〔摘要〕 目的 觀察電針對佐劑性關(guān)節(jié)炎（AIA）大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中酪氨酸激酶底物5（TKS5）蛋白表達(dá)及輔助性T細(xì)胞1（Th1）、輔助性T細(xì)胞17（Th17）主要標(biāo)記物γ-干擾素（INF-γ）、白細(xì)胞介素17A（IL-17A）的影響，探討其可能作用機制。方法 將36只SPF級SD大鼠按體質(zhì)量分層后再隨機分為空白組、模型組、電針組、藥物組，每組9只;采用不完全弗式佐劑建立大鼠模型，于造模后第1天對電針組大鼠進(jìn)行電針足三里、關(guān)元、阿是穴干預(yù)，連續(xù)干預(yù)21 d;藥物組給予甲氨蝶呤灌胃給藥，每周2次，連續(xù)干預(yù)3周，共6次。采用足趾容積測量儀檢測大鼠后肢足趾容積;HE染色觀察關(guān)節(jié)滑膜組織病理形態(tài)改變;Western blot檢測滑膜組織中TKS5的蛋白表達(dá);免疫熒光檢測滑膜組織中絲狀肌動蛋白（F-actin）、皮層肌動蛋白（Cortactin）和INF-γ、IL-17A的陽性率。結(jié)果 與空白組比較，模型組大鼠足趾容積顯著增大（Plt;0.01），HE染色結(jié)果顯示模型組滑膜組織增生、炎性細(xì)胞大量浸潤，滑膜組織中TKS5蛋白表達(dá)顯著升高（Plt;0.01），滑膜組織中F-actin、Cortactin、INF-γ、IL-17A陽性表達(dá)顯著增高（Plt;0.01）。與模型組比較，電針組、藥物組大鼠足趾容積減小（Plt;0.05，Plt;0.01），HE染色結(jié)果可見兩組滑膜組織炎性浸潤情況明顯改善，滑膜組織中TKS5蛋白表達(dá)均降低（Plt;0.05，Plt;0.01），滑膜組織中F-actin、Cortactin、INF-γ、IL-17A陽性表達(dá)均降低（Plt;0.05，Plt;0.01）。結(jié)論 電針改善AA模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜炎癥，其機制可能與調(diào)節(jié)TKS5蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制炎性效應(yīng)T細(xì)胞Th1、Th17的高度運動有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 佐劑性關(guān)節(jié)炎;電針;酪氨酸激酶底物5;輔助性T細(xì)胞1;輔助性T細(xì)胞17; 絲狀肌動蛋白;皮層肌動蛋白

〔中圖分類號〕R245"""""""" 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A""""""""" 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.02.010

〔收稿日期〕2024-09-22

〔基金項目〕國家自然科學(xué)基金項目（82074565）;湖南省自然科學(xué)基金青年項目（2022JJ40304）。

〔通信作者〕*祁" 芳，女，碩士，講師，E-mail：761415640@qq.com;艾" 坤，男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：aikun650@qq.com。

Effects of electroacupuncture on TKS5 protein expression， Th1，

and Th17 in rats with adjuvant arthritis

DING Qiangsheng1， WU Qingze1， QU Qirui1， ZHANG Liang2， LIU Li3， ZHANG Hong1， AI Kun1*， QI Fang1*

1. School of Acupuncture-moxibustion， Tuina and Rehabilitation， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. School of Continuing Education， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China;

3. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of electroacupuncture on tyrosine kinase substrate 5 （TKS5） protein expression and the key markers of T helper 1 （Th1） and T helper 17 （Th17） cells， namely interferon gamma （INF-γ） and interleukin-17A （IL-17A）， in the synovial tissue of rats with adjuvant-induced arthritis （AIA）， and to explore its possible mechanism of action. Methods A total of 36 SPF grade SD rats were stratified by body weight and then randomly divided into blank group， model group，nbsp; electroacupuncture group， and medication group， with nine rats in each group. Rat models were established using incomplete Freund's adjuvant. On the first day after modeling， electroacupuncture was applied to the electroacupuncture group at \"Zusanli\" （ST36）， \"Guanyuan\" （CV4）， and \"Ashi points\" for 21 consecutive days. Rats in the medication group were gavaged with methotrexate twice a week for three weeks， for a total of six doses. The hind toe volume of rats was measured using a paw volume" meter. HE staining was used to observe the histopathological changes in synovial tissue of joints; Western blot was used to determine TKS5 protein expression in the synovial tissue; and immunofluorescence was used to measure the positive rates of filamentous actin （F-actin）， cortactin， IFN-γ， and IL-17A in synovial tissue. Results Compared with the blank group， the toe volume of rats in the model group significantly increased （Plt;0.01）. HE staining showed synovial tissue hyperplasia and massive inflammatory cell infiltration in the model group. The TKS5 protein expression in the synovial tissue significantly increased （Plt;0.01）， and the positive expressions of F-actin， cortactin， INF-γ， and IL-17A in the synovial tissue also significantly increased （Plt;0.01）. Compared with the model group， the toe volume of rats in the electroacupuncture group and medication group decreased （Plt;0.05， Plt;0.01）. HE staining showed significantly reduced inflammatory infiltration of synovial tissue in both groups， as well as reduced TKS5 protein expression （Plt;0.05， Plt;0.01） and the positive expressions of F-actin， cortactin， INF-γ， and IL-17A in synovial tissue （Plt;0.05， Plt;0.01）. Conclusion Electroacupuncture reduces synovial inflammation in AA rat models， and its mechanism may be related to regulating TKS5 protein expression， thereby inhibiting the hypermotility of inflammatory effector T cells， including Th1 and Th17.

