〔摘要〕 目的 探討捏脊療法干預(yù)孤獨(dú)癥譜系障礙（ASD）模型大鼠對其前額葉、海馬及小腦區(qū)域中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）表達(dá)的影響。方法 將ASD模型大鼠隨機(jī)分為模型組、捏脊組，每組6只;同時(shí)隨機(jī)選取6只正常大鼠為空白組。捏脊組在大鼠23日齡開始捏脊療法，21次/d，連續(xù)干預(yù)28 d;空白組和模型組僅模擬抓取和固定。干預(yù)結(jié)束次日完成曠場實(shí)驗(yàn)，記錄活動(dòng)行為數(shù)據(jù)（總路程、站立次數(shù)、理毛次數(shù)），并于曠場實(shí)驗(yàn)次日取材。采用免疫組織化學(xué)法和Western blot檢測前額葉、海馬和小腦區(qū)域中BDNF及CREB蛋白表達(dá)。結(jié)果 與空白組相比，模型組活動(dòng)總路程增長、站立次數(shù)減少、理毛次數(shù)增多（Plt;0.01）;與模型組相比，捏脊組活動(dòng)總路程減少、站立次數(shù)增加、理毛次數(shù)減少（Plt;0.05）。與空白組比較，模型組前額葉區(qū)、海馬區(qū)、小腦區(qū)BDNF、CREB蛋白表達(dá)均減少（Plt;0.05，Plt;0.01）;與模型組比較，捏脊組前額葉區(qū)、海馬區(qū)、小腦區(qū)BDNF、CREB蛋白表達(dá)均增加（Plt;0.05，Plt;0.01）。與空白組相比，模型組前額葉區(qū)、海馬區(qū)、小腦區(qū)BDNF、CREB蛋白陽性平均光密度均減少（Plt;0.05，Plt;0.01）;與模型組相比，捏脊組前額葉區(qū)、海馬區(qū)、小腦區(qū)BDNF、CREB蛋白陽性平均光密度均增加（Plt;0.05，Plt;0.01）。結(jié)論 捏脊療法能夠有效改善ASD大鼠的行為表征，其作用機(jī)制可能與上調(diào)ASD大鼠前額葉、海馬、小腦區(qū)的BDNF、CREB蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 孤獨(dú)癥譜系障礙;捏脊;督脈;多腦區(qū);腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子;環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白;腦神經(jīng)發(fā)育

〔中圖分類號(hào)〕R244.1"""""""" 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A""""""""" 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.02.009

〔收稿日期〕2024-07-11

〔基金項(xiàng)目〕國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（81704194）;福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2022J01366）;福建省財(cái)政廳教育和科研專項(xiàng)項(xiàng)目（x2020002-財(cái)政專項(xiàng)）;福建省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)項(xiàng)目（2023R1003006）。

〔通信作者〕*林麗莉，女，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：438488409@qq.com。

Effects of spine-pinching manipulation on protein expressions of BDNF and CREB in different brain regions of autistic spectrum disorder rats

TANG Qing1， HONG Yanling1， SU Lihong1， GUO Ronghui1， LIN Lili1，2*

1. School of Acupunctureamp;Moxibustion and Tuina， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou， Fujian 350122， China; 2. Fujian Academy of Chinese Medical Sciences， Fuzhou， Fujian 350001， China

