〔摘要〕 目的 研究補陽還五湯（BYHWD）及灌胃給藥前后大鼠血清和腦組織中的天然產(chǎn)物成分和內(nèi)源性代謝產(chǎn)物差異，為該復方的作用機制提供參考。方法 將20只大鼠平均分為2組，中藥組（25.65 g·kg-1）和空白組（給予等量生理鹽水）各10只，每天給藥1次，連續(xù)給藥3 d，第4天給藥2 h后，腹主動脈取血并斷頭取腦組織。采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）技術，對BYHWD、正常大鼠血清、腦組織和灌胃給藥大鼠血清、腦組織天然產(chǎn)物及代謝產(chǎn)物進行分析。結果 從BYHWD中共指認出90個天然產(chǎn)物成分;大鼠灌胃BYHWD后，發(fā)現(xiàn)25個入血成分，10個入腦成分，其中5個成分能同時入血入腦。代謝組學分析發(fā)現(xiàn)，血清內(nèi)源性差異成分主要涉及亞油酸代謝、類固醇激素生物合成、苯丙氨酸代謝等8條代謝通路。腦組織內(nèi)源性代謝差異成分主要涉及視黃醇代謝、類固醇激素生物合成、咖啡因代謝等9條代謝途徑。結論 通過分析BYHWD的天然產(chǎn)物成分、灌胃大鼠前后血腦中成分差異及相關代謝途徑，可為闡明BYHWD有效成分及其作用機制提供參考。

〔關鍵詞〕 補陽還五湯;超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜;代謝組學;天然產(chǎn)物;內(nèi)源性代謝產(chǎn)物

〔中圖分類號〕R284"""""""" 〔文獻標志碼〕A""""""""" 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.02.008

〔收稿日期〕2024-10-09

〔基金項目〕國家自然科學基金面上項目（82374323）;湖南省自然科學基金面上項目（2022JJ30435）;湖南省衛(wèi)生健康委科研計劃項目（C202302087602）;湖南中醫(yī)藥大學研究生創(chuàng)新課題（2023CX180，2024CX153）;湖南中醫(yī)藥大學本科生研創(chuàng)新基金（2023BKS024）。

〔通信作者〕*李" 亮，男，博士，教授，E-mail：superliliang@126.com。

Component differences in blood and brain of rats before and after intragastric administration of Buyang Huanwu Decoction based on liquid chromatography-mass spectrometry and metabolomics approaches

WEN Mengxin1，2， LI Siyuan1，2， LIU Yingfang1，2， CHEN Guangyu1，2， XIE Mengzhou1，2， LI Liang1，2*

1. Hunan Key Laboratory of Chinese Medicine Diagnostics， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Key Laboratory of Chinese Medicine Heart and Lung Syndrome Differentiation amp; Medicated Diet and Dietotherapy，

Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Abstract〕 Objective To investigate the differences in natural product components and endogenous metabolites in rat serum and brain tissue before and after intragastric administration of Buyang Huanwu Decoction （BYHWD）， and to provide a reference for elucidating the mechanism of action of this Chinese compound formula. Methods Twenty rats were equally divided into two Chinese medicines group （administered with BYHWD at 25.65 g·kg-1） and blank group （administered with an equal volume of saline）， with ten rats in each group. The medicine was administered once daily for three consecutive days. On the fourth day， two hours after administration， blood was collected from the abdominal aorta and brain tissue was obtained by decapitation. Ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry （UPLC-Q-TOF-MS） was used to analyze the natural products and metabolites in BYHWD， as well as in the serum and brain tissue of normal rats and rats after intragastric administration of BYHWD. Results Ninety natural product components were identified in BYHWD. After intragastric administration of BYHWD to rats， 25 components were found in the serum and ten in the brain tissue， with five components detected in both. Metabolomics analysis revealed that the endogenous differential components in serum primarily involved in eight metabolic pathways， including linoleic acid metabolism， steroid hormone biosynthesis， and phenylalanine metabolism. The endogenous metabolic differential components in the brain tissue were primarily associated with nine metabolic pathways， including retinol metabolism， steroid hormone biosynthesis， and caffeine metabolism. Conclusion By analyzing the natural product components of BYHWD， the differences in components in the serum and brain tissue of rats before and after intragastric administration， and the related metabolic pathways， this study provides a reference for elucidating the active components of BYHWD and its mechanism of action.

