[摘要]目的：評(píng)估防腐劑羥苯甲酯和對(duì)羥基苯乙酮皮膚局部刺激和皮膚中暴露量。方法：應(yīng)用雞胚絨毛膜尿囊膜模型評(píng)估皮膚局部刺激；應(yīng)用巴馬小型豬皮膚模型評(píng)估防腐劑經(jīng)皮透過量和皮膚中駐留量。結(jié)果：雞胚試驗(yàn)確定羥苯甲酯在濃度≤0.2%時(shí)，無(wú)刺激性。對(duì)羥基苯乙酮在濃度≤1.0%時(shí)，無(wú)刺激性。離體透皮試驗(yàn)表明，面膜貼敷20 min、1 h和2 h后，羥苯甲酯和對(duì)羥基苯乙酮在皮下接收液和皮膚中均有暴露，且皮膚中駐留量遠(yuǎn)高于皮下接收液的量。在貼敷20 min時(shí)，兩種防腐劑在皮膚中駐留量分別約是皮下接受液含量的14和12倍。離體透皮試驗(yàn)也顯示，透明質(zhì)酸能降低羥苯甲酯和對(duì)羥基苯乙酮經(jīng)皮透過量，但能顯著增加兩者在角質(zhì)層和真皮層皮膚中暴露量。皮膚中暴露與安全性分析顯示，羥苯甲酯在真皮層中2個(gè)時(shí)間點(diǎn)的濃度均高于細(xì)胞毒性濃度，可能存在潛在局部皮膚毒性。對(duì)羥基苯乙酮有效抑菌濃度和安全濃度相差較小，長(zhǎng)時(shí)間貼敷面膜，皮膚中駐留量累積也可能產(chǎn)生潛在副作用。結(jié)論：本方法可用于評(píng)估化妝品中防腐劑局部皮膚刺激和經(jīng)皮透過量和皮膚中駐留量，為化妝品防腐劑的安全性評(píng)估提供一種評(píng)估方法。

[關(guān)鍵詞]羥苯甲酯；對(duì)羥基苯乙酮；雞胚絨毛膜尿囊膜模型；巴馬小型豬模型；皮膚駐留量；皮膚刺激性；經(jīng)皮透過量

[中圖分類號(hào)]R943" " [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A" " [文章編號(hào)]1008-6455（2025）02-0001-06

Study on Local Irritation and Skin Resident Amount and Penetration of Methyl Para-hydroxybenzoate and P-hydroxy-acetophenone Preservatives

LI Hewei， DAI Ying， WEI Guozhi

（ Changzhou Weibo Hi-Tech Co.Ltd .， Changzhou 213000， Jiangsu， China ）

Abstract： Objective" To evaluate the local skin irritation and exposure in skin for methyl para-hydroxybenzoate and p-hydroxy-acetophenone preservatives. Methods" The chorioallantoic membrane vascular assay was used to evaluate local skin irritation， while the Bama miniature pig skin model was used to evaluate transdermal penetration and skin resident amount of preservatives. Results" The chorioallantoic membrane vascular test determined that methyl para-hydroxybenzoate at a concentration of ≤0.2% was non-irritating， whereas p-hydroxy-acetophenone at a concentration of ≤1.0% was non-irritating. The in vitro transdermal penetration test showed that after 20 minutes， 1 hour， and 2 hours of facial mask application， both methyl para-hydroxybenzoate and p-hydroxy-acetophenone were exposed in the receiver solution and skin， and the resident amount in the skin was much higher than the amount of receiver solution， with approximately 14 and 12 times， respectively. Hyaluronic acid can reduce transdermal penetration of methyl para-hydroxybenzoate and p-hydroxy-acetophenone， but can significantly increase resident amount in the stratum corneum and dermis. The analysis of exposure in skin and safety showed that the concentration of methyl para-hydroxybenzoate at two time points in the dermis was higher than the cytotoxic concentration， indicating potential local skin toxicity. The effective bacteriostatic concentration of p-hydroxy-acetophenone and the safe concentration differ only slightly， and long-term use of facial masks may result in cumulative resident amount in skin and potential side effects. Conclusion" This method can be used to evaluate the local skin irritation and percutaneous penetration of preservatives in cosmetics and the retention of preservatives in the skin， providing an evaluation method for the safety evaluation of cosmetic preservatives.