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of spine-pinching manipulation on the expressions of brain derived neurotrophic factor （BDNF） and cyclic adenosine phosphate response element binding protein （CREB） in the prefrontal， hippocampal， and cerebellar regions of autism spectrum disorder （ASD） model rats. Methods The model rats with ASD were randomly divided into model group and spine-pinching manipulation group， with six rats in each group. Additionally， six normal rats were randomly selected as blank group. The spine-pinching manipulation group received spine-pinching manipulation starting from postnatal day 23， 21 times/day， for a continuous intervention of 28 days. The blank and model groups underwent simulated grasping and fixing only. The open field test was conducted the day after the intervention ended， and the activity behavior data （total distance， standing times， and grooming times） were recorded， and the samples were collected on the day after the open field test. The protein expressions of BDNF and CREB in the prefrontal， hippocampus， and cerebellar regions were checked by immunohistochemistry and Western blot. Results Compared with the blank group， the total distance of activity increased， standing times decreased， and grooming times increased in the model group （Plt;0.01）. Compared with the model group， the total distance of activity in spine-pinching manipulation group decreased， the standing times increased， and the grooming times decreased （Plt;0.05）. Compared with the blank group， the protein expressions of BDNF and CREB in the prefrontal， hippocampus， and cerebellar regions were lower in the model group （Plt;0.05， Plt;0.01）. Compared with the model group， the protein expressions of BDNF and CREB in the prefrontal， hippocampus， and cerebellar regions of the spine-pinching manipulation group increased （Plt;0.05， Plt;0.01）. Compared with the blank group， the average optical density of BDNF and CREB proteins in the prefrontal， hippocampus， and cerebellar regions of the model group decreased （Plt;0.05， Plt;0.01）. Compared with the model group， the average optical density of BDNF and CREB proteins in the prefrontal， hippocampus， and cerebellar regions of the spine-pinching manipulation group increased （Plt;0.05， Plt;0.01）. Conclusion Spine-pinching manipulation can effectively improve the behavioral characteristics of ASD rats， and its mechanism of action may be related to the upregulation of BDNF and CREB protein expressions in the prefrontal， hippocampus， and cerebellar regions of ASD rats.

〔Keywords〕 autism; spine-pinching manipulation; Du meridian; multiple brain regions; brain derived neurotrophic factor; cyclic adenosine phosphate response element binding protein; cranial nerve development

本文引用： 唐" 青， 洪燕玲， 蘇麗紅， 郭榕蕙， 林麗莉. 捏脊療法對孤獨(dú)癥譜系障礙大鼠不同腦區(qū)BDNF及CREB蛋白表達(dá)的影響[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2025， 45（2）： 259-266.

孤獨(dú)癥譜系障礙（autism spectrum disorder， ASD），又名孤獨(dú)癥，其患者具有不同程度社交障礙、溝通缺陷、狹隘興趣及刻板行為的核心特征，是一種廣泛性發(fā)育障礙，也是結(jié)合現(xiàn)代心理學(xué)、神經(jīng)病學(xué)等相關(guān)科學(xué)的一個(gè)綜合性疾病[1]。近代腦科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，ASD患兒存在小腦、海馬、皮質(zhì)等多個(gè)腦區(qū)的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor， BDNF）、環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein， CREB）表達(dá)異常[2]。其中，BDNF是關(guān)鍵的神經(jīng)營養(yǎng)因子，對神經(jīng)元軸突和樹突生長、突觸可塑性、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知功能等具有重要的調(diào)節(jié)作用[3]。CREB是BDNF介導(dǎo)基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，BDNF通過與其特異性受體TrkB結(jié)合，引發(fā)受體的磷酸化反應(yīng)，進(jìn)而激活一系列第二信使傳導(dǎo)通路，這些通路最終指向CREB的激活，激活的CREB對受損神經(jīng)元的修復(fù)過程起著促進(jìn)作用，有助于改善神經(jīng)細(xì)胞病理狀態(tài)，并加速神經(jīng)功能缺損的恢復(fù)進(jìn)程[4]。兩者在ASD患兒大腦神經(jīng)發(fā)育過程中的異常，影響患兒的認(rèn)知與行為功能[5-6]。