〔Keywords〕 adjuvant-induced arthritis; electroacupuncture; tyrosine kinase substrate 5; T helper 1 cells; T helper 17 cells; filamentous actin; cortactin

本文引用： 丁強盛， 吳慶澤， 瞿啟睿， 張" 亮， 劉" 梨， 張" 泓， 艾" 坤， 祁" 芳. 電針對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠TKS5蛋白表達(dá)及Th1、Th17的影響[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報， 2025， 45（2）： 267-273.

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis， RA）是一種以侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主的自身免疫性疾病[1]，其臨床主要表現(xiàn)為多發(fā)性、對稱性關(guān)節(jié)炎癥[2]。RA的全球患病率為0.5%～1.3%[3]。當(dāng)前RA的治療仍以西藥治療、關(guān)節(jié)置換手術(shù)治療為主，但存在手術(shù)治療費用高及藥物不良反應(yīng)等。電針治療作為一種綠色、安全、高效的方法，其療效顯著，不良反應(yīng)小，成為近年來研究的熱點。已有大量臨床和基礎(chǔ)研究表明，電針治療RA療效確切[4-5]。本課題組前期研究已證實，電針治療佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant-induced arthritis， AIA）模型大鼠足三里、關(guān)元、阿是穴能有效改善關(guān)節(jié)滑膜炎癥，且早期介入干預(yù)療效顯著[6-7]。目前，研究表明輔助性T細(xì)胞1（helper T cell， Th1）、輔助性T細(xì)胞17（helper T cell， Th17）高度運動入侵滑膜組織是關(guān)節(jié)滑膜炎癥發(fā)生發(fā)展的核心原因[8]。絲狀肌動蛋白（F-actin）是構(gòu)成細(xì)胞骨架的重要部分，主控著T細(xì)胞的運動[9]。皮層肌動蛋白（Cortactin）是一種在皮質(zhì)亞細(xì)胞局部聚集且能與F-actin結(jié)合的蛋白質(zhì)[10]。F-actin和Cortactin在酪氨酸激酶底物5（tyrosine kinase sustrate 5， TKS5）的調(diào)控下共同參與了效應(yīng)T細(xì)胞Th1、Th17的高度運動，Th1、Th17產(chǎn)生的細(xì)胞因子會與關(guān)節(jié)中駐留的巨噬細(xì)胞、滑膜細(xì)胞等相互作用，產(chǎn)生降解酶和炎性細(xì)胞因子侵襲滑膜，誘發(fā)關(guān)節(jié)滑膜炎癥[11-13]。因此，抑制Th1、Th17在關(guān)節(jié)滑膜的累積進(jìn)而改善免疫功能、減輕關(guān)節(jié)滑膜炎癥是治療RA的重要課題。故本研究從免疫的角度出發(fā)，以效應(yīng)T細(xì)胞Th1、Th17的高度運動為切入點，選擇AA模型大鼠為研究對象，觀察電針足三里、關(guān)元、阿是穴對AA模型大鼠TKS5蛋白表達(dá)及F-actin、Cortactin的募集情況對Th1、Th17高度運動的影響，在一定程度上揭示電針治療AA大鼠的有效機制，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1" 實驗動物分組

由北京維通利華實驗動物公司提供SPF級SD雄性大鼠36只，體質(zhì)量90～110 g，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5～7 d，分籠飼養(yǎng)于溫度24～26 ℃、濕度50%～70%的湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心。按體質(zhì)量分層后再從36只大鼠隨機抽取9只作為空白組，其余27只作為造模組。造模結(jié)束后，將27只模型大鼠再次隨機分為模型組、電針組、藥物組，每組9只。動物實驗經(jīng)由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，倫理編號為DWDG-202311200002，實驗過程遵照《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》進(jìn)行。

