魯峰 高建華 黎小間

魯峰高建華黎小間魯峰，男，1975年出生，第一軍醫(yī)大學(xué)97級(jí)碩士研究生，從師南方醫(yī)院整形外科高建華教授從事病理性瘢痕病因?qū)W研究，發(fā)表論文近10篇。

摘要目的：從成纖維細(xì)胞增殖調(diào)控水平，探討增生性瘢痕過(guò)度增長(zhǎng)的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)理。方法：取正常皮膚和增生性瘢痕各６例為標(biāo)本，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)6～10代后,應(yīng)用流式細(xì)胞儀、粘附式細(xì)胞儀檢測(cè)不同來(lái)源的成纖維細(xì)胞、P53蛋白的表達(dá)和細(xì)胞周期的分布。結(jié)果:正常皮膚成纖維細(xì)胞主要分布在靜止期(G0、G1期)且P53蛋白的表達(dá)較高;增生性瘢痕成纖維細(xì)胞p53蛋白的表達(dá)較低,大量細(xì)胞處于增殖狀態(tài)(G2期、S期和M期)。結(jié)論:成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期的分布及P53蛋白表達(dá)的差異可能是導(dǎo)致增生性瘢痕有別于正常皮膚呈現(xiàn)過(guò)度增生生長(zhǎng)的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)理之一。

關(guān)鍵詞增生性瘢痕P53細(xì)胞周期

THE DISTRBUTION OF CELL CYCLE AND EXPRESSION OF P53 PROTIEN

ON FIBROLASTS DERIVED FRON THE HYPERTROPHIC SCARS AND NORMAL SKINS

Lu Feng,Gao jianhua,Li Xiaojian

Department of Plastic Surgery,Nanfang Hospital of the First Military Medical University (Guangzhou 510515)

Abstractpurpose:To explore the conctete machanism which account for the different growth characterists of the normal skins and hypertrophic scars.Methods:Six samples of normal skins and hypertrophic scars were collected.The means of cell culture was used,and only 6-10 passages fibroblasts were selected for experiment.The distributions of cell cycle and expression of protein P53 were analysed with the help of the flow cytometer and adherent cell analysis and sorting interactive laser coytometer(ACAS 570).Result:Alarge percent of fibroblasts derived from the hypertrophic scars distribute in G2、S and M periods with low levels of the P53 protein.On the other hand,fibroblasts derived from the normal skins distribute mostly in G0 and G1 period with a high expression of P53 protein.Conclusion:The difference of the distributions of cell cycle and expression of protein P53 may account for the propagative growth characteristic in the pathlogical scars and normal skins.

Key wordsHypertrophic scarP53Cellcycle

瘢痕增生是組織創(chuàng)傷后的異常修復(fù),是美容醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究的重要課題。其具體形成機(jī)制至今不完全清楚。其組織學(xué)特點(diǎn)是病變部位膠原的過(guò)度沉積及成纖維細(xì)胞的聚集⁽¹⁾。成纖維細(xì)胞是病理性瘢痕形成的功能性細(xì)胞,過(guò)度增殖的成纖維細(xì)胞和沉積的膠原導(dǎo)致局部瘢痕組織明顯增生⁽²⁾。サ賈虜±硇擇：鄢上宋細(xì)胞過(guò)度增生的主要原因可能是增殖-凋亡調(diào)控的失衡。那么,這種異常的增殖-凋亡又是由哪些基因來(lái)調(diào)控的呢?目前仍缺乏這方面的研究。本研究試圖通過(guò)分析不同來(lái)源成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期分布及主要周期調(diào)控基因P53的表達(dá),旨在從增殖調(diào)控水平初步探討導(dǎo)致病理性瘢痕形成的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)理。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1本實(shí)驗(yàn)所有瘢痕疙瘩和增生性瘢痕均取自南方醫(yī)院整形外科手術(shù)患者,均經(jīng)臨床及病理診斷證實(shí)。增生性瘢痕患者6例,男4例,女2例,病變部位分別位于足背、面部及肘部;年齡20歲～35歲;同時(shí)取增生性瘢痕患者供皮區(qū)正常皮膚為對(duì)照。

1.1.2培養(yǎng)基P53單克隆抗體為美國(guó)santa cruze公司產(chǎn)品,胎牛血清為美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品,DMEM培養(yǎng)基(Dulbeccos modified minimal essential medium,美國(guó)GIBCO生產(chǎn))碘化丙啶(propidium odide,PI)熒光染料為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)將手術(shù)切下的正常皮膚、瘢痕疙瘩和增生性瘢痕組織在無(wú)菌條件下切除其表皮,在少量胎牛血清中將標(biāo)本切成1mm.3左右的組織塊置于培養(yǎng)瓶中,在95%空氣,5%二氧化碳、37℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)6小時(shí)～8小時(shí),使組織塊牢固地粘附在瓶壁上,然后加入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基適量,繼續(xù)培養(yǎng),3天～4天換液1次,2周～3周后,原代細(xì)胞生長(zhǎng)成單層,用0.25%胰蛋白酶消化后,按1∶3的比例傳代培養(yǎng),此后每2天～3天換液1次,每4天～5天分種傳代1次,實(shí)驗(yàn)用第6代～10代細(xì)胞。