捏脊療法最早見于《肘后備急方·治卒腹痛方第九》記載：“拈取其脊骨皮深取痛引之，從龜尾至頂，乃止，未愈更為之?！逼洫?dú)特之處在于醫(yī)者運(yùn)用捏、拿、提等一系列手法刺激背部督脈及兩側(cè)膀胱經(jīng)。其中，督脈“上至風(fēng)府，入屬于腦”，又為“陽脈之?！?，主導(dǎo)全身陽氣運(yùn)行，又為滋養(yǎng)腦髓、充盈髓海的重要通道，膀胱經(jīng)與督脈交于頭頂，其分支“從巔入絡(luò)腦”，更有諸五臟六腑之背俞穴分布于背側(cè)膀胱經(jīng)。故捏脊療法具有調(diào)理臟腑陰陽、行氣和血、培固元?dú)?、通督榮腦等功效，是目前臨床治療小兒腦病常用的中醫(yī)外治手法之一[7]。團(tuán)隊(duì)前期研究表明，捏脊療法對ASD大鼠的社交及重復(fù)刻板樣行為等具有明顯的改善效果[8]，且發(fā)現(xiàn)捏脊療法可上調(diào)ASD大鼠海馬區(qū)神經(jīng)可塑性的相關(guān)蛋白[9]，但尚未研究該療法對多個(gè)相關(guān)腦區(qū)的同步影響。故本研究通過進(jìn)一步監(jiān)測抗癲癇藥丙戊酸鈉（sodium valproate， VPA）誘導(dǎo)的ASD模型大鼠前額葉、海馬及小腦3個(gè)腦區(qū)中BDNF、CREB蛋白表達(dá)以及其行為學(xué)變化，探討捏脊療法改善ASD大鼠行為表征的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1" 動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)選取6～8周齡、SPF級(jí)的Wistar大鼠作為實(shí)驗(yàn)對象，雌雄各15只，雌性體質(zhì)量范圍為180～230 g，雄性體質(zhì)量為250～300 g，均購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（閩）2019-0007，喂養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物飼養(yǎng)條件：恒定溫度（22 ℃）、濕度（50%），采用12 h光照與12 h黑暗的交替照明制度，自由攝食與飲水，普通飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)已通過福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：2022-185）。

1.2" 主要試劑與儀器

VPA（美國Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：P4543）;即用型SABC-POD（小鼠/兔IgG）免疫組織化學(xué)染色試劑盒、DAB顯色試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：SA1020、AR1027-3、AR1191）;BCA蛋白定量試劑盒、PAGE凝膠快速制備試劑盒（上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：P0010、PG112）;一抗BDNF（美國Abcam公司，批號(hào)：Ab108319）;一抗CREB、一抗BDNF、山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：28792-1-AP、HZ-1335、SA0001-1、SA0001-2）。

曠場實(shí)驗(yàn)檢測系統(tǒng)（上海欣軟信息科技有限公司，型號(hào)：XR-XJ1117）;生物組織自動(dòng)脫水機(jī)（亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司，型號(hào)：ZT-14S1）;石蠟切片機(jī)、倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司，型號(hào)：BIOCUT、DMI8）;多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司，型號(hào)：Multifunctional Enzyme Marker）;電泳儀、ChemiDocTM成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司，型號(hào)：Mini-PROTEAN、ChemiDoc XRS+）。

1.3" 模型制備與分組

ASD大鼠模型制備參考SCHNEIDER等[10]所采用的方法。將雌雄大鼠按照1∶1比例進(jìn)行配對合籠，次日清晨對雌鼠進(jìn)行檢查，一旦發(fā)現(xiàn)陰道栓脫落，記為孕0.5 d，并立即將雌鼠與雄鼠分開單獨(dú)飼養(yǎng)。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法，將全部孕鼠隨機(jī)分配至造模組與空白對照組。造模組孕鼠于孕期第12.5天腹腔注射VPA溶液，劑量為600 mg/kg，對出生后的VPA模型仔鼠進(jìn)行一系列發(fā)育行為學(xué)檢測（體質(zhì)量、睜眼時(shí)間、方向趨向性功能測試、足底熱痛試驗(yàn)、游泳試驗(yàn)），篩選出符合ASD特征的個(gè)體。而空白對照組孕鼠于同期接受等體積生理鹽水注射，其產(chǎn)出的正常仔鼠作為空白對照。篩選合格的VPA模型仔鼠，利用隨機(jī)數(shù)字表法平均分配至模型組和捏脊組，每組6只。同時(shí)，隨機(jī)選取6只正常仔鼠作為空白組。

1.4" 干預(yù)方法

捏脊療法干預(yù)需兩名實(shí)驗(yàn)人員參與，具體操作步驟為：實(shí)驗(yàn)者A佩戴毛線手套以固定仔鼠頭部，而實(shí)驗(yàn)者B則參照臨床捏脊療法的操作規(guī)范，以雙手拇指與食指指腹相對施力，自仔鼠尾根部沿脊中線向上捏提至大椎穴處（大鼠大椎穴位于后背正中第7頸椎與第1胸椎之間，參照唐勇主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[11]確定），此為1次捏脊操作。此過程需重復(fù)進(jìn)行21遍，自第3遍起，每捏3次提1次?？瞻捉M和模型組僅模擬抓取固定，不進(jìn)行捏脊療法。干預(yù)療程為28 d。

