楊東元　羅錦輝等

(第一軍醫(yī)大學(xué)南方醫(yī)院整形外科廣州510515)

楊東元男,1967年生。1991年畢業(yè)于第四軍醫(yī)大學(xué)軍醫(yī)系,1996年畢業(yè)于第一軍醫(yī)大學(xué),獲外科學(xué)醫(yī)學(xué)碩士學(xué)位,現(xiàn)工作于南方醫(yī)院整形外科。參加兩項(xiàng)國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目和一項(xiàng)國家衛(wèi)生部電教教材制作項(xiàng)目;發(fā)表于國家一類雜志論文6篇。[摘要]目的:闡明白細(xì)胞介素-1對(duì)病理性瘢痕效應(yīng)的作用機(jī)理。方法:觀察白細(xì)胞介素-1對(duì)病理性瘢痕成纖維細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果:該介素明顯破壞了線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等重要細(xì)胞器。結(jié)論:證明白細(xì)胞介素-1是成纖維細(xì)胞合成膠原的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。

[關(guān)鍵詞]白細(xì)胞介素-1病理性瘢痕成纖維細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

[中圖分類號(hào)]R322.99[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455(2000)05-0324-02

THE EFFECTS OF INTERLEUKIN-1 ON THE ULTRASTRUCTURE

OF CULTURED FIBROBLASTS FROM PATHOLOGICAL SCAR

YANG Dong-yuanLUO Jin-huiGAO Jian-huaZHANG et al.

The Plastic Surgery Department of Nanfang Hospital,The First Military

Medical University(Guangzhou 510515)

[Abstract]Objective:To investigate the effects of interleukin-1 on the ultrastructure of cultured fibroblasts from pathological scar.Methods:Transmission election microscope were used to observe the ultrastructure of FB.Results:After treatment with IL-1,the main cell organs,including rough endoplasmic reticular,mitochondrid and ribosome,were destroyed.Conclusion:IL-1 is a negative regulator in collagen synthesis of fibroblasts.It could be used for the treatment and the prevention of pathologic scar.

[Key words]Interleukin-1UltrastructureFibroblastPathological scar

細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在病理性瘢痕的形成中起著調(diào)控作用^[1],部分學(xué)者認(rèn)為其中的白細(xì)胞介素-1(Interleukin-1簡稱IL-1)為膠原合成的負(fù)性調(diào)節(jié)因子,能刺激瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)膠原酶的合成^[2],抑制前膠原蛋白的合成^[3],但也有不同的見解。我們以體外二維培養(yǎng)的病理性瘢痕成纖維細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,研究了白細(xì)胞介素-1對(duì)其超微結(jié)構(gòu)的影響,探討白細(xì)胞介素-1對(duì)病理性瘢痕效應(yīng)的作用機(jī)理,為臨床應(yīng)用它治療病理性瘢痕提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試劑與材料本實(shí)驗(yàn)所用增殖性瘢痕或瘢痕疙瘩標(biāo)本均取自第一軍醫(yī)大學(xué)南方醫(yī)院整形外科病人;白細(xì)胞介素-1(北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司)、DMEM培養(yǎng)基干粉(美國GIBCO公司)、L-谷氨酰胺(中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所)、新生小牛血清(超級(jí);杭州四季青生物工程研究所)、HEPES(香港FARCO公司)、胰蛋白酶(美國Sigma公司)

1.2成纖維細(xì)胞的體外二維培養(yǎng)

1.2.1原代培養(yǎng)將手術(shù)切除的瘢痕組織,在無菌條件下剪成0.5cm³～1.0cm³的小塊,立即投入含100U/ml青、鏈霉素的培養(yǎng)液中。剪除脂肪、表皮及結(jié)締組織,D-Hanks液清洗至無油滴,反復(fù)剪碎至小于1mm³的小塊,同時(shí)加數(shù)滴血清,按適當(dāng)間隔接種于培養(yǎng)瓶壁上,反轉(zhuǎn)使有組織塊的一面向上,加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基3ml,置37℃、95%空氣、5%CO²、飽和濕度6～8小時(shí)后,輕輕倒轉(zhuǎn),使培養(yǎng)液浸沒組織塊,待培養(yǎng)液變黃后更換。4～10天組織塊周圍萌出細(xì)胞并逐漸形成細(xì)胞暈,20～30天細(xì)胞長滿瓶,形成細(xì)胞單層。

1.2.2傳代培養(yǎng)加入0.25%胰蛋白酶消化約0.5min,細(xì)胞收縮變圓后棄去胰酶,加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液終止消化并輕輕吹打,形成細(xì)胞懸液。按1∶3比例傳代,建立病理性瘢痕成纖維細(xì)胞的傳代細(xì)胞系,實(shí)驗(yàn)用第4～15代細(xì)胞。