1.2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)增生性瘢痕、正常皮膚成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期的分布ト「粘ぢ瓶壁的細(xì)胞,0.25%胰蛋白酶消化后收集于離心管中,1000rpm離心5min。PBS洗二遍,以70%冰乙醇固定細(xì)胞12小時(shí)以上,PBS離心沉淀去除固定液,加入500μl PI染液(含PI100μg/ml、Pnase 1mg/ml),37℃閉光孵育30分鐘,在Coulter EPICS Elite(ESP)流式細(xì)胞儀上進(jìn)行細(xì)胞DNA含量測(cè)定并分析細(xì)胞周期的分布。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)增生性瘢痕、正常皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)P53蛋白的表達(dá)ト「粘ぢ瓶壁的細(xì)胞,用0.25%的胰蛋白酶消化后加入離心管內(nèi),1000轉(zhuǎn)離心5min。PBS清洗后4%多聚甲醛固定30分鐘以上。4℃2500轉(zhuǎn)離心5min,PBS洗兩遍,1%兔血清封閉非特異性抗原5min。PBS洗后,加入P53單抗50μl,4℃下過(guò)夜。PBS清洗后加入FTTC標(biāo)記羊抗鼠的二抗。37℃水浴1h,PBS清洗兩遍,200目篩孔過(guò)篩,應(yīng)用Coulter EPICS Elite ESP流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4粘附式細(xì)胞儀檢測(cè)增生性瘢痕、正常皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)P53蛋白的表達(dá)ト「粘ぢ瓶壁的細(xì)胞,用0.25%的胰蛋白酶消化后,加入適量含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,吹打后按每皿含細(xì)胞1×10.5的密度接種到petri培養(yǎng)皿中,在95%空氣,5%二氧化碳、37℃、飽和濕度條件下孵育8小時(shí)～10小時(shí),使細(xì)胞完全貼壁并伸展呈梭形。將培養(yǎng)皿取出,室溫下PBS液漂洗3次,4%多聚甲醛固定5-7min,PBS液漂洗3次后加入P53單抗20μe,37℃孵育30minPBS液漂洗3次后加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠的二抗,室溫孵育30min,PBS液漂洗3次,加入少許PBS液后待檢。ソ含已染色細(xì)胞的培養(yǎng)皿置于ACAS570交互式激光細(xì)胞儀(abherent cell analysis and sorting interactive lasercoytometer美國(guó)Meridian公司)載物臺(tái),直觀地掃描測(cè)定細(xì)胞內(nèi)染料初始熒光強(qiáng)度,得到細(xì)胞圖象。選擇待檢測(cè)細(xì)胞,測(cè)定各細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度值代表所選單個(gè)細(xì)胞內(nèi)抗原的含量。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析ニ得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,統(tǒng)計(jì)處理應(yīng)用SPSS軟件,采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較分析。(附表)

2.結(jié)果

2.1流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示:正常皮膚成纖維細(xì)胞主要分布在靜止期(G0、G1期),處于增殖期的細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的28%;增生性瘢痕成纖維細(xì)胞多數(shù)細(xì)胞處于增殖狀態(tài)(G2期、S期和M期),處于增殖期的細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的70%,兩者之間差距顯著(P<0.01)從周期分布的規(guī)律我們可以看出正常皮膚和增生性瘢部成纖維細(xì)胞的增殖能力和生長(zhǎng)狀況是有差別的。(圖1～2)。

圖1正常皮膚成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期分布

顯示:瘢痕疙瘩中央部成纖維細(xì)胞主要分布于靜止期(G0+G1期),處于增殖期細(xì)胞百分率為30.0%。

圖2增生性瘢痕成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期分布

顯示:瘢痕疙瘩周邊部成纖維細(xì)胞大多數(shù)分布于增殖期(G2+S+M期),占細(xì)胞總數(shù)67%。

2.2正常皮膚成纖維細(xì)胞P53蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率較高為70%,增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)率很低僅為17%(圖3～4)。兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖3正常皮膚纖維細(xì)胞P53蛋白的分布

顯示:正常皮膚成纖維細(xì)胞P53蛋白陽(yáng)性表達(dá)率很高,為71.0%

圖4增生性瘢痕成纖維細(xì)胞P53蛋白的分布

顯示:增生性瘢痕成纖維細(xì)胞P53蛋白陽(yáng)性表達(dá)率很低,為17.0%

2.3粘附式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)結(jié)果與流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果吻合,P53蛋白陽(yáng)性強(qiáng)度正常皮膚單個(gè)成纖維細(xì)胞較高而增生性瘢痕單個(gè)成纖維細(xì)胞較低(圖5～6)?？梢?jiàn),正常皮膚和增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖能力和生長(zhǎng)狀況的差別可能是由不同表達(dá)強(qiáng)度的P53基因調(diào)控的結(jié)果。