1.2" 主要試劑與儀器

甲氨蝶呤（美國AbMole Bioscience公司，批號：M2228）;滅活結(jié)核分枝桿菌（美國BD公司，批號：231141）;ECL發(fā)光液（美國Advansta公司，批號：K-12045-D50）;TKS5抗體（美國Proteintech，批號：18976-1-AP）;F-actin抗體、Cortactin抗體、γ-干擾素（interferon-γ，INF-γ）抗體、白細(xì)胞介素-17A（interleukin-17A，IL-17A）抗體（湖南艾方生物科技有限公司，批號：bs-1571R、AF300644、af02446、DF6127）。

華佗牌電針治療儀（蘇州醫(yī)療用品有限公司，型號：SDZ-II型）;足跖容積測量儀（濟南益廷科技發(fā)展有限公司，型號：YLS-7C）;病理切片機（上海徠卡儀器有限公司，型號：RM2016）。

1.3" 模型制備

本實驗采用不完全弗式佐劑建立大鼠模型，將滅活結(jié)核分枝桿菌和礦物油研磨至所得溶液變?yōu)榍辶翢o明顯懸浮雜質(zhì)，最后配制成濃度為3 mg/mL;將麻醉后的大鼠放入特制的盒中固定，在乙醇消毒后用微量注射器按照0.1 mL/只的標(biāo)準(zhǔn)緩慢注射不完全弗式佐劑造模;大鼠造模后，第3天開始出現(xiàn)炎性癥狀，第9～12天關(guān)節(jié)腫脹程度顯著，并出現(xiàn)體質(zhì)量減少、皮溫升高、尾根部潰爛、足趾容積增大，提示造模成功[14-16]。

1.4" 干預(yù)方法

設(shè)定造模當(dāng)天為實驗的第0天，在實驗的第1天給予電針組大鼠電針干預(yù)。將大鼠固定于特制鼠板上，用一寸針直刺大鼠雙側(cè)足三里、關(guān)元及阿是穴0.2～0.3寸，穴位參照“十三五”國家規(guī)劃統(tǒng)編教材《實驗針灸學(xué)》中大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜定位[1]。電針儀選用疏密波（頻率10 Hz/50 Hz），強度以針身輕微顫為度，治療頻次和時間分別為1次/d、20 min/次，連續(xù)治療21 d。

空白組、模型組、藥物組同頻次和同時間僅捆綁，但不進(jìn)行電針干預(yù)。藥物組根據(jù)人體臨床劑量與大鼠體質(zhì)量關(guān)系進(jìn)行換算予以甲氨蝶呤灌胃干預(yù)：將甲氨蝶呤粉劑配制成0.35 mg/kg后灌胃給藥[17]，每周一、周四進(jìn)行灌胃，連續(xù)干預(yù)3周，共6次。

1.5 "取材方法

電針治療21 d結(jié)束后，在麻醉狀態(tài)下取大鼠膝關(guān)節(jié)放入多聚甲醛溶液中固定5～7 d，再放置于EDTA脫鈣液中脫鈣，直至骨質(zhì)軟化后分別用于HE染色和免疫熒光檢測。打開大鼠下肢，暴露滑膜組織后，在冰上用小動物手術(shù)剪小心剪去與其相連的組織，進(jìn)行后續(xù)的Western blot檢測。

1.6" 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.6.1" 大鼠足趾容積測量" 使用足趾測量儀對36只大鼠在造模后第0、6、9、12、15、18、21天的同一時間點進(jìn)行雙側(cè)后肢足趾容積檢測和記錄。測量后選取左側(cè)測量3次后的平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，且連續(xù)測量3次數(shù)據(jù)之間的誤差應(yīng)控制在0.05之內(nèi)。

1.6.2" 大鼠滑膜組織HE檢測" 將脫鈣后的大鼠滑膜組織進(jìn)行石蠟包埋成塊、石蠟切片、脫蠟、洗蠟、HE染色、脫水透明，最后滴加中性樹膠封片后置于鏡下觀察。

1.6.3" 大鼠滑膜組織免疫熒光檢測" 將脫鈣后的大鼠滑膜組織進(jìn)行石蠟包埋、切片、脫蠟，抗原修復(fù)，加入血清封閉1 h，滴加IFN-γ、IL-17A、F-actin、Cortactin一抗后過夜，復(fù)溫后滴加二抗孵育再清洗，滴加自發(fā)熒光淬滅劑后封片，于鏡下觀察并計算陽性表達(dá)率。

