摘要：該研究以德昂酸茶為原料，以植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌為發(fā)酵菌種制備德昂酸茶乳酸菌發(fā)酵飲料，利用單因素試驗和Box-Behnken試驗設計優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，并檢測其理化指標和微生物指標。結(jié)果表明，德昂酸茶乳酸菌發(fā)酵飲料最佳發(fā)酵工藝條件為白砂糖添加量4%、植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌接種菌液體積比1∶2、菌種接種量2.5%、37℃發(fā)酵12 h。在此優(yōu)化發(fā)酵工藝條件下，德昂酸茶乳酸菌發(fā)酵飲料的感官評分為84.85分，pH值為4.01±0.01，總酸含量為（0.34±0.02）g/L，可溶性固形物含量為（4.00±0.01）%，總糖含量為（2.24±0.1）g/100 mL，茶多酚含量為（13.73±0.29）g/L，游離氨基酸含量為（36.30±0.13）mg/100 mL，微生物指標均符合國家標準GB 7101—2022《食品安全國家標準 飲料》的要求。

關鍵詞：德昂酸茶；發(fā)酵飲料；發(fā)酵工藝優(yōu)化；品質(zhì)分析

中圖分類號：TS275.2 文獻標志碼：A 文章編號：1000-9973（2025）01-0135-06

Process Optimization and Quality Analysis of Lactic Acid Bacteria Fermented Beverage with De'ang Sour Tea

ZHU Shao-xian¹， HOU Yan²， LIU Ya¹， LU Feng-mei³， YANG Wei-xing¹， LI Guo-you¹， XIAO Rong^1*

（1.College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China; 2.College of Tea Science， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China;3.Dehong Mangshi Defeng Tea Industry Co.， Ltd.， Dehong 678400， China）

Abstract： In this study， De'ang sour tea is used as the raw material and Lactobacillus plantarum and Lactobacillus acidophilus are used as the fermentation strains to prepare lactic acid bacteria fermented beverage with De'ang sour tea. Single factor test and Box-Behnken test design are used to optimize the fermentation process conditions， and the physicochemical and microbiological indexes are detected. The results show that the optimal fermentation process conditions of lactic acid bacteria fermented beverage with De'ang sour tea are white granulated sugar addition amount of 4%， Lactobacillus plantarum and Lactobacillus acidophilus inoculated bacterial solution volume ratio of 1∶2， inoculation amount of strains of 2.5%， fermented at 37℃ for 12 h. Under the optimized fermentation process conditions， the sensory score of lactic acid bacteria fermented beverage with De'ang sour tea is 84.85 points， pH value is 4.01±0.01， total acid content is （0.34±0.02） g/L， soluble solid content is （4.00±0.01）%， total sugar content is （2.24±0.1） g/100 mL， the content of tea polyphenols is （13.73±0.29） g/L， and the content of free amino acids is （36.30±0.13） mg/100 mL. The microbiological indexes are all in line with the requirements of the national standard GB 7101—2022 Food Safety National Standard for Beverage.

Key words： De'ang sour tea; fermented beverage; optimization of fermentation process; quality analysis

收稿日期：2024-06-18

基金項目：云南省科技重大專項（202002AA100005）；云南德鳳茶業(yè)有限公司合作項目（KX141721）

作者簡介：朱紹先（1997—），女，碩士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。

*通信作者：肖蓉（1965—），女，教授，研究方向：食品科學與安全。

進入大健康時代，植物發(fā)酵制品風靡全球^[1]，隨著微生物發(fā)酵技術的廣泛應用，乳酸菌發(fā)酵型飲料已成為飲料行業(yè)研究的熱點^[2]，如乳酸菌果蔬汁、乳酸菌奶茶、乳酸菌植物飲料等^[3]，但市場上乳酸菌發(fā)酵茶飲料種類較少。乳酸菌發(fā)酵茶飲料既能改善茶飲料的風味^[4]，又能通過微生物代謝增加許多生物活性成分^[5-6]。劉佳奇等^[4]以植物乳桿菌發(fā)酵紅茶浸提液，開發(fā)的紅茶飲料較發(fā)酵前品質(zhì)明顯提升。馮雪娜等^[7]以植物乳桿菌發(fā)酵紅茶茶湯，所得紅茶飲料酸甜可口，香氣怡人，營養(yǎng)成分豐富。鄧成林等^[8]以植物乳桿菌發(fā)酵綠茶浸提液，得到一款風味和口感穩(wěn)定的綠茶發(fā)酵飲料。目前相關研究較多以紅茶和綠茶為基質(zhì)，而針對其他茶類的研究較少。