〔Keywords〕 Buyang Huanwu Decoction; ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry; metabolomics; natural products; endogenous metabolites

本文引用： 溫夢昕， 李思媛， 劉穎芳， 陳光宇， 謝夢洲， 李" 亮. 基于液質(zhì)及代謝組學方法分析補陽還五湯灌胃大鼠前后血腦中成分差異[J]. 湖南中醫(yī)藥大學學報， 2025， 45（2）： 250-258.

補陽還五湯（Buyang Huanwu Decoction， BYHWD）出自清代名醫(yī)王清任的《醫(yī)林改錯·下卷·癱痿論》，由黃芪、當歸尾、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁7味藥組成，具有補氣活血、祛瘀通絡的作用。黃芪為補藥之長，尤善于補氣，氣旺則血行，祛瘀而不傷正，并助諸藥之力，為君藥;配以當歸活血，有祛瘀而不傷好血之妙，為臣藥;川芎、赤芍、桃仁、紅花助當歸活血祛瘀，地龍通經(jīng)活絡，均為佐使藥。諸藥合用，溫陽行氣，使氣旺血行，瘀祛絡通，諸證自可漸愈。原書[1]記載“此方治半身不遂，口眼[鍋] [口] 斜，語言謇澀，口角流涎，下肢痿廢，小便頻數(shù)，遺尿不禁”。最新研究表明，BYHWD有增強腦部能量代謝，抵抗自由基損傷，促進神經(jīng)修復與再生，抑制神經(jīng)細胞自噬與凋亡，抑制炎癥反應，改善微循環(huán)和促進新血管再生等功效[2-3]。近年來，BYHWD在心腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及糖尿病腎病等多種疾病方面均有良好的治療效果[4-6]。

BYHWD由于其顯著的生物活性及復雜多樣的代謝產(chǎn)物，受到了來自植物化學、有機化學、藥理學、分子生物學等多個領域研究者們的高度關注[7]。中藥的療效是其化學物質(zhì)成分在體內(nèi)傳遞和代謝轉化后生物效應的綜合體現(xiàn)。通常情況下，中藥有效成分需要吸收入血、到達靶器官并作用于相應靶點后才能發(fā)揮藥效作用。代謝組學具有系統(tǒng)性，動態(tài)性的特點，與中醫(yī)學的“整體觀”“辨證觀”相吻合，被廣泛地應用于中藥的作用機制研究。因此，從“藥材成分—入血成分—入腦成分”的傳遞與代謝過程開展研究，對闡明中藥有效成分、實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化具有重要意義。

本研究采用的超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜（ultra-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）技術具有動態(tài)掃描范圍寬、分離性能佳及分辨率和靈敏度高等特點，在天然產(chǎn)物的成分分析以及代謝組學方面具有廣泛的應用[8]。因此，建立此方法分析BYHWD灌胃大鼠前后血腦中成分差異可闡明其發(fā)揮作用的有效成分及參與的主要代謝途徑，為該方作用機制研究提供科學依據(jù)。

1 主要儀器與材料

超高效液相色譜儀-四級桿-飛行時間質(zhì)譜儀（美國ABSCIEXDISTRIBUTION公司）;N-301010L旋轉蒸發(fā)器（日本東京理化）;ZWL-PAI10超純水機（湖南中沃水務環(huán)?？萍迹?HTP-312型300 g-0.01 g-電子天平（上?；ǔ彪娖鳎?TGL18W高速冷凍離心機（長沙英泰儀器有限公司）。