1.5" 曠場實(shí)驗(yàn)

干預(yù)完成后進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)。曠場箱為規(guī)格70 cm×70 cm×40 cm的黑色方形箱，確保實(shí)驗(yàn)環(huán)境光線為80～100 lux且無背景噪音干擾。實(shí)驗(yàn)箱上方設(shè)置相機(jī)進(jìn)行錄像。實(shí)驗(yàn)開始前，將待測大鼠提前1 h送入實(shí)驗(yàn)室以適應(yīng)環(huán)境，選擇大鼠非活躍時(shí)段（8：00—16：00）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，將單只待測大鼠置于曠場箱指定位置后，記錄大鼠5 min在曠場箱內(nèi)的活動(dòng)行為數(shù)據(jù)（包括總路程、站立次數(shù)、理毛次數(shù)）。

1.6" 取材

曠場實(shí)驗(yàn)后次日進(jìn)行取材。通過腹腔注射濃度為0.3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）對大鼠進(jìn)行麻醉，麻醉后沿腹中線剖開胸腔，以充分暴露心臟。隨后剪開右心耳，用生理鹽水緩慢灌注左心室，直至血液完全沖凈，肺部及其他內(nèi)臟呈現(xiàn)蒼白。斷頭后剝離顱骨，使全腦得以充分顯露，從嗅球部位將全腦完整剝離。最后將全腦沿中線一分為二：一半置入提前預(yù)冷好的4%多聚甲醛中固定24～36 h，待進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測;另一半則使用鑷子鈍性分離出海馬組織，利用手術(shù)刀片切取前額葉與小腦組織，迅速將組織樣本轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱冷凍。

1.7" 指標(biāo)檢測

1.7.1" 免疫組織化學(xué)法" 對組織進(jìn)行梯度脫水、透明、透蠟、包埋、切片、撈片、攤片和烤片。將完成包埋的蠟塊取出進(jìn)行切片，厚度為4 μm。再依次放入二甲苯Ⅰ（15 min）、二甲苯Ⅱ（15 min）、100%乙醇Ⅰ（5 min）、100%乙醇Ⅱ（5 min）、95%乙醇（5 min）、80%乙醇（5 min）、70%乙醇（5 min）、純水（5 min）進(jìn)行脫蠟復(fù)水。接著浸入檸檬酸鈉溶液中，加蓋密封，加熱至沸騰狀態(tài)20～25 min后，取出冷卻至室溫，以PBS溶液清洗3次，每次5 min。滴加3%內(nèi)源性過氧化物酶溶液孵育，結(jié)束后PBS溶液清洗3次，每次5 min。后于37 ℃烘箱孵育載玻片20～30 min，同時(shí)滴加非特異性染色阻斷劑。配制一抗（BDNF 1∶400、CREB 1∶400），滴至載玻片上后放入4 ℃冰箱中孵育過夜。次日于37 ℃恒溫箱中復(fù)溫1 h，使用PBS溶液清洗3次，每次5 min。此后，滴加生物素標(biāo)記的羊抗小鼠/兔IgG聚合物，室溫孵育30 min，再次用PBS溶液清洗3次，每次5 min。最后，滴加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物，于室溫下孵育30 min，用PBS溶液清洗3次，每次5 min。采用DAB染色法，配制顯色液，顯色完成后放入純水中終止染色，后用蘇木素復(fù)染、自來水反藍(lán)。將切片經(jīng)80%乙醇（3 min）、95%乙醇（3 min）、100%乙醇Ⅰ（3 min）、二甲苯Ⅰ（3 min）、二甲苯Ⅱ（3 min）脫水，封片。最后使用光學(xué)顯微鏡拍攝，采用Image J軟件計(jì)算平均光密度。