德昂酸茶是我國云南少數(shù)民族德昂族、布朗族的一種傳統(tǒng)發(fā)酵茶，當?shù)厝朔Q之為“濕茶”或“沽茶”^[9]，味微酸而清香，口感清涼且回甜，故得名酸茶^[10]。德昂酸茶富含119種揮發(fā)性物質(zhì)和1 130種非揮發(fā)性物質(zhì)^[11]，具有提神醒腦、開胃消食^[12-13]、抗肥胖^[14]和防治非酒精性脂肪肝的作用^[14]。酸茶作為一種特殊的民族發(fā)酵食品，其制作技藝已被列入聯(lián)合國教科文組織人類非物質(zhì)文化遺產(chǎn)代表作名錄，逐漸成為研究的熱點。目前，針對酸茶的研究主要集中在品質(zhì)、微生物菌群和功效等方面，鮮見對德昂酸茶加工制品的報道。

本研究以德昂酸茶為原料，以植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌為發(fā)酵菌種，制備德昂酸茶乳酸菌發(fā)酵飲料，對其進行感官評價，并測定其理化指標和微生物指標，以期為德昂酸茶產(chǎn)品的開發(fā)利用提供新思路，為德昂酸茶飲料規(guī)?；a(chǎn)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

德昂酸茶：云南德鳳茶廠；白砂糖：市售；植物乳桿菌（LP）和嗜酸乳桿菌（LA）：云南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院；酒石酸鉀鈉、硫酸亞鐵、茚三酮等（均為分析純）：西隴科學股份有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2F標準型凈化工作臺 中國檢測儀器商城；LRH-250智能生化培養(yǎng)箱 上海瀚宇生物科技有限公司；pH計 梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 德昂酸茶乳酸菌發(fā)酵飲料工藝流程和操作要點

1.3.1.1 工藝流程

酸茶→粉碎→酸茶粉→浸提→抽濾→茶湯→加糖→灌裝→滅菌→冷卻→接種發(fā)酵→成品→4℃冷藏。

1.3.1.2 操作要點

粉碎：將酸茶粉碎后過30目篩。

浸提：料液比1∶200 （g/mL）、浸提溫度45℃、浸提時間60 min。

抽濾：用10目濾紙抽濾，去除茶渣，得茶湯。

調(diào)配：在茶湯中加入4%白砂糖，攪拌均勻。

滅菌：將調(diào)配好的茶湯裝入干凈玻璃瓶中，在滅菌器中進行滅菌（85℃，30 min），殺滅其有害微生物，防止干擾后續(xù)發(fā)酵，冷卻備用。

發(fā)酵：將活化后的植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌按接種菌液體積比1∶2、接種量2.5%接種于冷卻至37℃左右的酸茶湯中，用封口膜密封后放入37℃恒溫搖床中發(fā)酵12 h得到成品，于4℃冷藏。

1.3.2 試驗設計

1.3.2.1 單因素試驗

白砂糖添加量的確定：在菌種類型LP∶LA 1∶1、菌種接種量2.5%、發(fā)酵時間12 h、發(fā)酵溫度37℃的條件下，研究白砂糖添加量（3%、3.5%、4%、4.5%、5%）對德昂酸茶乳酸菌發(fā)酵飲料感官品質(zhì)和活菌數(shù)的影響。

菌種類型的確定：在白砂糖添加量4%、菌種接種量2.5%、發(fā)酵時間12 h、發(fā)酵溫度37℃的條件下，研究菌種類型（LP、LP∶LA 1∶2、LP∶LA 1∶1、LP∶LA 2∶1、LA）對德昂酸茶乳酸菌發(fā)酵飲料感官品質(zhì)和活菌數(shù)的影響。

菌種接種量的確定：在白砂糖添加量4%、菌種類型LP∶LA 1∶2、發(fā)酵時間12 h、發(fā)酵溫度37℃的條件下，研究菌種接種量（1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%）對德昂酸茶乳酸菌發(fā)酵飲料感官品質(zhì)和活菌數(shù)的影響。

發(fā)酵時間的確定：在白砂糖添加量4%、菌種類型LP∶LA 1∶2、菌種接種量2.5%、發(fā)酵溫度37℃的條件下，研究發(fā)酵時間（8，10，12，14，16 h）對德昂酸茶乳酸菌發(fā)酵飲料感官品質(zhì)和活菌數(shù)的影響。

1.3.2.2 響應曲面優(yōu)化試驗

在單因素試驗結(jié)果的基礎上，采用Design-Expert V8.0.6中的Box-Behnken設計三因素三水平優(yōu)化試驗，以感官評分（Y）為響應值，以白砂糖添加量（A）、菌種接種量（B）和發(fā)酵時間（C）為影響因素，響應面試驗設計因素與水平見表1。