黃芪（批號：23082903），紅花（批號：23100805），川芎（批號：24012304），赤芍（批號：2023102502），當歸尾（批號：20231202），地龍（批號：24032901），桃仁（批號：24012601）以上中藥飲片均購于湖南千金藥材有限公司，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學藥學院王智副教授鑒定為正品，符合《中華人民共和國藥典》[9]要求，水為超純水，甲酸、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

雄性SPF級SD大鼠，體質(zhì)量200～220 g，由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心訂購。動物實驗許可證號：SCXK（湘）2019-0004，質(zhì)量合格證號：430727241

100830714，本實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查通過（倫理審批編號：HUCM21-2311-01）。

2 方法

2.1" BYHWD提取濃縮液的制備

按照BYHWD處方配比（黃芪120 g，當歸尾6 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，地龍3 g，桃仁3 g，紅花3 g）稱取處方量藥材，第1次提取加10倍量水，先冷浸30 min，再加熱回流提取30 min，過濾，對藥渣進行第2次提取加8倍量水，加熱回流提取30 min，合并兩次濾液，60 ℃減壓濃縮（N-3010旋轉蒸發(fā)器，日本東京化學工業(yè)公司），得BYHWD提取濃縮藥液，每1 mL對應2 g藥材，置于4 ℃冰箱冷藏，備用。

2.2" 動物的分組、灌胃及取材

將20只大鼠隨機分為2組，空白組和中藥組各10只。中藥組灌胃BYHWD 25.65 g·kg-1（按照體表面積藥物劑量換算公式[10]計算，相當于70 kg成人劑量的2倍），空白組給予等量生理鹽水。每天給藥1次，連續(xù)給藥3 d，第4天給藥2 h后，用含異氟烷的小型動物氣體麻醉器（GOWE F680，中國長沙林科有限公司）麻醉。固定大鼠后，取腹主動脈取血5 mL，轉入肝素化聚乙烯管，4 000 r/min離心30 min得到血清。拔針后立即斷頭取大鼠腦組織，放入凍存管中。所有樣品立即在-80 ℃的超低溫冰箱中冷凍，以備后續(xù)使用。

2.3" UPLC-Q-TOF-MS分析供試品的制備

取0.2 mL的BYHWD水提濃縮液置于10 mL離心管中，加甲醇至10 mL刻度，渦旋2 min，以12 000 r·min-1離心（TGL18W型高速冷凍離心機，長沙盈泰儀器有限公司）30 min，收集上清液，用0.22 μm微濾膜過濾，得到BYHWD供試液。

精確吸取0.3 mL各血清樣本，轉移至2 mL離心管。加入900 μL乙腈，渦旋2 min，以12 000 r·min-1離心（TGL18W型高速冷凍離心機，長沙盈泰儀器有限公司）30 min，收集上清液，用0.22 μm微濾膜過濾，得到血清供試液。

將腦組織稱重，放入1.5 mL離心管中，離心管中有4個直徑為3 mm的鋼珠，加入3倍體積的生理鹽水。研磨樣品（Bioprep-24R生物樣品均質(zhì)儀，杭州奧晟儀器有限公司，研磨轉速為3 500 r·min-1，升力5.75 m·s-2，研磨時間90 s，間隙時間10 s，8次循環(huán)）12 min。以12 000 r·min-1離心（TGL18W型高速冷凍離心機，長沙盈泰儀器有限公司）30 min。將500 μL上清液移入2 mL離心管中，與900 μL乙腈混合旋轉2 min，以12 000 r·min-1離心（TGL18W型高速冷凍離心機，長沙盈泰儀器有限公司）30 min。收集上清液，用0.22 μm微濾膜過濾，得到血清供試液。