1.2.3白細(xì)胞介素-1對(duì)成纖維細(xì)胞的處理將5000個(gè)/ml的細(xì)胞懸液,分別加入24孔培養(yǎng)板各孔中,貼壁后均棄上清。前8孔為實(shí)驗(yàn)組1,加入含IL-1 100U/ml的條件培養(yǎng)基;中間8孔為實(shí)驗(yàn)組2,加入含IL-1 200U/ml的條件培養(yǎng)基;后8孔為對(duì)照組,加入普通培養(yǎng)基。24小時(shí)后消化成細(xì)胞懸液分別收集。

1.2.4成纖維細(xì)胞電鏡樣品的制備將各組懸液分別轉(zhuǎn)入離心管中的瓊脂管內(nèi),以800R/min低速離心10min;棄上清,各加入2.5%戊二醛0.5ml,室溫固定5小時(shí),棄上清,燒熱的玻棒輕劃瓊脂管內(nèi)壁,使融化的瓊脂流下,包埋住管底的細(xì)胞團(tuán);用特制的薄鐵片將瓊脂管剝離出;切除多余的瓊脂,形成細(xì)胞瓊脂凝膠包埋塊,將包埋塊切成1mm³的小塊,置1%四氧化鋨中固定1.5小時(shí),常規(guī)脫水、浸透、包埋、超薄切片、鈾鉛染色,透射電子顯微鏡(TEM)觀察。

2結(jié)果ザ哉兆橄赴漿內(nèi)具有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈密集小管狀,平行排列;線粒體較多,呈卵圓形,具有環(huán)形嵴;還可見溶酶體等結(jié)構(gòu)。細(xì)胞核呈圓形或卵圓形,核質(zhì)均勻細(xì)致,核仁清晰呈網(wǎng)狀。ナ笛樽1細(xì)胞有不同程度的損傷,胞漿內(nèi)出現(xiàn)較多較大的空泡,線粒體腫脹或消失;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張,數(shù)量減少。實(shí)驗(yàn)組2線粒體環(huán)形嵴退化、變形或消失;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)裂解、空泡化;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面核糖體解聚、脫落;細(xì)胞膜和細(xì)胞核仍保持其完整性。

3討論ゲ±硇擇：凼且越涸等大量細(xì)胞外基質(zhì)過度產(chǎn)生和沉積為特征的皮膚纖維化疾病^[4],是美容整形外科的主要難題。成纖維細(xì)胞攝取合成蛋白所需的脯氨酸、甘氨酸、賴氨酸等,在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體上按照特定的膠原mRNA信息排列,合成前α多肽鏈。后者邊合成邊進(jìn)入粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi),經(jīng)羥化酶羥化,三條前α多肽鏈互相擰成繩索狀的前膠原蛋白分子,再轉(zhuǎn)移到高爾基復(fù)合體中加上糖基,經(jīng)胞吐方式分泌到細(xì)胞間質(zhì)。線粒體是細(xì)胞進(jìn)行生物氧化及提供生命活動(dòng)所需能量的場所,三羧酸循環(huán)、呼吸鏈電子傳遞及氧化磷酸化都在線粒體內(nèi)進(jìn)行,線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體超微結(jié)構(gòu)的變化對(duì)成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白的功能具有重要的意義。本研究透射電鏡顯示,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)形態(tài)有明顯變化,表現(xiàn)為粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、囊泡化;線粒體腫脹、空泡化;核糖體脫顆粒、解聚;其它細(xì)胞器均有不同程度的破壞,并與用藥劑量呈正相關(guān)。這說明白細(xì)胞介素-1是通過破壞前膠原蛋白合成的場所-粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體及細(xì)胞活動(dòng)的能量中心-線粒體來抑制瘢痕成纖維細(xì)胞前膠原蛋白的生成,即白細(xì)胞介素-1為膠原合成的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。這一結(jié)果與我們從定量免疫細(xì)胞化學(xué)角度研究白介-1對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)前膠原蛋白影響的結(jié)論相吻合^[5]。プ凵纖述,白細(xì)胞介素-1通過對(duì)前膠原蛋白合成的負(fù)性調(diào)節(jié)抑制了膠原的生成,該作用至少發(fā)生于翻譯水平,這一結(jié)果為臨床應(yīng)用白細(xì)胞介素-1防治病理性瘢痕提供了一定的理論依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

1Zhang K,Carner W,Cohen L et al.Increased type I and Ⅲ collagen and transforming growth factor-β1 mRNA and protein in hypertrophic burn scar.J Invest Dermatol,1995;104:750

2Arhold E.Interleukin-1 stimulation of collagenase production by cultured fibroblast.Journal of Experimental Medicine,1983;157:801

3R.Bhatnagar.Interleukin-1 inhibits the synthesis of collagen by fibroblasts[J].Biochemistry International,1986;13:709

4Reckwell WB,Cohen IK.Keloids and hypertrophic scars:a comprehensive review[J].Plast Reconstr Surg,1989;84:827

5楊東元,羅錦輝.白細(xì)胞介-1對(duì)病理性瘢痕成纖維細(xì)胞膠原合成的影響[J].中華整形燒傷外科雜志,1999;15:434。

收稿日期2000-05-09

編輯/樊延南