陳應(yīng)柱　鮑　歡　田　野　包仕堯　許　俊　袁成林

【摘要】目的從髓鞘堿性蛋白(MBP)mRNA、髓鞘少突膠質(zhì)糖蛋白(MOG)mRNA等髓鞘基因表達(dá)的角度，探討腦缺血大鼠髓鞘損傷的變化規(guī)律。方法采用SD大鼠四血管閉塞急性全腦缺血模型，隨機(jī)分為2 d、4 d、7 d、14 d和28 d五個(gè)時(shí)間點(diǎn)及假手術(shù)組，每組8只；用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)觀察海馬組織中MBP mRNA、MOG mRNA表達(dá)的變化。結(jié)果腦缺血后2 d海馬組織中MBP mRNA、MOG mRNA表達(dá)水平即已降低，至7 d時(shí)降低顯著，并持續(xù)至28 d時(shí)達(dá)到高峰。與假手術(shù)組比較，大鼠海馬組織內(nèi)MBP mRNA、MOG mRNA表達(dá)于再灌流后7 d、14 d、28 d差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論隨著腦缺血一再灌流時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠海馬組織MBP mRNA、MOG mRNA表達(dá)逐漸降低，呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性。

【關(guān)鍵詞】髓鞘基因；全腦缺血；海馬；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

急性缺血性神經(jīng)元損傷的病理生理學(xué)機(jī)制已經(jīng)得到了深入研究，但神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的缺血性損傷卻很少受到關(guān)注。針對(duì)神經(jīng)元損傷的神經(jīng)保護(hù)劑在卒中臨床試驗(yàn)中不能改善患者的預(yù)后，而少突膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)缺血缺氧具有選擇易損性，因此有必要對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞缺血性損傷進(jìn)行深入研究。本實(shí)驗(yàn)采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT，PcR)方法，從髓鞘基因表達(dá)的角度，探討腦缺血大鼠髓鞘損傷的變化規(guī)律，旨在為缺血性腦損傷的臨床防治提供依據(jù)。

1材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及動(dòng)物分組

健康雄性SD大鼠70只，由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重200～240 g。采用大鼠四血管閉塞急性全腦缺血模型，剔除死亡和造模不成功的大鼠后，隨機(jī)分為2 d、4 d、7 d、14 d和28 d五個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每組8只；同時(shí)設(shè)立假手術(shù)組8只。

1．2主要試劑

Trizol為美國(guó)CHEMICON公司產(chǎn)品，MBP引物、MOG引物、β-actin引物由上海申能博彩生物科技有限公司合成，其余分子生物學(xué)相關(guān)試劑均購(gòu)自上海申能博彩公司。

1．3大鼠全腦缺血模型的制備及取材

采用Pulsinelli法建立大鼠急性全腦缺血模型，具體方法見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。各組大鼠于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)用20％烏拉坦過(guò)深麻醉后，經(jīng)左心室常規(guī)灌注生理鹽水，開(kāi)顱取腦。分離出一側(cè)海馬組織立即置入無(wú)RNA酶的1.5 ml Ep管中并置于－70℃冰箱中備用。

1．4RT-PCR檢測(cè)MBP mRNA、MOG mRNA的表達(dá)水平

1．4．1Trizol法提取總RNA樣品中加入1 mlTrizol混勻后，按一步法步驟抽提總RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA含量，加DEPC水將RNA稀釋到相同質(zhì)量濃度(0.5μg／μl)。

1．4．2逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 2 μg RNA以0.2 μg Oligo(dT)18為引物，15μl反應(yīng)體系在PCR儀上70℃預(yù)變性5 min，然后加入5×RT Buffer 8μl、dNTP1.25μl、RNasin 20 U、MMLV 200 U和DEPC水共40 μl體系，37℃60min，95 ℃ 5 min，然后4℃保存。

1．4．3PCR擴(kuò)增取5 μl cDNA用于擴(kuò)增。50 μl反應(yīng)體系中加入10×Buffer 5 μl、MgCl₂ 4μl、dNTP1 μl、TaqDNA聚合酶2.5 u、正義和反義引物各1μl和水。