Key words： methyl para-hydroxybenzoate; p-hydroxy-acetophenone; chorioallantoic membrane vascular assay; Bama miniature pig skin model; resident amount in skin; shin irritation; percutaneons penetration

化妝品不良反應(yīng)主要為皮膚刺激導(dǎo)致的過敏性皮炎，占化妝品不良反應(yīng)的絕大多數(shù)[1-2]，其中由于防腐劑引起的皮膚過敏反應(yīng)在多個(gè)文獻(xiàn)中已被報(bào)道[3-4]。面膜在化妝品領(lǐng)域中占有重要的位置，在貼敷時(shí)與皮膚接觸面積較大，會(huì)導(dǎo)致更多的防腐劑滲透進(jìn)入皮膚，增加面部皮膚中暴露量，可能產(chǎn)生更大的皮膚刺激，甚至長(zhǎng)期駐留在皮膚內(nèi)導(dǎo)致皮膚損害。

化妝品的防腐劑主要包括4大類，甲醛供體類、苯甲酸及其衍生物類、醇類和其他有機(jī)化合物[2]。羥苯甲酯是經(jīng)典的防腐劑，一直在化妝品中被廣泛使用[5]，但由于皮膚過敏反應(yīng)，在化妝品中安全使用一直存在爭(zhēng)議[6]。有文獻(xiàn)研究羥苯甲酯抗菌有效性濃度是0.1%，但0.04%濃度會(huì)產(chǎn)生一定細(xì)胞毒性[7]。在《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版和2022年征求意見稿中規(guī)定羥苯甲酯最大允許使用濃度單一酯為0.4%。對(duì)羥基苯乙酮近年在化妝品領(lǐng)域中也開始逐漸被越來(lái)越多的產(chǎn)品使用，但在《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版和2022年征求意見稿中尚未規(guī)定該防腐劑用量上限。皮膚刺激文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時(shí)，對(duì)羥基苯乙酮無(wú)刺激性，體外多肽反應(yīng)為陰性，對(duì)細(xì)胞存活半數(shù)抑制濃度為3.1%[8]。在對(duì)羥基苯乙酮抑菌有效性研究中，對(duì)3種細(xì)菌的最低有效濃度為5.0 mg·ml-1（相對(duì)于0.5%）[9]。在另一個(gè)以水蚤作為研究對(duì)象的急性毒性試驗(yàn)中，對(duì)羥基苯乙酮半數(shù)毒性量為64 mg·L-1[10]。這些研究數(shù)據(jù)均揭示這些化妝品中防腐的安全使用值得更多關(guān)注。

一般來(lái)說(shuō)，面膜的面積較大，加入的防腐絕對(duì)量較多。這些防腐劑不僅與皮膚表面接觸可能產(chǎn)生局部皮膚刺激性，也可能長(zhǎng)時(shí)間駐留在皮膚內(nèi)部和進(jìn)入系統(tǒng)血液循環(huán)中，導(dǎo)致其他刺激性，甚至細(xì)胞毒性。本研究以羥苯甲酯和對(duì)羥基苯乙酮作為研究對(duì)象，以雞胚絨毛膜尿囊膜模型（Chorioallantoic membrane vascular assay，CAMVA）評(píng)估兩種防腐劑的局部皮膚刺激性；應(yīng)用巴馬小型豬皮膚模型，采用離體透皮試驗(yàn)評(píng)估兩種防腐劑在貼敷不同時(shí)間后從面膜中滲透到皮下接收液和駐留到皮膚中（角質(zhì)層和真皮層）暴露量。

1" 材料和方法

1.1 儀器：BSA323S（精度0.001 g）電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）和PR224ZHE型（精度0.0 001 g）電子天平（沙鷹科學(xué)儀器有限公司）；LC-2030C型高效液相色譜儀（日本島津公司）；UV-2600型紫外檢測(cè)器（日本島津公司）；TT-B（D）型Franz透皮試驗(yàn)儀（天津市正通科技有限公司）；TD6M型臺(tái)式低速離心機(jī)（昆山祥辰酉五金機(jī)電有限公司）；pH計(jì)[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；BIO-DL型移液槍（賽多利斯公司）；LHS-100F恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海精其儀器有限公司）；XT-02C體視顯微鏡（上海浦柘光電儀器有限公司）；裕達(dá)牌全自動(dòng)孵化機(jī)（裕達(dá)孵化設(shè)備廠）；F6/10型電動(dòng)均漿機(jī)（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）。

