吳瀟蕓，吳林秀，張麗娣，藍一筆，張明津，易楚繁，付偉金△

膀胱癌（BC）是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤［1］，分為非肌層浸潤性BC（NMIBC）和肌層浸潤性BC（MIBC）兩種［2］。MIBC 主要治療方法為根治性膀胱切除術(shù)（RC），但部分MIBC患者行RC術(shù)后仍然發(fā)生轉(zhuǎn)移［3］，轉(zhuǎn)移性或晚期MIBC 患者臨床療效不佳［4］。若能明確BC 患者侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路及調(diào)控機制，對發(fā)現(xiàn)BC 治療新靶點和藥物，提高診斷及預后具有重要意義。本課題組前期發(fā)現(xiàn)miR-124-3p在BC 細胞和組織中低表達，轉(zhuǎn)染miR-124-3p mimics可抑制BC細胞增殖，降低細胞侵襲力和內(nèi)皮素受體B（EDNRB）表達，從而影響B(tài)C細胞增殖和侵襲［5］。長鏈非編碼RNA（LncRNA）可通過內(nèi)源性競爭性RNA機制（ceRNA）與miRNA發(fā)生競爭性結(jié)合，調(diào)控miRNA下游靶基因，從而影響惡性腫瘤相關(guān)生物學行為［6-7］。LINC00839 已被證實在肝癌、食管癌等多種惡性腫瘤中過表達［8-9］，而目前LINC00839是否參與調(diào)控BC細胞的增殖和侵襲還有待研究。本研究擬檢測LINC00839 在BC 組織和細胞中的表達情況，驗證其與miR-124-3p的相關(guān)性，探究LINC0083對BC細胞增殖及侵襲等生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標本收集 選取2021年4月1月—2022年5月31日于廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科行RC的BC患者。納入標準：（1）術(shù)前未接受放療或化療。（2）術(shù)后病理診斷為膀胱尿路上皮癌。最終納入15例，分別取同一患者的BC組織和癌旁正常組織（距離腫瘤≥2 cm 的膀胱正常黏膜組織），術(shù)后均經(jīng)HE染色病理證實。標本在手術(shù)切除后10 min之內(nèi)獲得，取材后置于無菌凍存管中，儲存至-80 ℃低溫冰箱。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準（2021-ky-國基-193），患者知情同意并簽署知情同意書。

1.1.2 試劑和儀器 人膀胱癌細胞系T24、5637、EJ 購自中科院上海細胞研究所；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Introgen公司；RP1640培養(yǎng)液及10%胎牛血清購自美國Gibco公司；一抗兔源EDNRB 蛋白、二抗羊抗兔IgG、內(nèi)參GAPDH購自美國Abcam 公司；干擾序列：si-LINC00839-1（GCU?AGAAGUUGUUAGUUUACU）、si-LINC00839-2（GCUACA?AUGAGUAAUCUAAUG）、s-LINC00839-3（GGUUGUGGAU?UUACAGGAAUG）購自賽索飛生物公司；miR-124-3p mimics（UAAGGCACGCGGUGAAUGCCAA）、LINC00839 野 生 型（WT-LINC00839）和突變型（MUT-LINC00839）熒光素酶報告基因載體購自廣州銳博生物公司；細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）購自美國Sigma 公司；Transwell 小室購自美國Corning 公司；實時熒光定量PCR（qPCR）儀購自美國ABI公司；倒置顯微鏡和熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉(zhuǎn)染和實驗分組 T24、5637、EJ 細胞在RPMI1640 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，5%CO2、37 ℃）培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗，檢測LINC00839相對表達量高者為研究細胞。將3 條si-LINC00839 序列轉(zhuǎn)染BC 細胞，分為si-LINC00839-1組、si-LINC00839-2組、si-LINC00839-3組，RNA 干擾陰性對照組（si-NC 組）僅添加等量轉(zhuǎn)染試劑。qPCR篩選出抑制效率最高的siRNA序列，進入下一步實驗。