1.3.3 分析檢測

1.3.3.1 理化指標的測定

pH值的測定：采用pH計；總酸含量的測定：參考GB 12456—2021《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》；可溶性固形物含量的測定：參考文獻[15]；總糖含量的測定：采用蒽酮-硫酸法^[16]；茶多酚含量的測定：采用酒石酸亞鐵比色法^[17]；游離氨基酸總量的測定：采用茚三酮比色法^[18]。

1.3.3.2 微生物指標的測定

乳酸菌、大腸菌群、霉菌和致病菌依次參照GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》、GB 4789.3—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數(shù)》、GB 4789.15—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》、GB 29921—2021《食品安全國家標準 預包裝食品中致病菌限量》進行檢測。

1.3.3.3 感官評價

德昂酸茶乳酸菌發(fā)酵飲料感官評價小組由5名男生和5名女生組成，在評價前進行專業(yè)的訓練，分別從香氣、色澤、滋味和組織狀態(tài)4個方面進行綜合打分。感官評價標準見表2，評價結(jié)果取平均值。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗平行測定3次，采用SPSS 25.0和Design-Expert V8.0.6進行數(shù)據(jù)處理，采用Origin 2021進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 白砂糖添加量的確定

由圖1可知，隨著白砂糖添加量的增加，感官評分和活菌數(shù)均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當白砂糖添加量為4%時，感官評分最高，為（84±0.8）分，活菌數(shù)達到最大值，為（2.35±0.06）×10⁸ CFU/mL，原因可能是糖源含量增加，能源物質(zhì)增多，更利于乳酸菌生長，但當糖源物質(zhì)過多時，基質(zhì)碳氮比失衡、滲透壓過高，抑制菌種生長和早衰^[19-20]。白砂糖添加量過低或過高都會影響口感，過低時菌體不能良好生長，發(fā)酵風味不明顯，反之甜度過膩而掩蓋發(fā)酵飲料的清爽感^[21]。因此，確定白砂糖添加量為4%。

2.1.2 菌種類型的確定

由圖2可知，當植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌接種菌液體積比為1∶2時，感官評分最高，為（84.5±0.7）分，活菌數(shù)達到最大值，為（2.4±0.04）×10⁸ CFU/mL，高于單菌株發(fā)酵組和其余比例接種發(fā)酵組，原因可能是嗜酸乳桿菌（LA）和植物乳桿菌（LP）均為乳桿菌屬，發(fā)酵方式為同型乳酸發(fā)酵，當達到最佳配比時，兩者對發(fā)酵具有協(xié)同作用，提高了發(fā)酵底物能源物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率，活菌數(shù)上升^[22]。此外，由于嗜酸乳桿菌（LA）和植物乳桿菌（LP）間的互利共生關系，使代謝產(chǎn)物增加，產(chǎn)生獨特的風味^[23]，感官評分升高。綜合考慮，確定最佳菌種類型為植物乳酸菌和嗜酸乳桿菌接種菌液體積比1∶2。

2.1.3 菌種接種量的確定

由圖3可知，感官評分在菌種接種量為1.5%～2.5%之間逐漸升高，隨后逐漸降低，當菌種接種量為2.5%時，感官評分達到最大值，為（84±0.75）分。隨著菌種接種量的增加，活菌數(shù)呈先上升后下降的趨勢，當菌種接種量為3%時，飲料中活菌數(shù)最高，為（2.38±0.03）×10⁸ CFU/mL，原因可能是隨著菌種接種量的不斷增加，發(fā)酵液中有限的營養(yǎng)物質(zhì)不能滿足其生長需求，導致菌種生長受到限制，影響飲料中活菌數(shù)，且菌種接種量過多時，產(chǎn)生較多的酸類化合物，感官評分降低；而菌種接種量較少時，發(fā)酵進程緩慢，影響生產(chǎn)效率且易被雜菌污染，產(chǎn)生不愉快的風味^[24-25]?？傊?，菌種接種量過多或過少都會對發(fā)酵飲料造成不良影響。綜合考慮，選擇最佳菌種接種量為2.5%。

2.1.4 發(fā)酵時間的確定

由圖4可知，發(fā)酵時間12 h是感官評分和活菌數(shù)變化趨勢的分界點，隨著發(fā)酵時間的延長，兩者均呈先逐漸升高后降低的趨勢，當發(fā)酵時間為12 h時，感官評分為（83±0.8）分，活菌數(shù)達到（2.4±0.03）×10⁸ CFU/mL，兩者均出現(xiàn)最大值；發(fā)酵時間低于12 h時，乳酸菌發(fā)酵不充分，代謝產(chǎn)物較少，活菌數(shù)和感官評分較低；發(fā)酵時間超過12 h時，產(chǎn)生的酸類化合物過多，使部分耐酸性差的菌種失活，活菌數(shù)含量減小，口感變差^[26]。綜合考慮，選擇最佳發(fā)酵時間為12 h。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化響應面試驗結(jié)果與分析