1.2 材料：羥苯甲酯對(duì)照品（純度：≥98%，上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司）；對(duì)羥基苯乙酮對(duì)照品（純度：≥98%，上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司）；羥苯甲酯原料（廣州市榮宸生物科技有限公司）；對(duì)羥基苯乙酮原料（肌理夫人）；透明質(zhì)酸（分子量：7 000，華熙生物科技股份有限公司）；Welch Xtimate C18-WR（150 mm×4.6 mm，5μm）（上海月旭科技股份有限公司）；濾膜（0.22μm，天津津騰公司）；色譜純乙腈（Fisher公司）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；生理鹽水，三氟乙酸，十二烷基硫酸鈉（SDS）等均為分析純（北京化工集團(tuán)股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 CAMVA試驗(yàn)

1.2.1.1 試驗(yàn)步驟：參考文獻(xiàn)方法[10]，結(jié)合企業(yè)制訂的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，將雞胚置于恒溫恒濕箱中孵育9 d（溫度37℃1℃，濕度50%～70%）。選取已受精和有活性的雞胚，用牙科鋸齒彎鑷剝?nèi)?biāo)記的蛋殼，暴露白色蛋膜，應(yīng)小心操作不破壞蛋膜完整性。隨機(jī)分組，陰性對(duì)照組（0.9% NaCl溶液），陽(yáng)性對(duì)照組（1.0% SDS溶液），試驗(yàn)組。用塑料吸管將受試防腐劑溶液（羥苯甲酯用5%丁二醇溶解，分別配成質(zhì)量濃度為0.1%，0.2%和0.4%的溶液；對(duì)羥基苯乙酮用水加熱溶解，分別配成質(zhì)量濃度為0.5%，1%和2%的溶液）滴于蛋白膜血管富集處，反應(yīng)3 min后，用0.9% NaCl溶液沖洗至樣品無(wú)明顯殘留并可清晰觀察膜血管，3次。根據(jù)如下方程1和表1中評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算刺激得分。

1.2.1.2 CAMVA 判定標(biāo)準(zhǔn)：采用反應(yīng)時(shí)間法進(jìn)行試驗(yàn)，采用式（1）計(jì)算刺激評(píng)分（Irritation score，IS）。

（1）

公式中sec H（出血時(shí)間）：CAM膜上觀察到開始發(fā)生出血的平均時(shí)間；sec L（血管融解時(shí)間）：CAM膜上觀察到開始發(fā)生血管融解的平均時(shí)間；sec C（凝血時(shí)間）：CAM膜上觀察到開始發(fā)生出現(xiàn)凝血的平均時(shí)間；所有時(shí)間單位均為s。判定標(biāo)準(zhǔn)為：IS＜1，無(wú)刺激；1≤IS＜5，輕微刺激；5≤IS＜9，中度刺激；IS＞10，強(qiáng)刺激。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.2.2 離體豬皮透皮試驗(yàn)

1.2.2.1色譜條件：色譜柱為C18（4.6 mm×150 mm，5.0μm）；流動(dòng)相為0.1%三氟乙酸乙腈：0.1%三氟乙酸水溶液（30∶70）；流速1.0 ml·min-1；柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng) 254 nm；進(jìn)樣量20μl。

1.2.2.2 離體豬皮制備：巴馬小型豬處死后立即剪取腹部皮膚，剝離皮下脂肪和結(jié)締組織，用95%酒精棉球反復(fù)擦拭皮膚表面，再用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分，備用。