1.7.2" Western blot檢測" 以Western blot檢測大鼠前額葉、海馬、小腦組織區(qū)域中BDNF、CREB蛋白的相對表達(dá)量。6只大鼠前額葉、海馬、小腦組織分別加入對應(yīng)體積的裂解液，充分研磨勻漿，取上清液。BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)所測得的蛋白濃度值制備凝膠，上樣后按10 V電泳20 min、80 V電泳15～20 min（跑完濃縮膠）、120 V電泳30～40 min（跑分離膠）的順序進(jìn)行電泳，恒流400 mA轉(zhuǎn)膜20～40 min，封閉15～20 min后孵育一抗（BDNF 1∶2 000、CREB 1∶12 000），再收入4 ℃冰箱中孵育過夜?；厥找豢购笥肨BST溶液洗滌5 min，重復(fù)3次。接著加二抗試劑（兔抗1∶5 000、鼠抗1∶2 000）孵育1 h，結(jié)束后用TBST溶液洗滌5 min，重復(fù)3次。最后采用Image J圖像分析軟件分析各條帶的平均吸光度。

1.8" 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用“x±s”進(jìn)行表述。對于符合正態(tài)性的數(shù)據(jù)采取單因素方差分析分析，方差齊者采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者采用Games Howell檢驗(yàn);不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)分析。以Plt;0.05判定差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1" 3組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果

與空白組相比，模型組活動(dòng)總路程出現(xiàn)顯著增長（Plt;0.01）、理毛次數(shù)顯著增多（Plt;0.01）、站立次數(shù)顯著減少（Plt;0.01）;與模型組相比，捏脊組活動(dòng)總路程減少（Plt;0.05）、理毛次數(shù)減少（Plt;0.05）、站立次數(shù)增多（Plt;0.05）。詳見表1。

2.2" 3組大鼠腦組織BDNF、CREB蛋白免疫組織化學(xué)結(jié)果

2.2.1" 3組大鼠前額葉區(qū)BDNF、CREB蛋白結(jié)果

與空白組相比，模型組前額葉區(qū)BDNF、CREB蛋白陽性平均光密度顯著減少（Plt;0.01）;與模型組相比，捏脊組前額葉區(qū)BDNF、CREB蛋白陽性平均光密度顯著增多（Plt;0.01）。詳見表2、圖1。

2.2.2" 3組大鼠海馬區(qū)BDNF、CREB蛋白結(jié)果" 與空白組比較，模型組海馬區(qū)BDNF、CREB蛋白陽性平均光密度顯著減少（Plt;0.01）;與模型組比較，捏脊組海馬區(qū)BDNF、CREB蛋白陽性平均光密度增多（Plt;0.05，Plt;0.01）。詳見表3、圖2。

2.2.3" 3組大鼠小腦區(qū)BDNF、CREB蛋白結(jié)果" 與空白組比較，模型組小腦區(qū)BDNF、CREB蛋白陽性平均光密度減少（Plt;0.05，Plt;0.01）;與模型組比較，捏脊組小腦區(qū)BDNF、CREB蛋白陽性平均光密度顯著增多（Plt;0.01）。詳見表4、圖3。

2.3" 3組大鼠腦組織BDNF、CREB蛋白Western blot檢測結(jié)果

2.3.1" 3組大鼠前額葉區(qū)BDNF、CREB蛋白結(jié)果

與空白組比較，模型組前額葉區(qū)BDNF、CREB蛋白表達(dá)水平減少（Plt;0.05）;與模型組比較，捏脊組前額葉區(qū)BDNF、CREB蛋白表達(dá)水平增多（Plt;0.05，Plt;0.01）。詳見表5、圖4。

2.3.2" 3組大鼠海馬區(qū)BDNF、CREB蛋白結(jié)果" 與空白組比較，模型組海馬區(qū)BDNF、CREB蛋白表達(dá)減少（Plt;0.05）;與模型組比較，捏脊組海馬區(qū)BDNF、CREB蛋白表達(dá)增多（Plt;0.05，Plt;0.01）。詳見表6、圖5。

2.3.3" 3組大鼠小腦區(qū)BDNF、CREB蛋白結(jié)果" 與空白組比較，模型組小腦區(qū)BDNF、CREB蛋白表達(dá)減少（Plt;0.05，Plt;0.01）;與模型組比較，捏脊組小腦區(qū)BDNF、CREB蛋白表達(dá)增多（Plt;0.05，Plt;0.01）。詳見表7、圖6。