1.2.2 qPCR檢測mRNA表達水平 按照Trizol使用說明書提取BC組織及細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，利用熒光定量試劑盒于Life 7500序列檢測系統(tǒng)行定量PCR 分析。引物序列由上海生工生物有限公司合成。LINC00839 引物序列：上 游5'-TAAATAGTTGCTCCGT?GGGCT-3'，下游5'-GCCTGGCCCTCTTCTTTCTC-3'，產(chǎn)物大小100 bp；miR-124-3p 引物序列：上游5'-GTCGTATCCAGTG?CAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGCATT-3'，下游5'-TAAGGCACGCGGTGAATGCC-3'，產(chǎn)物大小48 bp；內(nèi)參GAPDH 引物序列：上游5'-GAGTCAACGGATTTGGTC?GT-3'，下游5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'，產(chǎn)物大小185 bp。反應條件：95 ℃預變性120 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40 個循環(huán)。各組實驗重復3 次，以GAPDH 為內(nèi)參，利用2-ΔΔCt法計算LINC00839和miR-124-3p相對表達量。

1.2.3 CCK-8檢測LINC00839對BC細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期BC 細胞，調(diào)整密度為5×103個/mL，將其置于96 孔板培養(yǎng)，分別將si-LINC00839-2轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h后，添加10μL CCK-8試劑，37 ℃細胞培養(yǎng)箱共培養(yǎng)1 h，酶標儀（450 nm）檢測光密度（OD）值，以OD 值代表細胞增殖率，各組實驗重復3次。

1.2.4 Transwell 檢測BC 細胞侵襲 Transwell 小室內(nèi)鋪滿無血清培養(yǎng)液稀釋的基質(zhì)膠，si-LINC00839-2 轉(zhuǎn)染BC 細胞48 h 后，密度為5×104個/mL 細胞懸液加入上室，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液；培養(yǎng)48 h 后，取出小室，PBS 洗滌，95%乙醇固定，用0.1%結(jié)晶紫染色。高倍顯微鏡下，選擇不少于5個隨機視野計數(shù)穿膜細胞數(shù)，各組實驗重復3次。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測BC細胞凋亡 si-LINC00839-2轉(zhuǎn)染各組BC細胞48 h后，收集5×105個細胞，1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液。PBS 洗滌1 次，加入預冷的70%乙醇于4 ℃固定2 h。PI 染液染色后4 ℃避光30 min。流式細胞儀檢測早期和晚期BC細胞凋亡率，各組實驗重復3次。

1.2.6 雙熒光素酶實驗檢測miR-124-3p熒光素酶活性 采用在線軟件Snap Gene 4.1.9 進行靶基因預測比對，顯示LINC00839 和miR-124-3p 之間可能存在特異性結(jié)合位點。將LINC00839-WT 和LINC00839-MUT 分 別 與miR-124-3p mimics 和miR-124-3p-NC 共轉(zhuǎn)染至BC 細胞，轉(zhuǎn)染48 h 后檢測各組細胞的熒光素酶活性，各組實驗重復3次。

1.2.7 Western blot 法檢測EDNRB 蛋白的表達 si-LINC00839-2轉(zhuǎn)染各組細胞48 h后，用細胞裂解液提取各組細胞總蛋白，配置10%分離膠和5%濃縮膠，每孔上40μg蛋白進行SDS-PAGE 后轉(zhuǎn)至PVDF 膜，封閉后，加入兔抗小鼠EDNRB單克隆抗體（1∶1 000），4 ℃過夜。洗滌后加二抗室溫孵育2 h，洗滌，DAB顯色，成像，GAPDH作為內(nèi)參，各組實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用配對t檢驗；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LINC00839 在BC 組織和細胞的表達情況 LINC00839 在BC 的表達水平高于癌旁正常組織（1.75±1.07vs.1.01±0.41，n=15，t=2.656，P＜0.05）。普通倒置顯微鏡觀察T24、5637、EJ細胞處于對數(shù)生長期，細胞生長良好，見圖1。LINC00839 在T24、5637、EJ 表達水平分別為0.88±0.09、0.91±0.08、0.16±0.04（n=3，F(xiàn)=102.862，P＜0.05），在BC5637 細胞中表達最高。

Fig.1 Bladder cancer cells in logarithmic growth stage(×100)圖1 對數(shù)生長期的BC細胞（×100）