1.2.2.3 試驗(yàn)步驟：參考文獻(xiàn)方法[11-12]，應(yīng)用Franz透皮擴(kuò)散儀進(jìn)行透皮試驗(yàn)。樣品接收液：生理鹽水5 ml（含有1.0%丁二醇），至與皮膚完全接觸無(wú)氣泡，試驗(yàn)開始前平衡30 min。皮膚使用濾紙吸干水分放置于接收池頂面，皮膚角質(zhì)層向上，暴露的皮膚面積為0.71 cm2。樣品溶液（含3%丁二醇的甲醇）加入至透皮供給池內(nèi)（生理鹽水溶液）。擴(kuò)散池溫度（320.5）℃，攪拌速度450 rpm/min，取樣時(shí)間點(diǎn)20 min、1 h、2 h。①皮膚角質(zhì)層駐留：參考文獻(xiàn)方法[13]，用棉球擦拭干凈皮膚表面殘留物，再用生理鹽水沖洗皮膚表面3次，然后膠帶粘貼法粘貼表皮20次，將角質(zhì)層粘下，并將膠帶置于20 ml甲醇中超聲提取。②皮膚真皮層駐留：將剩余部分剪碎，在勻漿機(jī)內(nèi)加入20 ml 50%甲醇溶液進(jìn)行勻漿處理，離心，取上清液。皮下接收液：取接收液1.0 ml，0.22μm微孔濾膜過濾后超聲脫氣1 min進(jìn)樣，取樣后向接收池內(nèi)補(bǔ)充同體積接收液。在考察透明質(zhì)酸對(duì)防腐劑皮膚透過和皮膚內(nèi)駐留影響時(shí)，在給予池中同時(shí)加入含有1%透明質(zhì)酸溶液。將上述各個(gè)樣品在高效液相（HPLC）儀器中進(jìn)樣分析，隨行進(jìn)樣兩種防腐劑對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度8μg·ml-1），采用“1.2.2.1色譜條件”項(xiàng)下色譜方法進(jìn)行HPLC含量測(cè)定分析。通過HPLC儀器積分獲得樣品中防腐劑的積分面積，再將樣品中防腐劑峰面積代入其對(duì)照品線性（2.2.2項(xiàng)下）方程中，應(yīng)用線性方程計(jì)算獲得上述樣品中防腐劑的質(zhì)量濃度（Ci和Cn）。試驗(yàn)過程和主要樣品制備見圖1。

1.2.2.4 數(shù)據(jù)分析：?jiǎn)挝幻娣e皮膚內(nèi)駐留量，按如下公式（2）計(jì)算：

式中Qr（μg·cm-2）代表面膜中防腐劑在某個(gè)時(shí)間點(diǎn)的單位面積皮膚內(nèi)駐留量；Ci（μg·ml-1）代表在“1.2.2.3“項(xiàng)下不同時(shí)間點(diǎn)的①和②中防腐劑濃度；Vi（ml）代表提取溶液體積（20 ml）；S（cm2）代表擴(kuò)散池暴露皮膚面積（離體豬皮：0.71 cm2）。

單位面積皮膚上面膜中防腐劑經(jīng)皮累積透過量采用文獻(xiàn)[14]的公式（3）計(jì)算：

式中Qt（μg·cm-2）代表面膜中防腐劑在某個(gè)時(shí)間點(diǎn)的單位面積累積透過量；Cn（μg·ml-1）代表不同時(shí)間點(diǎn)防腐劑在接收液中濃度；Vrec（ml）代表接收液體積（5.0 ml）；Ct（μg·ml-1）代表在Cn前一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的防腐劑在接收液中濃度；Vt（ml）代表取樣體積（1.0 ml）。單因素方差分析（Tukey-Kramer HSD檢驗(yàn)）比較均值，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析均由JMP 11.0.0平臺(tái)實(shí)現(xiàn)（SAS Institute Inc.）。

2" 結(jié)果

2.1 CAMVA試驗(yàn)結(jié)果：結(jié)果顯示為雞胚接觸羥苯甲酯和對(duì)羥基苯乙酮之前和接觸3 min之后顯微鏡下觀察的結(jié)果。在接觸防腐劑之前，雞胚CAM膜上的血管網(wǎng)絡(luò)呈現(xiàn)正常狀態(tài)，清晰且連續(xù)。在與0.1%和0.2%濃度的羥苯甲酯以及0.5%和1.0%濃度的對(duì)羥基苯乙酮接觸后，血管網(wǎng)絡(luò)保持了原有的清晰度和連續(xù)性，未出現(xiàn)異常的擴(kuò)張或收縮現(xiàn)象，也沒有出血、凝血或血管融解的情況（見圖2A～E、G～K）。然而，在0.4%濃度的羥苯甲酯（見圖2F）和2.0%濃度的對(duì)羥基苯乙酮（見圖2L）接觸后，雖然血管網(wǎng)絡(luò)整體上仍然清晰且連續(xù)，沒有明顯的擴(kuò)張或收縮，但在個(gè)別小血管中觀察到了輕微的出血和凝血現(xiàn)象（見圖2F、L），高濃度羥苯甲酯接觸后局部毛細(xì)血管末端出現(xiàn)輕微溶解現(xiàn)象（見圖2F）。