MBP引物上游序列為5-TCC GGA G GT TCAGGT GCA CG-3，下游序列為5-CTG GAC TCTCAC AGC TGC CC-3，擴(kuò)增片段長(zhǎng)292 bp。

β-actin引物上游序列為5-CTC CTF AAT GACCTC GCC ATC CC-3，下游引物序列為5-GATCTF GAT CTF CAT GGT GCT AGG-3，擴(kuò)增片段長(zhǎng)764 bp。擴(kuò)增條件：94℃4 min，接94℃45 s，60℃退45 s，72℃1 min，循環(huán)30次后接72℃ 延伸7min。

MOG引物上游序列為5一CCG GGC TIT AGTTGG GGA TGA-3，下游序列為5-CAC GGC GGCTrC 1TC TFG GTA G－3，擴(kuò)增片段長(zhǎng)236 bp。

β-actin引物上游序列為5-GAG AGG GAAATG TGG TGA－3，下游引物序列為5－CAT CTGCTG GAA GGT GGA CA-3，擴(kuò)增片段長(zhǎng)452 bp。擴(kuò)增條件：94℃4 min，接94℃45 s，60℃退火45s，72℃1 min，循環(huán)30次后接72℃延伸7 min。

1．4．4結(jié)果分析以β-actin為內(nèi)參照，取目的基因和β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物6μl在1％瓊脂糖凝膠平板上電泳，結(jié)果用計(jì)算機(jī)數(shù)字掃描密度影像分析儀進(jìn)行半定量分析。

1．5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以?xún)?nèi)參照β-actin吸光度值標(biāo)化MBP和MOG吸光度值，得到相應(yīng)基因表達(dá)的相對(duì)含量。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示，應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)資料進(jìn)行分析。組問(wèn)均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1不同缺血．再灌流時(shí)間MBP mRNA的變化

大鼠全腦缺血-再灌流后海馬組織內(nèi)MBPnRNA表達(dá)隨著再灌流時(shí)間延長(zhǎng)而降低，2 d時(shí)即已降低，但與假手術(shù)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，至7 d時(shí)顯著降低，并持續(xù)至28 d時(shí)達(dá)到高峰。與假手術(shù)組比較，大鼠海馬組織內(nèi)MBP mRNA表達(dá)于再灌流后7 d、14 d、28 d差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2．2不同缺血-再灌流時(shí)間MOG mRNA的變化

MOG mRNA表達(dá)變化與MBP mRNA相似。MOG mRNA表達(dá)隨著再灌流時(shí)間延長(zhǎng)而降低，2 d時(shí)即已顯著降低，與假手術(shù)組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，至14 d時(shí)降低明顯(P＜0.01)，并持續(xù)至28 d時(shí)達(dá)到高峰。從表達(dá)相對(duì)含量的數(shù)值可見(jiàn)假手術(shù)組表達(dá)維持在較高水平，全腦缺血后表達(dá)下調(diào)，至14 d時(shí)僅為假手術(shù)組的50％～60％(P＜0.01)。MOG mRNA表達(dá)呈時(shí)間依賴(lài)性下調(diào)。

3討論

不管何種臨床類(lèi)型的缺血性腦卒中，大多數(shù)情況下急性腦缺血都將影響到腦白質(zhì)。然而對(duì)灰質(zhì)缺血性損傷的研究卻比白質(zhì)要深入的多。實(shí)際上白質(zhì)對(duì)缺血缺氧有選擇易損性。許多證據(jù)支持少突膠質(zhì)細(xì)胞在某一發(fā)育階段對(duì)缺血缺氧有高度敏感性這一假說(shuō)。脫髓鞘是中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血缺氧后最常見(jiàn)的病理改變之一。但脫髓鞘前的分子水平改變尚不清楚。海馬是缺血易損傷區(qū)域之一，少突膠質(zhì)細(xì)