2.2 si-LINC00839 干擾效率 qPCR 檢測結(jié)果顯示si-NC 組、si-LINC00839-1 組、si-LINC00839-2 組、si-LINC00839-3 組中LINC00839 表達水平分別為1.19±0.17、0.78±0.06、0.38±0.03 和0.58±0.02（n=3，F(xiàn)=42.860，P＜0.05），si-LINC00839-2 抑制效率最高，選擇其進行后續(xù)研究。

2.3 沉默LINC00839 對BC5637 細胞miR-124-3p表達的影響 qPCR檢測結(jié)果顯示，si-LINC00839-2組miR-124-3p 表達較si-NC 組增加（1.68±0.13vs.1.02±0.25，n=3，t=4.019，P＜0.05）。

2.4 沉默LINC00839 表達對BC5637 細胞增殖的影響 CCK-8 實驗結(jié)果表明，與si-NC 組相比，si-LINC00839-2 組48、72 和96 h 細胞增殖率下降（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of BC cell proliferation at different time points between the two groups表1 2組BC細胞不同時間點增殖情況比較（n=3，OD450，±s）

Tab.1 Comparison of BC cell proliferation at different time points between the two groups表1 2組BC細胞不同時間點增殖情況比較（n=3，OD450，±s）

＊P＜0.05。

組別si-NC組si-LINC00839-2組t 24 h 0.33±0.00 0.34±0.00 1.957 48 h 0.62±0.02 0.41±0.01 17.122＊72 h 1.16±0.03 0.67±0.02 23.534＊96 h 2.49±0.07 1.03±0.04 31.981＊

2.5 沉默LINC00839 表達對BC5637 細胞侵襲的影響 Transwell 侵襲實驗結(jié)果顯示，si-LINC00839-2組較si-NC 組穿膜細胞數(shù)（個/視野）減少（159.66±51.07vs.330.33±89.91，n=3，t=2.859，P＜0.05），見圖2。

2.6 沉默LINC00839 表達對BC5637 細胞凋亡的影響 流式細胞實驗結(jié)果顯示，si-LINC00839-2 組較si-NC組早期［（2.90±0.36）%vs.（0.27±0.05）%，n=3，t=12.531，P＜0.05）］和晚期BC 細胞凋亡率［（7.96±0.34）%vs.（6.52±0.51）%，n=3，t=4.093，P＜0.05）］增加，見圖3。

Fig.2 Effects of silencing LINC00839 on the invasion of bladder cancer 5637 cells(crystal violet staining,×100)圖2 沉默LINC00839表達對BC5637細胞侵襲的影響（結(jié)晶紫染色，×100）

Fig.3 Effects of silencing LINC00839 on the apoptosis of bladder cancer 5637 cells圖3 沉默LINC00839表達對BC5637細胞凋亡的影響

2.7 雙熒光素酶實驗檢測LINC00839 與miR-124-3p 的 關(guān) 系 LINC00839 與miR-124-3p 之 間 存 在 互補結(jié)合位點，見圖4。miR-124-3p-NC+LINC00839-WT 組、miR-124-3p mimics+LINC00839-WT 組、miR-124-3p-NC+LINC00839-MUT 組、miR-124-3p mimics+LINC00839-MUT 組的熒光素酶相對活性分別為0.86±0.06、0.52±0.05、0.92±0.02、0.86±0.03。與miR-124-3p-NC+LINC00839-WT 組 相 比，miR-124-3p mimics+LINC00839-WT 組熒光素酶相對活性下降（n=3，t=7.667，P＜0.05）；miR-124-3p-NC+LINC00839-MUT 組 與 miR-124-3p mimics+LINC00839-MUT組相比，熒光素酶相對活性差異無統(tǒng)計學意義（n=3，t=0.271，P＞0.05）。

Fig.4 The binding sites of LINC00839 with miR-124-3p圖4 LINC00839與miR-124-3p結(jié)合位點

2.8 沉默LINC00839 對EDNRB 蛋白表達的影響 Western blot 檢測結(jié)果顯示，si-LINC00839-2 組較si-NC 組EDNRB 蛋白表達下降（0.27±0.04vs.0.49±0.16，n=3，t=2.291，P＜0.05），見圖5。