CAMVA試驗(yàn)結(jié)果顯示，0.9% NaCl作為陰性對(duì)照，IS值是0.0。1%SDS作為陽(yáng)性對(duì)照，IS值范圍在10～19，陰性和陽(yáng)性對(duì)照的IS值證明CAMVA實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。羥苯甲酯在濃度為0.4%時(shí)，IS值為2.3，顯示了輕微刺激；在濃度≤0.2%時(shí)，IS值小于1，無(wú)刺激性。對(duì)羥基苯乙酮在濃度為2%時(shí)，IS值為3.9顯示了輕微刺激；在濃度≤1.0%時(shí)，IS值小于1，無(wú)刺激性。在CAMVA試驗(yàn)中，對(duì)羥基苯乙酮對(duì)局部皮膚安全性的濃度是羥苯甲酯的5倍。見表2。

2.2 HPLC測(cè)定羥苯甲酯和對(duì)羥基苯乙酮經(jīng)皮滲透和皮膚中駐留量方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

2.2.1 對(duì)照品溶液制備：精密稱取羥苯甲酯和對(duì)羥基苯乙酮對(duì)照品各約20 mg，加入甲醇溶解并定容于10 ml量瓶中，搖勻，即得濃度約為2.0 mg·ml-1的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，備用。

2.2.2 線性關(guān)系考察：用移液槍量取兩種防腐劑對(duì)照品溶液不同體積，再用甲醇進(jìn)行稀釋，配制系列對(duì)照品溶液，羥苯甲酯和對(duì)羥基苯乙酮質(zhì)量濃度均為200、80.0、16.0、8.0、4.0、0.4μg·ml-1。以濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得羥苯甲酯回歸方程分別為Y=54 000X+55 280，r=0.999 7；對(duì)羥基苯乙酮回歸方程為Y=28 053X+34 617，r=0.999 7。結(jié)果表明，羥苯甲酯和對(duì)羥基苯乙酮均在0.4～200μg·ml-1內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 精密度試驗(yàn)：配置羥苯甲酯（8μg·ml-1）和對(duì)羥基苯乙酮（8μg·ml-1）混合對(duì)照品溶液，精密吸取對(duì)照品溶液20μl，分別于同1 d之內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，并在3 d之內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示兩者日內(nèi)精密度RSD分別為1.94%和0.99%，日間精密度RSD分別為2.33%和1.13%。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密量取供試品溶液20μl（透皮接收液和皮膚內(nèi)樣品），放置在室溫條件下，分別于0、1、2、4、8 h測(cè)定峰面積，結(jié)果顯示2個(gè)供試樣品中羥苯甲酯和對(duì)羥基苯乙酮峰面積RSD分別為1.84%、0.83%和1.37%、2.17%，表明供試品溶液在室溫條件下8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 回收率試驗(yàn)：在已知高（10μg·ml-1）、中（5μg·ml-1）、低（0.5μg·ml-1）3個(gè)濃度的溶液中按1∶1比例分別加入高、中、低3個(gè)濃度的羥苯甲酯和對(duì)羥基苯乙酮對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度平行制備3份供試品，按既定的色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。3個(gè)濃度下兩種防腐劑的回收率均在95.0%～105.0%，RSD均在3.0%以內(nèi)。

2.2.6 專屬性試驗(yàn)：取供試品溶液，混合對(duì)照品溶液、陰性樣品（空白接收液和豬皮提取液），按“1.2.2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，記錄色譜圖。對(duì)照品峰形良好，供試品與對(duì)照品在相應(yīng)位置上存在相同峰，且陰性樣品溶液對(duì)測(cè)定結(jié)果不產(chǎn)生干擾。見圖3。

2.3 離體豬皮透皮試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 防腐劑在豬皮膚中的透皮吸收量：結(jié)果顯示面膜中羥苯甲酯和對(duì)羥基苯乙酮在豬皮膚模型中貼敷20 min、1 h和2 h 后，兩種防防腐劑在接收液中經(jīng)皮透過量測(cè)定結(jié)果。兩種防腐劑從面膜中經(jīng)皮透過速度較快，面膜貼敷20 min時(shí)，兩種防腐劑即可在透皮接收液中檢測(cè)到，Qt分別為0.56μg·cm2和0.84μg·cm2。隨著面膜貼敷時(shí)間的增加，Qt也逐漸增加，2 h羥苯甲酯和對(duì)羥基苯乙酮的平均經(jīng)皮累積透過量Qt分別為5.6μg·cm2和10.2μg·cm2。并且對(duì)羥基苯乙酮的經(jīng)皮透過量增加速度更快和累積透過量更高。見圖4A。