圖5正常皮膚單個(gè)成纖維細(xì)胞P53蛋白表達(dá)強(qiáng)度

粘附式細(xì)胞儀掃描圖顯示:正常皮膚單個(gè)成纖維細(xì)胞P53蛋白的熒光強(qiáng)度主要分布在2200左右。P53蛋白表達(dá)強(qiáng)度最強(qiáng)。

圖6增生性瘢痕單個(gè)成纖維細(xì)胞P53蛋白表達(dá)強(qiáng)度

粘附式細(xì)胞儀掃描圖顯示:增生性瘢痕單個(gè)成纖維細(xì)胞P53蛋白的熒光強(qiáng)度主要分布在1000左右。P53蛋白表達(dá)強(qiáng)度最弱。

3.討論ケ疚奈我們系列研究項(xiàng)目"病理性瘢痕成纖維細(xì)胞Fas介導(dǎo)的死亡信號(hào)的實(shí)驗(yàn)研究"之VI。細(xì)胞周期的分布可以直觀地反應(yīng)細(xì)胞群體的增殖狀況,因此我們選擇細(xì)胞周期作為觀測(cè)指標(biāo)對(duì)不同部位成纖維細(xì)胞增殖能力進(jìn)行分析。ビτ昧魘較赴儀定量分析細(xì)胞周期的分布是近年來(lái)一項(xiàng)新的細(xì)胞學(xué)技術(shù),能快速、準(zhǔn)確地研究任何類(lèi)型細(xì)胞的周期分布的規(guī)律.⁽³⁾。增殖期細(xì)胞內(nèi)存在活躍的DNA的合成,因此胞內(nèi)DNA含量大于兩倍體細(xì)胞。此類(lèi)細(xì)胞群包括G2期、S期和M期細(xì)胞。非增殖期細(xì)胞一般處于G1、G0期,因胞內(nèi)DNA未復(fù)制,因此為典型的兩倍體細(xì)胞群。因此,應(yīng)用pI染料標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)DNA后,流式細(xì)胞儀可對(duì)每個(gè)細(xì)胞內(nèi)的DNA進(jìn)行記錄分析。結(jié)果經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)后,可以見(jiàn)到兩倍體的G1峰、四倍體的G2峰及兩者間的S期細(xì)胞。經(jīng)過(guò)電腦分析就可以了解一個(gè)細(xì)胞群體中增殖期及靜止期細(xì)胞的百分率。ケ臼笛檠芯勘礱,正常皮膚成纖維細(xì)胞主要分布在靜止期;增生性瘢痕成纖維細(xì)胞多數(shù)處于增殖狀態(tài);從周期分布的規(guī)律我們可以看出正常皮膚及增生性顏痕成纖維細(xì)胞的增殖能力和生長(zhǎng)狀況是有差別的,這也可以解釋增生性瘢痕過(guò)度增殖的原因。P53基因是參與細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)的重要基因之一。在凋亡調(diào)控過(guò)程中也起著重要作用,它包括野生型和突變型兩種不同的存在形式^(4,5)。關(guān)于P53蛋白在調(diào)控細(xì)胞增殖機(jī)理方面的研究證實(shí).^(6,7):P53蛋白能阻斷細(xì)胞從G1進(jìn)入S期,使細(xì)胞停滯在G1期,從而抑制細(xì)胞的增殖過(guò)程。當(dāng)P53蛋白含量減少或基因突變后,細(xì)胞可大量進(jìn)入S期,分裂增殖加劇,從而導(dǎo)致增殖-凋亡的失衡。ケ臼笛檠芯糠⑾,P53蛋白陽(yáng)性強(qiáng)度正常皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)較高,而增生性瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)較低。此結(jié)果與細(xì)胞周期分布結(jié)果吻合,說(shuō)明在瘢痕疙瘩形成過(guò)程中,P53蛋白的調(diào)控是細(xì)胞增殖調(diào)控最重要的方式之一。P53蛋白表達(dá)的減少,導(dǎo)致細(xì)胞大量進(jìn)入增殖期,導(dǎo)致細(xì)胞增殖-凋亡的失衡。ビ泄豍53蛋白在增生性瘢痕形成過(guò)程中參與增殖調(diào)控的具體模式如何?增生性瘢痕形成過(guò)程中還有哪些基因參與了它的增殖調(diào)控?是否可將P53基因?qū)脒M(jìn)行增生瘢痕的基因治療呢?研究的進(jìn)一步深入必將有助于我們從一個(gè)新的角度來(lái)認(rèn)識(shí)病理性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖-凋亡失衡的機(jī)制,從而為最終揭開(kāi)病理性瘢痕形成奧秘奠定理論基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)

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