3 討論

中醫(yī)學(xué)病名中無“孤獨(dú)癥”，其相關(guān)癥狀可見于“童昏”“無慧”“胎弱”等范疇。ASD之病機(jī)可析為本與標(biāo)兩層：本者，源自先天之不足，腦髓失于濡養(yǎng);標(biāo)者，系因肝氣失于調(diào)暢，氣血虧虛，加之腦絡(luò)瘀阻、痰濁等病理產(chǎn)物蒙蔽神明所致[11]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，ASD屬于神經(jīng)發(fā)育障礙，發(fā)病的復(fù)雜性涉及遺傳、環(huán)境及心理等多元因素的綜合作用[12]。而現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，ASD患兒行為異常與其不同腦區(qū)的神經(jīng)生物學(xué)變化有關(guān)，例如海馬、前額葉皮質(zhì)、小腦等[13]。團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，捏脊療法可明顯改善ASD大鼠的社交及重復(fù)刻板樣行為[8]，并可調(diào)節(jié)其海馬區(qū)神經(jīng)可塑性[9]。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步探究捏脊療法對ASD大鼠多個(gè)出現(xiàn)異常變化腦區(qū)的同步影響作用。

VPA誘導(dǎo)的ASD模型大鼠存在較高的構(gòu)建效度及可重復(fù)性，與ASD患兒的神經(jīng)生物學(xué)以及臨床表型存在高度相似性，是目前較為成熟的ASD動(dòng)物模型[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，模型組活動(dòng)總路程出現(xiàn)顯著增長、理毛次數(shù)顯著增多、站立次數(shù)顯著減少;與模型組相比，捏脊組活動(dòng)總路程減少、理毛次數(shù)減少、站立次數(shù)增多。這一發(fā)現(xiàn)提示，捏脊療法能夠促進(jìn)ASD模型大鼠對新環(huán)境的探索欲望，減少其刻板行為的發(fā)生，并有助于減輕焦慮狀態(tài)。這些結(jié)果進(jìn)一步支持了捏脊療法在改善ASD相關(guān)行為癥狀方面的潛在作用。

BDNF作為腦內(nèi)豐富且功能多樣的神經(jīng)營養(yǎng)因子，通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)和細(xì)胞信號(hào)通路，指導(dǎo)神經(jīng)元沿著特定譜系分化，形成具有特定功能的成熟神經(jīng)元，不僅促進(jìn)軸突生長、樹突分支形成，還參與突觸的形成與成熟，在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與功能整合、神經(jīng)保護(hù)功能以及神經(jīng)元生長發(fā)育過程中扮演著核心角色[15]。大量研究證據(jù)揭示，ASD患兒體內(nèi)BDNF的表達(dá)存在異?，F(xiàn)象[16]，具體表現(xiàn)為ASD患兒血液中BDNF水平的顯著下降[17]。在ASD動(dòng)物模型，尤其是大鼠模型中，同樣觀察到多個(gè)腦區(qū)BDNF表達(dá)量的顯著降低[18-19]。而BDNF基因敲除小鼠模型的研究進(jìn)一步證實(shí)，BDNF缺乏會(huì)導(dǎo)致異常突觸的發(fā)生，進(jìn)而影響模型小鼠的認(rèn)知與行為功能[5]。CREB作為重要的核轉(zhuǎn)錄因子，是不同通路最后共同作用的蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控中承擔(dān)核心角色，作為繼發(fā)于外源性刺激的信號(hào)蛋白能應(yīng)激表達(dá)[20]，其生理功能在各系統(tǒng)中均有廣泛表現(xiàn)，并參與介導(dǎo)了腦神經(jīng)的保護(hù)作用[21]。研究證明，抑制BDNF-CREB信號(hào)傳導(dǎo)可能與圍產(chǎn)期暴露于BDE-47和/或VPA引起的樹突狀損傷以及隨之而來的ASD樣行為有關(guān)[22]。CREB作為BDNF的轉(zhuǎn)錄激活因子，屬于BDNF-ERK-CREB分子信號(hào)級(jí)聯(lián)通路下游，該信號(hào)通路與ASD發(fā)病的生物學(xué)機(jī)制密切相關(guān)[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VPA誘導(dǎo)的ASD大鼠前額葉、海馬、小腦區(qū)域中均觀察到BDNF與CREB蛋白表達(dá)水平的顯著下降，這一現(xiàn)象提示這些腦區(qū)內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放在這個(gè)過程中受到抑制，導(dǎo)致突觸間信息傳遞功能受損，神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育異常，進(jìn)而引發(fā)一系列行為功能障礙。

