKY、ThbZIP、ThNAC、ThbHLH等[18-21]；但是，ZFP轉錄因子在剛毛檉柳脅迫應答中的功能及作用機制尚不明確。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，剛毛檉柳ThZFP3基因高度響應鹽和干旱脅迫，猜測其可能參與剛毛檉柳的抗逆過程。為了進一步解析ThZFP3基因的生物學功能，本研究成功構建了ThZFP3基因的過表達載體pROKⅡ-ThZFP3并轉入擬南芥植株中。在NaCl和Mannitol脅迫處理后，相比于野生型擬南芥，過表達植株的萌芽成活率、根長、鮮質量及長勢明顯提高，說明ThZFP3基因能增強轉基因擬南芥的耐鹽和抗旱能力。

逆境脅迫會導致植物體內活性氧（ROS）過度積累，造成組織的氧化損傷。因此，調節(jié)體內 ROS平衡對于維持植物在逆境下的正常生長至關重要?？寡趸傅拿复傧到y(tǒng)是生物體內清除活性氧的一條有效途徑。研究發(fā)現(xiàn)，非生物脅迫會誘導過量活性氧（ROS）的產(chǎn)生，植物通過激活酶促和非酶促清除劑，如SOD、POD和CAT等，以清除過量的ROS[22-25]。許多抗逆基因可以通過調節(jié)抗氧化酶活性來清除植物中過度積累的ROS，從而提高植物對逆境脅迫的適應性。過表達ThCBL4基因通過增加POD、SOD酶活性來增強轉基因剛毛檉柳細胞內活性氧清除能力，從而提高轉基因剛毛檉柳的耐鹽能力[26]。過表達ZmEREB20的擬南芥中抗氧化酶如SOD、CAT表現(xiàn)出了更高的活性，這有助于植物清除過量積累的ROS，從而減輕了鹽脅迫造成的損害[27]。在鹽脅迫下，過表達TaZFP1轉基因植株的POD、SOD等抗氧化酶活性增加，ROS水平降低，表明轉基因植株通過調節(jié)細胞ROS穩(wěn)態(tài)來提高植物的耐鹽性[28]。本研究利用DAB、NBT染色分析了逆境脅迫下瞬時表達剛毛檉柳體內的ROS水平。鹽、干旱脅迫下，相較于對照植株和抑制表達植株，過表達植株內的H2O2含量和O2·-含量相對最低，而POD和SOD活性相對最高，說明過表達ThZFP3可以促進剛毛檉柳體內抗氧化酶活性，降低ROS的積累，提高剛毛檉柳對鹽、干旱脅迫的耐受性。

MDA是膜脂過氧化分解的終產(chǎn)物之一，其含量能夠反映細胞膜脂過氧化的程度。例如在鹽脅迫下，過表達GmMYB84的轉基因大豆Glycine max耐鹽能力更強，轉基因植株MDA含量顯著低于野生型，表明對細胞膜的損傷程度較低[29]。Cui等[30]研究發(fā)現(xiàn)，過表達番茄MYB49基因的擬南芥株系與野生型擬南芥相比MDA含量較低，MYB49基因通過抑制細胞膜損傷增強植株對干旱和鹽的耐受性。同樣，細胞膜損傷后，細胞膜透性會發(fā)生改變，大量電解質滲出導致電解質滲透率發(fā)生變化。例如過表達BpGRAS1基因可以降低白樺在鹽脅迫下的電解質滲透率，說明BpGRAS1基因能夠保護細胞膜，避免膜損傷[31]。過表達BpHSFA4株系細胞膜受損程度低、電解質外滲少，細胞膜結構的完整性較高[32]。因此，MDA含量和電解質滲透率可以作為細胞膜損傷程度的衡量指標，也間接反映出植物在脅迫下的抗逆能力。本研究通過過表達剛毛檉柳ThZFP3基因發(fā)現(xiàn)剛毛檉柳體內MDA含量、電解質滲透率和Evans blue染色強度顯著降低，說明過表達ThZFP3基因降低了逆境脅迫對剛毛檉柳細胞膜的損傷，增加了剛毛檉柳的抗旱耐鹽能力。以上研究表明，鋅指蛋白能夠通過提高ROS清除能力以及減少膜脂損傷程度來提高植物在非生物脅迫下的抗逆功能。

本研究通過異源轉化擬南芥和瞬時轉化檉柳，初步明確了ThZFP3基因的功能。然而，基因在異源表達和同源表達情況下，其功能可能會存在差異；另外，瞬時轉化與穩(wěn)定轉化相比，在基因功能研究中也存在一定的局限性。因此，后續(xù)研究中將ThZFP3基因穩(wěn)定轉化剛毛檉柳，進一步驗證ThZFP3的抗逆功能，并深入研究其調控檉柳耐鹽、抗旱的分子機制。

4 結 論

本研究將ThZFP3基因轉入擬南芥和剛毛檉柳中，對其耐鹽、抗旱功能進行了鑒定。過表達ThZFP3基因提高了轉基因擬南芥對鹽和干旱脅迫的耐受性。鹽和干旱脅迫下，ThZFP3基因能夠調節(jié)剛毛檉柳體內POD、SOD活性，增強ROS清除能力，降低細胞膜脂過氧化損傷，從而提高剛毛檉柳的耐鹽和抗旱能力。本研究為進一步解析檉柳ZFP的抗逆調控機制奠定了基礎，并為林木抗逆基因工程育種提供了候選基因。

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[本文編校：羅 列]