2.3.2 防腐劑在不同層次離體豬皮膚中駐留量：結(jié)果顯示，面膜中羥苯甲酯和對(duì)羥基苯乙酮在豬皮膚模型中貼敷20 min、1 h和2 h后，兩種防腐劑在皮膚角質(zhì)層和真皮層中駐留結(jié)果。結(jié)果顯示，兩種防腐劑在皮膚真皮和角質(zhì)層中駐留量Qr也是隨著貼敷時(shí)間的增加而增加。角質(zhì)層和真皮層中3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的羥苯甲酯平均駐留量均小于對(duì)羥基苯乙酮平均駐留量，這與皮下接收液中兩種防腐劑的經(jīng)皮滲透量趨勢(shì)是一致的。此外，皮膚真皮層中兩種防腐劑在面膜貼敷2 h的駐留量明顯增加，顯著高于角質(zhì)層中同樣時(shí)間點(diǎn)的駐留量。并且研究顯示，皮膚中防腐劑駐留量顯著高于經(jīng)皮透過量，在20 min時(shí)間點(diǎn)，兩種防腐劑在皮膚中駐留量相當(dāng)于皮下接受液量約14和12倍。見圖4B～C。

2.3.3 透明質(zhì)酸對(duì)防腐劑皮膚透過和皮膚內(nèi)駐留影響：結(jié)果顯示，透明質(zhì)酸對(duì)羥苯甲酯和對(duì)羥基苯乙酮在豬皮膚經(jīng)皮透過量（見圖4A）和皮膚角質(zhì)層、真皮層中駐留量（見圖4B～C）的影響。透明質(zhì)酸能降低兩種防腐劑經(jīng)皮透過量，在2 h時(shí)兩種防腐劑透過量均有顯著性降低。相反，透明質(zhì)酸能增加兩種防腐劑在皮膚角質(zhì)層和真皮層中駐留量。

2.4 皮膚內(nèi)暴露量與安全性分析：結(jié)合皮膚中兩種防腐劑的駐留量數(shù)據(jù)，表3計(jì)算了皮膚角質(zhì)層和真皮層中兩種防腐劑的濃度。根據(jù)CAMVA試驗(yàn)的結(jié)果，皮膚中駐留的羥苯甲酯和對(duì)羥基苯乙酮濃度均小于不產(chǎn)生皮膚刺激性安全濃度，對(duì)羥基苯乙酮的濃度離產(chǎn)生皮膚刺激性相差較多。但羥苯甲酯在2 h真層中濃度比較接近產(chǎn)生刺激性的濃度

3" 討論

巴馬小型豬的皮膚各種生理特征和透過性均被認(rèn)為是與人類皮膚最為接近的，歐盟委員會(huì)等多個(gè)國(guó)際組織均推薦可用于代替人類皮膚進(jìn)行經(jīng)皮給藥研究[14]。因此本研究采用巴馬小型豬皮膚來(lái)評(píng)估化妝品中兩種防腐劑羥苯甲酯和對(duì)羥基苯乙酮在該皮膚模型中經(jīng)皮透過量和皮膚內(nèi)駐留量。目前多數(shù)文獻(xiàn)主要是測(cè)定皮下接收液中藥物透過量[11，15-16]，較少的研究會(huì)同時(shí)關(guān)注皮膚中駐留量[12，17]。本研究同時(shí)測(cè)定兩種防腐劑透皮透過量和皮膚中駐留量，為更全面分析防腐在人體局部皮膚和系統(tǒng)暴露量提供一種新的離體模型方法。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)兩種防腐劑在面膜貼敷20 min和1 h時(shí)，皮膚角質(zhì)層和層中駐留量較為接近；但在貼敷2 h時(shí)，真皮層中防腐劑駐留量顯著高于角質(zhì)層中駐留量。這可能是兩種防腐劑均屬于脂溶性成分，能較容易穿透皮膚角質(zhì)層，隨著貼敷時(shí)間的延長(zhǎng)，防腐逐漸進(jìn)入深層皮膚內(nèi)。在貼敷1和2 h，透明質(zhì)酸能顯著增加羥苯甲酯和對(duì)羥基苯乙酮在皮膚中駐留量。這可能是透明質(zhì)酸對(duì)皮膚的水合作用，或是與防腐劑的相互作用增強(qiáng)了其在皮膚中駐留量?；瘖y品中防腐劑多數(shù)均屬于脂溶性化合物，理論上均具有良好的皮膚透過性能。同時(shí)面膜中防腐劑用量較大（常規(guī)面膜25 ml，以加入0.4%羥苯甲酯計(jì)，相當(dāng)于一片面膜中含有羥苯甲酯100 mg），因此需要關(guān)注面膜中防腐劑進(jìn)入皮膚后，對(duì)皮膚內(nèi)部可能產(chǎn)生的局部副作用。