1.6.4" 大鼠滑膜組織中TKS5蛋白含量Western blot檢測" 首先提取大鼠滑膜組織蛋白，在酶標(biāo)儀檢測蛋白濃度后配制上樣液。制膠上樣后電泳，隨后轉(zhuǎn)膜，配制脫脂奶粉封閉，洗膜孵育一抗后4 ℃過夜，第2天洗膜孵育二抗之后顯影，并分析內(nèi)參蛋白和TKS5蛋白灰度值。

1.7" 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)整理完成后使用SPSS 28.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料均以“x±s”表示，滿足正態(tài)性及方差齊性采用單因素方差分析，不滿足使用非參數(shù)檢驗進(jìn)行分析，以Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1" 各組大鼠一般情況

空白組大鼠一般情況正常;模型組大鼠于造模后第3天出現(xiàn)皮溫升高表現(xiàn)，第9天開始出現(xiàn)體質(zhì)量減少、足跖腫脹、耳部出現(xiàn)小結(jié)節(jié)、尾根部潰爛等全身繼發(fā)性癥狀，并在第15～18天出現(xiàn)高峰期;電針組大鼠較模型組足趾腫脹減輕，體質(zhì)量稍增加;藥物組大鼠較模型組足趾腫脹輕，體質(zhì)量增加，精神狀態(tài)一般。

2.2" 各組大鼠后足趾容積測量

在實驗的第0天，4組之間足趾容積比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）;第15天，與空白組相比，模型組足趾容積腫脹顯著增大（Plt;0.01）;第21天，與模型組相比，電針組大鼠的足趾容積腫脹減?。≒lt;0.05），藥物組大鼠的足趾容積腫脹顯著減?。≒lt;0.01）。詳見圖1。

2.3" 各組大鼠滑膜組織形態(tài)學(xué)比較

空白組滑膜組織結(jié)構(gòu)規(guī)則且形態(tài)完整，無炎性細(xì)胞浸潤;與空白組相比，模型組滑膜組織增生，炎性細(xì)胞大量浸潤;與模型組相比，電針組和藥物組滑膜組織炎性細(xì)胞浸潤情況顯著改善。詳見圖2。

2.4" 各組大鼠滑膜組織F-actin、Cortactin陽性表達(dá)比較

與空白組比較，模型組大鼠滑膜組織中F-actin、Cortactin陽性表達(dá)顯著增高（Plt;0.01）;與模型組比較，電針組大鼠滑膜組織中F-actin、Cortactin陽性表達(dá)降低（Plt;0.05），藥物組大鼠滑膜組織中F-actin陽性表達(dá)顯著降低（Plt;0.01）、Cortactin陽性表達(dá)降低（Plt;0.05）。詳見圖3。

2.5" 各組大鼠滑膜組織IFN-γ、IL-17A陽性表達(dá)比較

與空白組比較，模型組大鼠滑膜組織中INF-γ、IL-17A陽性表達(dá)顯著增高（Plt;0.01）;與模型組比較，電針組和藥物組大鼠滑膜組織中INF-γ、IL-17A陽性表達(dá)均顯著降低（Plt;0.01）。詳見圖4。

2.6" 各組大鼠滑膜組織中TKS5蛋白含量比較

與空白組比較，模型組大鼠滑膜組織中TKS5的蛋白表達(dá)量顯著升高（Plt;0.01）;與模型組比較，電針組大鼠滑膜組織中TKS5的蛋白表達(dá)量降低（Plt;0.05），藥物組大鼠滑膜組織中TKS5的蛋白表達(dá)量顯著降低（Plt;0.01）。詳見圖5。