2.4" UPLC-Q-TOF-MS分析供試品中天然產(chǎn)物及內(nèi)源性代謝成分

采用UPLC-Q-TOF-MS（Exion LC AD超高效液相色譜系統(tǒng)與美國AB SCIEX公司生產(chǎn)的X-500R飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用）分析各供試品中天然產(chǎn)物及內(nèi)源性代謝成分。采用Luna Omega-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm， Phenomenex，USA）進行色譜分離。以100%甲醇和含0.1%甲酸（V/V）的超純水分別作為流動相A和B，采用兩步梯度洗脫程序：0～5 min 5%A，5～20 min 5%～100%A，20～24 min 100%A，24～25 min 100%～5%A，25～30 min 5%A。流速設定為0.30 mL·min-1，進樣量10 μL。采用全掃描模式采集高分辨率質(zhì)譜數(shù)據(jù)，質(zhì)荷比范圍為100～1 000（m/z）。利用能量為（35±15） eV的高能碰撞解離獲得了MS/MS碎片。為保證UPLC-Q-TOF-MS工作的穩(wěn)定性，在運行序列中每隔6個樣品進行1個質(zhì)控樣品分析。根據(jù)精確的質(zhì)量（質(zhì)量誤差lt;5 ppm）、MS/MS二級片段和標準品確認，鑒定代謝產(chǎn)物的結構。

3 結果

3.1" UPLC-Q-TOF-MS分析各供試品中天然產(chǎn)物成分差異

在正、負離子模式下對甲醇空白對照、BYHWD藥物、大鼠空白血清、灌胃給藥大鼠血清、大鼠空白腦組織、灌胃給藥大鼠含藥腦組織供試液采集總離子流圖。詳見圖1—2。

3.2 "BYHWD及其含藥血清、含藥腦組織中各類化合物分析

本研究通過UPLC-Q-TOF-MS技術快速分析后從BYHWD復方中發(fā)現(xiàn)90個天然產(chǎn)物成分。采用2.2項下條件對中藥組和對照組血清及腦組織進行分析，結果發(fā)現(xiàn)中藥組血清中相對于空白組血清中多了25個成分，說明這些成分可被吸收入血，即中藥入血成分。而中藥組腦組織中相對于空白組腦組織中多了10個成分，說明這些成分可被吸收入腦，即中藥入腦成分。5個化學成分能同時在BYHWD、入血成分及入腦成分中找到，分別是大豆皂苷Be、黃豆苷元、芒柄花素、毛蕊異黃酮苷以及山柰素。詳見圖3—4。

以上結果顯示，BYHWD及其在大鼠血清和腦組織中的主要成分為黃酮類、糖苷類和酚酸類等。黃酮類化合物主要來源于方中君藥黃芪，檢測出的主要黃酮為毛蕊異黃酮、芒柄花素、山柰酚等。糖苷類成分主要檢測出黃芪甲苷、苦杏仁苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷等。酚酸類成分主要檢測出有阿魏酸、沒食子酸、綠原酸等。

3.3" UPLC-Q-TOF-MS分析各供試品中內(nèi)源性代謝成分差異

采用基于UPLC-Q-TOF-MS的非靶向代謝組學方法，分析BYHWD灌胃大鼠前后血清、腦組織中內(nèi)源性代謝成分差異。在ESI（+）和ESI（-）中，兩個重復QC樣品的高系數(shù)（R2gt;0.99）證明了本研究代謝組學分析的準確性。在ESI（+）和ESI（-）模式下，分別產(chǎn)生了287個和253個離子特征。通過SIMCA 14.1對這些內(nèi)源性代謝物進行PCA分析，結果詳見圖5。

主成分分析結果表明，在正離子和負離子模式下，每組內(nèi)的樣本都表現(xiàn)出很強的聚類性，置信度為95%。值得注意的是，在不同的群體之間有一個明確的劃分。為了更直觀地描述組間差異，在監(jiān)督模式下進行了進一步的OPLS-DA分析，并進行了排列檢驗。詳見圖6。