面膜的使用人群主要為女性，此處使用女性的生理參數(shù)來(lái)計(jì)算皮膚內(nèi)羥苯甲酯和對(duì)羥基苯乙酮駐留濃度。女性皮膚的平均重量為3 200 g，皮膚中平均含水量約為30%，面部占皮膚的比例約為3%，這樣計(jì)算女性皮膚中水分的平均含量為28.8 g?；瘖y品中成分的皮膚刺激性的評(píng)價(jià)方法主要包括重建人表皮3D皮膚模型[18]、直接多肽反應(yīng)試驗(yàn)[8]、雞胚絨毛膜尿囊膜模型和近年剛興起的斑馬魚胚模型[20-21]。在本研究中，主要采用CAMVA方法評(píng)估防腐劑羥苯甲酯和對(duì)羥基苯乙酮對(duì)局部皮膚潛在刺激性?！痘瘖y品安全技術(shù)規(guī)范》中規(guī)定羥苯甲酯的最大允許使用濃度為0.4%。本研究評(píng)估結(jié)果顯示，0.4%的羥苯甲酯能產(chǎn)生輕微皮膚刺激性。此外，皮膚內(nèi)暴露與安全性分析也揭示羥苯甲酯按0.4%添加到面膜中，在局部皮膚內(nèi)可能產(chǎn)生一定的毒副作用。對(duì)羥基苯乙酮在CAMVA試驗(yàn)中顯示1.0%濃度不會(huì)產(chǎn)生皮膚刺激性，但由于本品的有效抑制濃度為0.5%[9]。有效濃度和安全濃度相差較小，如果面膜中加入能確保抑菌效果的用量，長(zhǎng)時(shí)間貼敷面膜，皮膚中駐留量累積也可能產(chǎn)生潛在副作用。

此外，有研究顯示，面膜中某些成分，比如低分子量透明質(zhì)酸會(huì)增加藥物在皮膚中駐留量[22-23]。本試驗(yàn)也證實(shí)了低分子量透明質(zhì)酸會(huì)增加羥苯甲酯和對(duì)羥基苯乙酮在皮膚中駐留量?；瘖y品中其他成分是否也會(huì)增加防腐劑在皮膚中駐留量，或是其他防腐劑在透明質(zhì)酸作用下是否也會(huì)顯著增加其在皮膚內(nèi)駐留量仍然是未知的，但這可能為潛在局部皮膚安全性帶來(lái)更復(fù)雜的情況。

本研究首次評(píng)估了面膜中防腐劑羥苯甲酯和對(duì)羥基苯乙酮經(jīng)皮透過量和在皮膚中駐留量，并且分析了皮膚局部暴露濃度和安全性關(guān)系，為化妝品中防腐劑的安全使用提供了一種新的評(píng)估方法。

[參考文獻(xiàn)]

[1]黃宇鋒，李光先，何樹鋒，等.5類特殊用途化妝品刺激性試驗(yàn)結(jié)果分析[J].日用化學(xué)品科學(xué)，2021，44（12）：24-27.

[2]王瑞，王歡，韓雨晴，等.組合應(yīng)用替代方法評(píng)價(jià)5種化妝品中常用防腐劑的皮膚致敏性[J].日用化學(xué)品科學(xué)，2023，46（1）：20-27.

[3]Ma X， Wang H， Song Y， et al. Skin irritation potential of cosmetic preservatives： An exposure-relevant study[J]. J Cosmet Dermatol， 2021，20（1）：195-203.

[4]Martins M S， Ferreira M S， Almeida I F， et al. Occurrence of allergens in cosmetics for sensitive skin[J]. Cosmetics， 2022，9（2）：32.