BDNF廣泛分布在哺乳動(dòng)物的海馬、大腦皮質(zhì)和小腦等區(qū)域，其中海馬與大腦皮質(zhì)中的BDNF濃度尤為顯著[24]。對于神經(jīng)系統(tǒng)疾病，針刺可以同時(shí)促進(jìn)大腦海馬、皮質(zhì)及小腦等區(qū)域中BDNF的表達(dá)量，經(jīng)由不同通路最后共同作用于CREB，使其磷酸化，從而促進(jìn)神經(jīng)再生，并在多個(gè)腦區(qū)中產(chǎn)生效應(yīng)，其機(jī)制可能與調(diào)控BDNF/CREB信號(hào)途徑關(guān)鍵分子的表達(dá)與功能有關(guān)，促進(jìn)神經(jīng)元的恢復(fù)而發(fā)揮干預(yù)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的作用[25]?？紤]到團(tuán)隊(duì)前期研究主要聚焦于海馬區(qū)[9，21，26]，本研究擴(kuò)大了觀察范圍，納入前額葉和小腦區(qū)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ASD模型大鼠經(jīng)過捏脊療法干預(yù)后，其前額葉、海馬、小腦區(qū)的BDNF與CREB蛋白表達(dá)均上調(diào)，提示捏脊療法能有效地對多個(gè)腦區(qū)神經(jīng)可塑性相關(guān)蛋白產(chǎn)生積極影響。

綜上所述，捏脊療法作為一種非藥物干預(yù)手段，展現(xiàn)出對ASD大鼠重復(fù)刻板行為及焦慮癥狀的改善潛力，這一作用機(jī)制可能與捏脊療法引發(fā)的特定腦區(qū)生物標(biāo)志物上調(diào)有關(guān)，即前額葉、海馬、小腦區(qū)域內(nèi)BDNF、CREB等關(guān)鍵蛋白含量的提升。本研究的局限性在于捏脊療法干預(yù)采用人工手法進(jìn)行，忽略了捏脊療法的力度、刺激強(qiáng)度等規(guī)范化問題，有待后續(xù)研究進(jìn)一步規(guī)范與標(biāo)準(zhǔn)化。

參考文獻(xiàn)

[1] 鄧明昱， 勞世艷. 自閉癥譜系障礙的臨床研究新進(jìn)展（DSM-5新標(biāo)準(zhǔn)）[J]. 中國健康心理學(xué)雜志， 2016， 24（4）： 481-490.

[2] 劉" 紐， 熊" 信， 薛亞奇， 等. 認(rèn)知功能障礙： 運(yùn)動(dòng)、孤獨(dú)癥和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的相互作用[J]. 生物學(xué)雜志， 2024， 41（4）： 94-101.

[3] REIM D， SCHMEISSER M J. Neurotrophic factors in mouse models of autism spectrum disorder： Focus on BDNF and IGF-1[J]. Advances in Anatomy， Embryology， and Cell Biology， 2017， 224： 121-134.

[4] 曾" 端， 于文娟， 李華芳. 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及相關(guān)通路在抗抑郁藥中的研究進(jìn)展[J]. 臨床精神醫(yī)學(xué)雜志， 2017， 27（5）： 347-350.

[5] POZZO-MILLER L D， GOTTSCHALK W， ZHANG L， et al. Impairments in high-frequency transmission， synaptic vesicle docking， and synaptic protein distribution in the hippocampus of BDNF knockout mice[J]. The Journal of Neuroscience， 1999， 19（12）： 4972-4983.

[6] TYLER W J， POZZO-MILLER L D. BDNF enhances quantal neurotransmitter release and increases the number of docked vesicles at the active zones of hippocampal excitatory synapses[J]. The Journal of Neuroscience， 2001， 21（12）： 4249-4258.

[7] 楊" 蕾， 李" 靜. 捏脊在兒科疾病中的臨床應(yīng)用進(jìn)展[J]. 中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)， 2021， 27（3）： 164-166， 170.

[8] 龔夢華， 吳倩雯， 李一純， 等. 捏脊療法對自閉癥模型大鼠焦慮樣行為及NF-κB通路的影響[J]. 云南中醫(yī)中藥雜志， 2023， 44（4）： 81-85.