OPLS-DA分析顯示，空白組和中藥組之間存在明顯的分離，表明由于藥物干預，大鼠血清及腦組織代謝譜發(fā)生了實質(zhì)性變化。在OPLS-DA模型中，空白組和中藥組之間的大鼠血清代謝物和腦組織代謝物存在顯著差異。模型對數(shù)據(jù)的解釋能力用R2和Q2值表示，在正離子模式下，R2x=0.568，R2y=0.926，Q2=0.978;在負離子模式下，R2x=0.607，R2y=0.932，Q2=0.956，具有一定的預測能力。

OPLS-DA的200次置換檢驗表明，Q2值均位于統(tǒng)一線以下，且Q2在縱軸上的回歸線呈現(xiàn)負截距，不存在過擬合，預測能力較強。

以VIPgt;1.0、FClt;0.8或gt;1.2、Plt;0.05為標準，采用OPLS-DA模型鑒定差異代謝物;隨后，生成火山圖。詳見圖7—8。

通過查詢HMDB等數(shù)據(jù)庫并整合次級片段離子數(shù)據(jù)，將鑒定出的差異代謝物與空白組和中藥組的內(nèi)源性代謝物進行比較。分析發(fā)現(xiàn)，在血清中，中藥組顯著下調(diào)173種代謝物，上調(diào)96種代謝物，而在腦組織中，中藥組顯著下調(diào)133種代謝物，上調(diào)127種代謝物。中藥組與空白組灌胃大鼠在血清中與269各個內(nèi)源性代謝成分有差異，在腦組織中與256各個內(nèi)源性代謝成分上有差異。

血清和腦組織內(nèi)源性代謝差異成分的數(shù)據(jù)分別通過MetaboAnalyst網(wǎng)站進行相關代謝途徑分析。與空白組相比，BYHWD影響血清8條代謝途徑，包括亞油酸代謝、類固醇激素生物合成、苯丙氨酸代謝、丁酸代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、甘油酯類代謝、視黃醇代謝等。受BYHWD影響的腦組織代謝途徑有9條，包括視黃醇代謝，類固醇激素生物合成，咖啡因代謝，亞油酸代謝，酪氨酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，苯丙氨酸代謝，甘油磷脂代謝，色氨酸代謝。詳見圖9。

4 討論

通過對BYHWD及其含藥血清、含藥腦組織中各類成分分析發(fā)現(xiàn)有5種天然產(chǎn)物成分可以同時在BYHWD及入血成分、入腦成分中找到。分別是大豆皂苷Be、黃豆苷元、芒柄花素、毛蕊異黃酮苷以及山柰素。有研究發(fā)現(xiàn)，大豆皂苷具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫力、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、保護肝臟等多種生理活性[11]。黃豆苷元可調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1信號通路，延緩細胞衰老，增強細胞抗氧化能力，抑制細胞氧化應激[12]，同時可結合細胞內(nèi)雌激素受體或直接刺激激活細胞內(nèi)相關基因表達，發(fā)揮抗癌、抗高血壓和抗神經(jīng)元病變等功能[13]。毛蕊異黃酮苷和芒柄花素為黃芪中主要代表成分，具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗突變、抗腫瘤、抗心肌缺血、防止動脈粥樣硬化、抗炎、抗心律失常、抗病毒、抗細胞凋亡等作用[14]。山柰素具有多種生物活性，包括抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒以及抗光老化等活性[15]，在肺癌、胃潰瘍及糖脂代謝的相關疾病中也發(fā)揮出有利的作用[16-19]。因此，上述5種成分可被視為BYHWD發(fā)揮藥效的關鍵成分，值得作為重點研究對象進行深入探究。