[5]李凱利，何一波，祝愿，等.化妝品常用防腐劑及發(fā)展趨勢(shì)[J].中國(guó)洗滌用品工業(yè)，2022，256（7）：82-88.

[6]Nowak K， Jab?ońska E， Ratajczak-Wrona W. Controversy around parabens： Alternative strategies for preservative use in cosmetics and personal care products[J]. Environ Res， 2021，198：110488.

[7]Tanaka T， Oishi M， Okazaki M. The relationship between the preservative efficacy and cytotoxicity of two common preservatives used in cosmetics[J]. J Oral Tissue Engin， 2018，15（3）：186-192.

[8]陳田.化妝品用原料對(duì)羥基苯乙酮的局部毒性研究[J].香料香精化妝品，2020，180（3）：56-60.

[9]Melleg?rd H， Stalheim T， Hormazabal V， et al. Antibacterial activity of sphagnum acid and other phenolic compounds found in Sphagnum papillosum against food-borne bacteria[J]. Lett Appl Microbiol， 2009，49（1）：85-90.

[10]Ike M， Chen M Y， Jin C S， et al. Acute toxicity， mutagenicity， and estrogenicity of biodegradation products of bisphenol-A[J]. Environ Toxicol， 2002，17（5）：457-461.

[11]楊雅麗，童想柳，林國(guó)鋇，等.地佐辛外用制劑的體外透皮特性比較[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2019，50（12）：1463-1467.

[12]唐澤嚴(yán)，郭學(xué)平，溫喜明，等.不同相對(duì)分子質(zhì)量透明質(zhì)酸對(duì)還原型谷胱甘肽透皮吸收的影響[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2021，52（2）：203-210.

[13]吳黎莉，周可，徐蘭芳，等.膠帶粘貼技術(shù)結(jié)合LC-MS法測(cè)定人體皮膚角質(zhì)層中艾迪康唑濃度[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，45（1）：79-83.

[14]Pavla?ková J， Egner P， Pola?ková J， et al. Transdermal absorption of active substances from cosmetic vehicles[J]. J Cosmet Dermatol， 2019，18（5）：1410-1415.

[15]李花花，楊暢，楊艷玲，等.活血止痛凝膠貼膏與微乳凝膠劑的體內(nèi)外滲透性比較研究[J].中國(guó)中藥雜志，2022，47（7）：1857-1863.

[16]張金偉，李翰銘，尹虹，等.肉豆蔻酸單萜醇酯對(duì)布南色林經(jīng)皮透過的影響[J].化學(xué)通報(bào)，2022，85（7）：853-859.

[17]周剛，付曉婷，潘靜茹，等.他克莫司軟膏透皮一致性的體外Franz擴(kuò)散池測(cè)定比較研究[J].藥物分析雜志，2020，40（12）：2126-2133.

[18]Valentin J. Basic anatomical and physiological data for use in radiological protection： reference values： ICRP Publication 89： Approved by the Commission in September 2001[J]. Ann ICRP， 2002， 32（3-4）： 1-277.

[19]王飛強(qiáng)，張子琪，馮慶媛，等.皮膚毒理學(xué)檢驗(yàn)中的替代方法和整合測(cè)試評(píng)估方法[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2021，38（24）：3091-3096.

[20]何立成，朱社敏，謝珍等.雞胚絨毛膜尿囊膜血管試驗(yàn)法用于評(píng)價(jià)化妝品眼刺激性的可行性研究[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2017，34（8）：1158-1162.

[21]劉永，梁佳，郭家彬，等.模式動(dòng)物斑馬魚在微塑料毒性評(píng)價(jià)中的研究進(jìn)展[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2022，39（10）：1172-1179.

[22]Kim Y， Bhattaccharjee SA， Beck-Broichsitter M， et al. Fabrication and characterization of hyaluronic acid microneedles to enhance delivery of magnesium ascorbyl phosphate into skin[J]. Biomed Microdevices， 2019， 21：1-9.

[23]How K N， Yap W H， Lim C L H， et al. Hyaluronic acid-mediated drug delivery system targeting for inflammatory skin diseases： A mini review[J]. Front Pharmacol， 2020，11：1105.

[收稿日期]2023-07-03

本文引用格式：李和偉，代穎，魏國(guó)志.防腐劑羥苯甲酯和對(duì)羥基苯乙酮皮膚局部刺激性及駐留量和透皮量研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2025，34（2）：1-6.