[9] 吳倩雯. 捏脊對自閉癥模型大鼠海馬NF-κB信號(hào)通路的影響[D]. 福州： 福建中醫(yī)藥大學(xué)， 2020.

[10] SCHNEIDER T， PRZEW?OCKI R. Behavioral alterations in rats prenatally exposed to valproic acid： Animal model of autism[J]. Neuropsychopharmacology， 2005， 30（1）： 80-89.

[11] 唐" 勇. 實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[M]. 3版. 上海： 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社， 2021： 146.

[12] 郝宏文， 劉" 奕， 衛(wèi)" 利， 等. 王素梅治療兒童自閉癥經(jīng)驗(yàn)[J]. 中醫(yī)雜志， 2016， 57（1）： 19-21.

[13] 南" 潔， 崔軍武， 董效軍， 等. 自閉癥研究動(dòng)向綜述[J]. 系統(tǒng)醫(yī)學(xué)， 2018， 3（11）： 187-189.

[14] MORIMOTO M， HASHIMOTO T， TSUDA Y， et al. Assessment of oxidative stress in autism spectrum disorder using reactive oxygen metabolites and biological antioxidant potential[J]. PLoS One， 2020， 15（5）： e0233550.

[15] 吳" 吉， 郝興宇， 葉" 勇， 等. 基于BDNF/TrkB/CREB通路研究六味地黃丸對丙戊酸鈉誘導(dǎo)的孤獨(dú)癥譜系障礙模型仔鼠的作用機(jī)制[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2024， 44（2）： 176-184.

[16] 楊恩璐， 孫秉貴. BDNF及其下游通路與GABA能神經(jīng)元發(fā)育相關(guān)性的研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué)， 2020， 32（6）： 544-550.

[17] FRANCIS K， DOUGALI A， SIDERI K， et al. Brain-derived neurotrophic factor （BDNF） in children with ASD and their parents： A 3-year follow-up[J]. Acta Psychiatrica Scandinavica， 2018， 137（5）： 433-441.

[18] COKYAMAN T， KASAP T， [S][5]EHITO[[ˇ][C]]LU H. Serum brain-derived neurotrophic factor in the diagnosis of febrile seizure[J]. Pediatrics International， 2021， 63（9）： 1082-1086.

[19] 張學(xué)君， 黃倩茹， 洪" 霖， 等. 電針長強(qiáng)穴對自閉癥大鼠海馬CA3區(qū)BDNF蛋白表達(dá)的影響[J]. 康復(fù)學(xué)報(bào)， 2018， 28（4）： 27-31.

[20] 黨媛媛， 倪金鳳， 劉國玉， 等. 雷帕霉素對自閉癥仔鼠神經(jīng)、社交行為及海馬區(qū)BDNF、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響[J]. 山東醫(yī)藥， 2017， 57（48）： 40-42.

[21] 林" 燊， 林" 棟， 齊詩儀， 等. 電針不同刺激時(shí)長對自閉癥大鼠BDNF-CREB信號(hào)通路的影響[J]. 中華中醫(yī)藥雜志， 2022， 37（7）： 4063-4069.

[22] BARCO A， MARIE H. Genetic approaches to investigate the role of CREB in neuronal plasticity and memory[J]. Molecular Neurobiology， 2011， 44（3）： 330-349.

[23] LI Z X， YOU M D， CHE X Y， et al. Perinatal exposure to BDE-47 exacerbated autistic-like behaviors and impairments of dendritic development in a valproic acid-induced rat model of autism[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety， 2021， 212： 112000.

[24] 李晨夢. 博爾納病毒調(diào)節(jié)ERK-CREB-BDNF信號(hào)通路導(dǎo)致大鼠成年后焦慮樣及自閉癥樣行為[D]. 重慶： 重慶醫(yī)科大學(xué)， 2018.

[25] 李家鑫， 韋斌垣. BDNF基因功能性多態(tài)rs6265與孤獨(dú)癥兒童的相關(guān)性研究[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志， 2014， 24（16）： 28-31.

[26] 齊詩儀， 黃曉真， 林" 燊， 等. 電針命門穴對FMR1基因敲除小鼠自主行為學(xué)及海馬CREB蛋白表達(dá)的影響[J]. 福建中醫(yī)藥， 2019， 50（3）： 61-65.

（本文編輯" 匡靜之）