通過非靶向代謝組學方法對BYHWD灌胃大鼠后在血清和腦組織中的差異代謝物及通路進行研究，結果發(fā)現(xiàn)與腦組織相比，血清對半胱氨酸和蛋氨酸代謝、丁酸代謝和乙醛酸和二羧酸代謝等途徑有影響。相反，與血清相比，腦組織在丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝、咖啡因代謝、酪氨酸代謝和色氨酸代謝等方面表現(xiàn)出影響。

半胱氨酸和蛋氨酸是重要的含硫氨基酸，參與蛋白質(zhì)合成、抗氧化防御和甲基化反應，半胱氨酸與蛋氨酸、賴氨酸等其他氨基酸之間存在互作效應，其適宜比例可對生產(chǎn)性能、蛋白質(zhì)合成及轉化效率等方面產(chǎn)生積極的影響[20]。目前，已發(fā)現(xiàn)半胱氨酸可促進氨基酸代謝，并具有解毒抗菌和保護腸道的功效，是影響動脈粥樣硬化、腎上腺嗜鉻細胞瘤等疾病的主要代謝通路之一[21-22]。丁酸是一種短鏈脂肪酸，主要由腸道微生物產(chǎn)生，經(jīng)門靜脈進入血液，抑制組蛋白脫乙酰酶和調(diào)節(jié)細胞代謝對許多基因表達的強大調(diào)節(jié)作用[23-24]。研究發(fā)現(xiàn)，丁酸可通過影響炎性反應、脂質(zhì)代謝、氧化應激、腸道功能屏障等途徑影響心血管疾病發(fā)生。并在動脈粥樣硬化、心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、高血壓等疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要保護作用[25]。乙醛酸和二羧酸代謝過程涉及多種有機酸的轉化，可影響腸道微生物菌群和糖代謝，和能量代謝、脂質(zhì)代謝過程密切相關[26]。BYHWD對這些代謝途徑的影響可能有助于維持機體的抗氧化狀態(tài)和甲基化平衡，同時對腸道健康和能量代謝有積極影響，并在能量供應和脂肪酸的代謝調(diào)節(jié)方面發(fā)揮作用。

丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝是重要的神經(jīng)遞質(zhì)和能量代謝中間產(chǎn)物，研究發(fā)現(xiàn)該代謝途徑是神經(jīng)退化、抑郁癥、心肌缺血、肝癌等疾病中的潛在靶點[27-30]?？Х纫蚴且环N中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑，通過阻斷腺苷受體發(fā)揮作用?？Х纫蝮w內(nèi)代謝過程復雜，適度使用咖啡因可興奮神經(jīng)，在神經(jīng)退行性疾病中起到保護作用[31]，而大劑量或長期使用咖啡因可引起驚厥、肝腎損傷、呼吸道炎癥等疾病[32]。酪氨酸是合成兒茶酚胺的重要前體，酪氨酸降解途徑在動物中必不可少，若中斷將導致嚴重的代謝疾病。已有研究表明酪氨酸及其代謝產(chǎn)物與早期癌癥及神經(jīng)學改變具有重要關聯(lián)性[33-35]。BYHWD對這些代謝途徑的影響可能與神經(jīng)傳遞、神經(jīng)保護和能量代謝有關，同時也可能影響神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性和認知功能，以及神經(jīng)遞質(zhì)的合成。因此推斷BYHWD可通過入血參與抗氧化防御、能量代謝和脂肪酸代謝等途徑。同時可通過入腦發(fā)揮神經(jīng)傳遞、神經(jīng)保護和情緒調(diào)節(jié)等作用。

本研究雖然已篩選出BYHWD及入血入腦的主要天然產(chǎn)物成分及相關代謝通路但因其針對的疾病較多且病因復雜，僅采用液質(zhì)及非靶向代謝組學得出的結果缺乏特征性和專屬性，難以全面闡釋其作用機制，在后續(xù)的研究過程中，可以利用液質(zhì)及靶向代謝組學深入探究BYHWD干預各類疾病的確切機制。

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（本文編輯" 蘇" 維）