3 討論

RA屬于中醫(yī)學(xué)“痹病”范疇，中醫(yī)病名為“尪痹”[18]，病因多與正氣不足、外邪侵襲有關(guān)。素體虛弱，腠理不密，衛(wèi)外不固，風(fēng)寒濕邪乘虛侵襲，流注經(jīng)絡(luò)關(guān)節(jié)，氣血運行不暢而形成痹病?？偨Y(jié)而言，氣血不足、營衛(wèi)失調(diào)、脾胃虛弱、濕濁內(nèi)生而致RA發(fā)病?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，“氣血不足、營衛(wèi)失調(diào)”其本質(zhì)即為“自身免疫紊亂，整體機能下降”，而脾胃虛弱、濕濁內(nèi)生往往伴隨炎癥免疫失衡，細(xì)胞凋亡逃逸[19]?！懊庖呶蓙y”“炎癥失衡”正是RA最突出的發(fā)病機制。研究證實，RA是針灸療法的適宜病種，能顯著減輕疼痛及改善功能障礙[20]。張闊等[21]總結(jié)了近50年針刺治療RA的選穴規(guī)律，研究后得出治療頻次最高的腧穴為足三里、關(guān)元等，故本實驗選取足三里、關(guān)元及炎癥累積足趾部位的阿是穴。其中，足三里為脾經(jīng)腧穴，可培固后天之本、升發(fā)營衛(wèi)、固衛(wèi)機體正氣;關(guān)元為任脈腧穴，下涵人體元氣，針之可充足元氣、頤養(yǎng)機體;阿是穴以足趾痛點為主，針之可疏通局部氣血循環(huán)。三穴同用，以充足機體營衛(wèi)之氣為主，配合局部疏經(jīng)通絡(luò)止痛，共奏調(diào)節(jié)免疫、鎮(zhèn)痛之效。

本研究結(jié)果顯示：經(jīng)不完全弗式佐劑造模后的大鼠足趾容積腫脹程度增加，HE染色顯示受損后的關(guān)節(jié)滑膜組織增生，炎性浸潤明顯，滑膜組織中TKS5蛋白表達(dá)量較空白組明顯升高，滑膜組織中F-actin、Cortactin、INF-γ和IL-17A陽性表達(dá)率顯著增高。推測TKS5的表達(dá)升高，大量招募F-actin、Cortactin促進(jìn)了炎性效應(yīng)T細(xì)胞Th1、Th17的高度運動，誘發(fā)關(guān)節(jié)滑膜炎癥。經(jīng)電針干預(yù)后，電針組足趾容積腫脹程度減小，HE染色顯示炎性浸潤明顯改善，滑膜組織中TKS5蛋白表達(dá)量較模型組降低，滑膜組織中F-actin、Cortactin、INF-γ和IL-17A陽性表達(dá)率降低。目前認(rèn)為，Th1、Th17的運動需要細(xì)胞突起的形成，由細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)并最終實現(xiàn)細(xì)胞運動。TKS5屬于Src家族，富含多種結(jié)構(gòu)域，是一種促進(jìn)細(xì)胞突起形成和穩(wěn)定的銜接分子，是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移研究中被高度關(guān)注的一種物質(zhì)，其對腫瘤細(xì)胞足小體、侵襲性偽足的形成發(fā)揮至關(guān)重要的作用[22-24]。RA初始CD4+T細(xì)胞中主要的葡萄糖代謝途徑是磷酸戊糖途徑而非糖酵解途徑[25-26]，而RA初始CD4+T細(xì)胞內(nèi)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase， G6PD）的過度表達(dá)，是葡萄糖代謝分流到磷酸戊糖途徑的直接原因，這會激活相關(guān)信號通路從而引起脂肪酸合成增加，進(jìn)而上調(diào)TKS5的表達(dá)[27]。在RA患者中，TKS5能夠招募大量的F-actin和Cortactin聚集在RA初始CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞膜寬基膜褶皺中，進(jìn)而促使Th1、Th17高度運動，從而侵襲滑膜組織并建立持久的炎癥浸潤[28-29]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)-actin和Cortactin在RA患者來源的細(xì)胞中的表達(dá)比正常對照組高出近7倍[22]。F-actin在遷移細(xì)胞質(zhì)膜處向外延伸成束，形成板狀偽足和絲狀偽足驅(qū)使細(xì)胞遷移[30]。研究發(fā)現(xiàn)，Cortactin通過調(diào)節(jié)微絲相關(guān)蛋白2/3復(fù)合物，使細(xì)胞形成更加穩(wěn)定的侵襲偽足并促進(jìn)細(xì)胞遷移、侵襲運動[10，31-33]。

綜上所述，電針從免疫的角度改善關(guān)節(jié)滑膜炎癥的機制可能與抑制TKS5的蛋白表達(dá)，進(jìn)而降低F-actin、Cortactin的募集率，抑制炎性效應(yīng)T細(xì)胞Th1、Th17的高度運動有關(guān)，從而良性調(diào)節(jié)免疫紊亂，改善關(guān)節(jié)滑膜炎癥。本研究為臨床上電針治療調(diào)節(jié)RA免疫紊亂提供了部分科學(xué)依據(jù)，有助于電針治療RA在臨床應(yīng)用的進(jìn)一步推廣。但本研究也存在一些不足，如實驗樣本量不夠多，電針干預(yù)TKS5的上下游信號通路還未深入驗證，可在后續(xù)研究中進(jìn)一步探索。

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（本文編輯" 匡靜之）