Fig.5 Effects of silencing LINC00839 on the expression of EDNRB protein in bladder cancer 5637 cells圖5 沉默LINC00839對BC5637細胞EDNRB表達的影響

3 討論

LncRNA 是一類長度大于200 bp 的非編碼RNA，缺少特異完整開放閱讀框架，無蛋白質(zhì)編碼功能的RNA［10］。研究證實LncRNA參與調(diào)控多種惡性腫 瘤 的 惡 性 生 物 學 行 為［11-12］。Cao 等［13］發(fā) 現(xiàn)，LncRNA-RMRP 通過miR-125a-5p 調(diào)控BC 細胞的增殖和侵襲。Luo等［14］發(fā)現(xiàn)，LncRNA RP11-89通過miR-129-5p/PROM2 分子軸促進BC 細胞的增殖和侵襲能力。

LINC00839 已被證實與多種腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。沉默LINC00839表達可促進神經(jīng)母細 胞 瘤IMR-32 和SK-N-SH 細 胞 凋 亡［15］。LINC00839 在乳腺癌組織和細胞過表達，沉默LINC00839后可抑制乳腺癌細胞增殖［16］。相關(guān)研究證實LINC00839 可通過靶向抑制miR-519d-3/JMJD6 軸 表 達，促 進 肺 癌 細 胞 增 殖［17］。目 前LINC00839在BC中的表達及相關(guān)意義尚不清楚。

本研究結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比，LINC00839 在BC 組織過表達，在T24、5637、EJ 細胞中，5637細胞LINC00839表達最高，提示LINC00839可能與BC 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究將3 條si-LINC00839 干擾序列轉(zhuǎn)染BC5637 細胞，qPCR 檢測結(jié)果顯示，si-LINC00839-2組抑制效率最佳，選其作為研究干擾序列。與si-NC 組相比，si-LINC00839-2 組轉(zhuǎn)染后，細胞增殖和侵襲力下降，凋亡率增加，提示LINC00839 在BC5637 細胞中發(fā)揮促癌作用，沉默其表達可抑制其增殖及侵襲等惡性生物學行為。

miRNA 是LncRNA 作用靶標，調(diào)控下游基因的表達，影響腫瘤發(fā)生發(fā)展進程［18-19］。本研究前期研究已證實EDNRB 是miR-124-3p 的潛在靶基因。EDNRB是內(nèi)皮素-1（ET-1）的一種G蛋白偶聯(lián)受體。ET-1 和EDNRB 的結(jié)合被稱為內(nèi)皮素軸，與細胞增殖、遷移和凋亡相關(guān)。ET-1 是由21 個氨基酸組成的多肽，廣泛參與細胞增殖、抑制細胞凋亡、轉(zhuǎn)移等惡性腫瘤相關(guān)進程，是BC、前列腺癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤的相關(guān)生長因子［20-21］。

目前關(guān)于BC 細胞中，LINC00839 與miR-124-3p 的相關(guān)性研究少見。本研究進一步發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染LINC00839-WT 和miR-124-3p mimics 后，BC5637細胞熒光素酶相對活性降低，提示LINC00839 存在miR-124-3p 結(jié)合位點，沉默LINC00839 可促進miR-124-3p 的表達上調(diào)，下調(diào)EDNRB 蛋白表達。提示在BC 細胞中干擾LINC00839，可通過上調(diào)miR-124-3p 表達后抑制EDNRB 蛋白，從而影響B(tài)C細胞增殖、侵襲等惡性生物學功能。

綜上所述，LINC00839在BC組織和細胞中過表達，沉默LINC00839可抑制BC5637細胞增殖及侵襲等惡性生物學行為，機制可能與上調(diào)抑癌因子miR-124-3p 有關(guān)。本研究僅初步探討LINC00839 調(diào)控miR-124-3p 對BC 細胞惡性生物學行為的影響，該結(jié)論未在動物體內(nèi)進行驗證，是否還有其他信號通路參與，將是下一步研究的重點內(nèi)容。