2.2.1 響應面試驗設計方案與結(jié)果

在單因素試驗結(jié)果的基礎上，采用Design-Expert V8.0.6中的Box-Behnken設計三因素三水平優(yōu)化試驗，以感官評分（Y）為響應值，以白砂糖添加量（A）、菌種接種量（B）和發(fā)酵時間（C）為影響因素，響應面試驗設計及結(jié)果見表3。

2.2.2 回歸模型建立和方差分析

對表3中的試驗數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸分析，以感官評分（Y）為響應值，所得方程為Y=84.80+0.50A+2.25B－2.50C－1.75AB－0.75AC+3.25BC－5.78A²－4.78B²－2.77C²。進一步進行方差分析，結(jié)果見表4。

由表4可知，模型的P＜0.000 1，說明該模型極顯著，失擬項的P值為0.358 6（＞0.05），說明失擬項不顯著，模型的決定系數(shù)R²=0.987 2，調(diào)整決定系數(shù)R_Adj²=0.970 7，說明該模型的擬合程度好。響應值Y的變異系數(shù)C.V.=1.16%（＜5%），說明試驗的重復性、精確度和可信度均較高。由F值可知，試驗因素對感官評分的影響大小為發(fā)酵時間（C）＞菌種接種量（B）＞白砂糖添加量（A）。

2.2.3 響應面因素交互分析

各因素之間交互作用對德昂酸茶乳酸菌發(fā)酵飲料感官評分影響的響應面圖和等高線圖見圖5～圖7。

響應面越陡峭、等高線越扁，表明兩因素間交互作用對響應值的影響越顯著^[27]。由圖5～圖7可知，響應面的陡峭程度為BC＞AB＞AC，即菌種接種量與發(fā)酵時間的交互作用響應面最陡峭，對德昂酸茶乳酸菌發(fā)酵飲料感官評分的影響最大，該結(jié)果與表4中方差分析結(jié)果一致。

2.2.4 模型驗證試驗

采用Design-Expert V8.0.6軟件對回歸模型進行分析，得到德昂酸茶乳酸菌發(fā)酵飲料的最佳發(fā)酵工藝條件為白砂糖添加量4.03%、菌種接種量2.54%、發(fā)酵時間11.19 h，在此條件下，感官評分預測值為85分。考慮到現(xiàn)實操作問題，將上述發(fā)酵工藝條件調(diào)整為白砂糖添加量4%、菌種接種量2.5%、發(fā)酵時間12 h，并進行3次重復性驗證試驗，感官評分實際值為84.85分，說明該發(fā)酵工藝參數(shù)準確可靠，具有應用價值。

2.3 德昂酸茶乳酸菌發(fā)酵飲料品質(zhì)指標檢測

2.3.1 理化指標

以優(yōu)化配方條件下制得的德昂酸茶乳酸菌發(fā)酵飲料為研究對象，測定樣品的pH值、總酸含量、可溶性固形物含量、總糖含量、茶多酚含量、游離氨基酸含量，見表5。

2.3.2 微生物指標

由表6可知，經(jīng)檢測，德昂酸茶乳酸菌發(fā)酵飲料產(chǎn)品中乳酸菌為（2.3±0.03）×10⁸ CFU/mL，大腸菌群、致病菌和霉菌均未檢出，符合國家標準要求^[28]。

3 結(jié)論

在單因素試驗結(jié)果的基礎上，進一步進行響應面優(yōu)化試驗，所得德昂酸茶乳酸菌發(fā)酵飲料的最佳發(fā)酵工藝條件為白砂糖添加量4%、植物乳酸菌和嗜酸乳桿菌接種菌液體積比1∶2、菌種接種量2.5%、37℃發(fā)酵12 h，生產(chǎn)的德昂酸茶乳酸菌發(fā)酵飲料營養(yǎng)物質(zhì)豐富，酸茶的清香和乳酸菌的發(fā)酵香充分融合，風味獨特，感官評分為84.85分，pH值為4.01±0.01，總酸含量為（0.34±0.02）g/L，可溶性固形物含量為（4.00±0.01）%，總糖含量為（2.24±0.1）g/100 mL，茶多酚含量為（13.73±0.29）g/L，游離氨基酸含量為（36.30±0.13）mg/100 mL，微生物指標均符合國家標準，該研究有利于德昂酸茶深加工產(chǎn)品的開發(fā)及全產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展。

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