胞主要分布于白質(zhì)內(nèi)，在海馬及灰質(zhì)中也可見(jiàn)，尤其是少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。少突膠質(zhì)前體細(xì)胞在海馬、皮質(zhì)、白質(zhì)中的分布密度是一致的，密度在88～140／mm²，海馬中少突膠質(zhì)細(xì)胞與其前體細(xì)胞的比值為1：1。基于這些原因，我們選擇海馬區(qū)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象來(lái)觀察全腦缺血損傷后髓鞘基因表達(dá)的變化規(guī)律。MBP主要分布于致密髓鞘中，它的沉積被認(rèn)為是髓鞘合成的精確指數(shù)，而MOG特異性存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘和少突膠質(zhì)細(xì)胞，MOG主要表達(dá)于少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育的晚期階段，被認(rèn)為是少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟的標(biāo)記物。本實(shí)驗(yàn)采用SD大鼠四血管閉塞全腦缺血模型、RT-PCR技術(shù)檢測(cè)MBP mRNA、MOG nRNA來(lái)研究腦缺血后髓鞘基因表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，海馬區(qū)MBP mRNA和MOG mRNA表達(dá)在腦缺血后2 d即已有降低，且隨著再灌流時(shí)間延長(zhǎng)，基因表達(dá)水平逐漸降低，至7d時(shí)顯著下降，并持續(xù)至28 d時(shí)。全腦缺血損傷后海馬區(qū)MBP mRNA和MOG mRNA表達(dá)的顯著降低清楚地表明大鼠缺血缺氧除造成神經(jīng)元損傷外，也導(dǎo)致髓鞘基因表達(dá)的變化。這些現(xiàn)象提示缺血缺氧可造成嚴(yán)重的少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷。髓鞘的減少也許是少突膠質(zhì)前體細(xì)胞丟失的結(jié)果，也可能與少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育延遲造成功能不良有關(guān)。在缺血后7 d內(nèi)所見(jiàn)的初期

MBP mRNA、MOG mRNA表達(dá)減少可能是少突膠質(zhì)細(xì)胞早期凋亡的結(jié)果，而持續(xù)的表達(dá)減少則歸因于少突膠質(zhì)前體細(xì)胞凋亡，后者將引起少突膠質(zhì)細(xì)胞得不到有效的補(bǔ)充。少突膠質(zhì)前體細(xì)胞至成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞周期大約4周。缺血可能導(dǎo)致出現(xiàn)少突膠質(zhì)細(xì)胞明顯減少的時(shí)間延遲。在發(fā)生早期的凋亡反應(yīng)之后，由于這些細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的生存周期相對(duì)長(zhǎng)，少突膠質(zhì)前體細(xì)胞死亡后少突膠質(zhì)細(xì)胞補(bǔ)償減少，其最終結(jié)果將是脫髓鞘。因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)僅僅檢測(cè)了全腦缺血后28 d內(nèi)髓鞘基因表達(dá)的變化，目前尚不清楚髓鞘基因表達(dá)的減少是否會(huì)持續(xù)一段時(shí)間，或通過(guò)某種代償機(jī)制使其表達(dá)恢復(fù)正常。

白質(zhì)損傷的機(jī)制較為復(fù)雜，神經(jīng)元損傷的發(fā)病機(jī)制不完全適用于白質(zhì)損傷。已證實(shí)，幾種機(jī)制在缺血缺氧性白質(zhì)損傷中起重要作用。這些機(jī)制涉及血流量及其調(diào)節(jié)相關(guān)的許多因素以及凋亡、自由基形成、細(xì)胞因子和興奮毒性釋放等。作者認(rèn)為不僅引發(fā)髓鞘基因表達(dá)變化的因素是多元性的，而且髓鞘基因表達(dá)變化將直接導(dǎo)致蛋白質(zhì)損傷。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持在腦缺血缺氧過(guò)程中白質(zhì)的主要成分——少突膠質(zhì)細(xì)胞受到破壞的觀點(diǎn)。缺血缺氧導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞變性、髓鞘破壞及髓鞘基因表達(dá)異常。這意味著卒中后僅僅針對(duì)神經(jīng)元死亡的病理生理學(xué)機(jī)制進(jìn)行保護(hù)治療并不能獲得明顯的療效，但是若能在保護(hù)神經(jīng)元的同時(shí)兼顧保護(hù)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞將有助于減輕神經(jīng)功能的缺損。