王芙蓉　姜永生　劉　艷　肖文伍　張?zhí)K明

【摘要】目的觀察大腦中動(dòng)脈栓塞模型轉(zhuǎn)基因小鼠中bcl-xl的過(guò)表達(dá)對(duì)腦缺血后再灌流的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法建立bcl-xl過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠模型，將該模型小鼠與同種系野生型小鼠同時(shí)行線栓永久性阻塞大腦中動(dòng)脈，在缺血24 h時(shí)測(cè)其神經(jīng)功能評(píng)分，觀察轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠的差別。在缺血后不同時(shí)間點(diǎn)分別檢測(cè)兩種小鼠梗死體積及其動(dòng)態(tài)變化、腦組織中bcl-xl的表達(dá)量的差異、再灌流時(shí)凋亡細(xì)胞的數(shù)量和分布情況以及腦中細(xì)胞色素c及caspase-3的表達(dá)量及分布情況。結(jié)果轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分低于野生型小鼠。在缺血后不同時(shí)間點(diǎn)，轉(zhuǎn)基因小鼠的梗死體積小于并且皮質(zhì)缺血區(qū)內(nèi)的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯少于野生型小鼠，且保護(hù)作用發(fā)生時(shí)間早，持續(xù)時(shí)問(wèn)較長(zhǎng)。梗死前后轉(zhuǎn)基因小鼠的皮質(zhì)細(xì)胞bcl-xl的表達(dá)量均明顯高于野生型小鼠，且梗死后兩種小鼠體內(nèi)的bcl-xl的表達(dá)量均有所增加，但兩者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。缺血后再灌流后不同時(shí)問(wèn)點(diǎn)，轉(zhuǎn)基因小鼠缺血局部細(xì)胞色素c的表達(dá)及caspase-3的活化明顯低于野生型小鼠。結(jié)論在規(guī)范化的標(biāo)準(zhǔn)條件下，轉(zhuǎn)基因小鼠中bcl-xl基因的過(guò)表達(dá)能夠降低腦梗死的體積并改善小鼠的神經(jīng)功能。過(guò)表達(dá)bcl-xl基因的這種效應(yīng)可能是通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的，其機(jī)制可能是bcl-xl基因的過(guò)表達(dá)抑制了細(xì)胞色素c的釋放及caspase-3的活化。

【關(guān)鍵詞】轉(zhuǎn)基因小鼠；腦梗死；bcl-xl基因；細(xì)胞色素c；caspase－3

腦梗死是一類發(fā)病率和病死率都很高的疾病，目前尚無(wú)理想的治療措施。病理生理機(jī)制復(fù)雜，包括細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)的破壞、胞內(nèi)鈣的增加、興奮性神經(jīng)毒性物質(zhì)及自由基的損傷等。缺血所致的梗死和神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)，凋亡神經(jīng)元的多少?zèng)Q定著梗死面積的最終大小。肖文伍等研究表明，bcl-xl在體外能夠抑制神經(jīng)元的凋亡?；谏鲜霰尘?，筆者用所建立的過(guò)表達(dá)bcl-xl基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，制作大腦中動(dòng)脈線栓模型，與野生型小鼠比較其梗死體積及神經(jīng)功能評(píng)分的差異，用TUNEL觀察溶栓后不同時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞的數(shù)量及動(dòng)態(tài)分布變化，同時(shí)檢測(cè)了細(xì)胞色素c及caSpaSe-3的表達(dá)水平，深入研究其機(jī)制，以期為腦缺血的基因治療及細(xì)胞生物學(xué)治療新途徑的開(kāi)辟奠定理論基礎(chǔ)。

1材料和方法

1．1轉(zhuǎn)基因小鼠的建立、檢測(cè)及傳代

通過(guò)顯微注射將PstI線性化的表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入昆明白小鼠受精卵中并移植入假孕鼠受精卵中，產(chǎn)生出子代小鼠。對(duì)子代小鼠進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)陽(yáng)性的小鼠進(jìn)行繁殖傳代。

1．2動(dòng)物分組

選用12～16周齡的6號(hào)小鼠的第四代子代雄性昆明白鼠，均經(jīng)檢測(cè)為bcl-xl過(guò)表達(dá)小鼠，體重均為30－35 g；另取同齡雄性昆明白小鼠(購(gòu)自同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房)作為野生型小鼠。

選取兩組動(dòng)物各18只，在控制其它實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)它們進(jìn)行線栓，于24 h時(shí)觀察神經(jīng)功能評(píng)分情況。并分別于6 h、24 h、72 h后殺鼠，TFC染色，觀察它們的腦梗死體積。

另選取轉(zhuǎn)基因小鼠及野生型小鼠兩組動(dòng)物各26只，在控制其它實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)它們進(jìn)行線栓，分別于缺血．再灌流后6 h、24 h、72 h(每組6只)取腦觀察，每組同時(shí)有假手術(shù)組小鼠4只，陰性對(duì)照小鼠4只。了解內(nèi)源性bcl-xl在缺血前后的表達(dá)變化。

選取兩組動(dòng)物各32只，用Western-blot方法觀察缺血．再灌流后3 h、6 h、12 h及24 h時(shí)(每組6只)細(xì)胞色素c及caspase．3的表達(dá)情況，每組同時(shí)有假手術(shù)組小鼠4只，陰性對(duì)照小鼠4只。

1．3線栓的制備及手術(shù)操作

控制好小鼠的品系、體重與線栓規(guī)格的匹配以及術(shù)后溫度等因素，保證小鼠線栓模型有較好的穩(wěn)定性。

1．4儀器設(shè)備

YXK-5G型嬰兒培養(yǎng)箱(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)；TGL-16G離心機(jī)(國(guó)產(chǎn))；紫外分光光度計(jì)(PhannaciaBioteeh，英國(guó))；顯微攝影儀(OLYMPUS，日本)；兔抗bcl-xl抗體(Santa Cruz)，兔抗cytochrome c抗體(PharMingen)兔抗caspase-3抗體(Santa Cruz)，兔抗caspase-3 P17抗體(cell signaling)。

1．5梗死體積的計(jì)算

采用HPIAS-1000高清晰度圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，測(cè)量每片的梗死面積和總面積，每層梗死體積為該層梗死面積和層厚的乘積，各層的梗死體積之和即為總的梗死體積。

1．6神經(jīng)功能評(píng)分

在術(shù)后24 h采用5分制評(píng)分法對(duì)小鼠進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分由本試驗(yàn)以外的同學(xué)完成。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分表示無(wú)神經(jīng)損傷體征；1分表示不能完全伸直對(duì)側(cè)前爪；2分表示向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分表示向?qū)?cè)傾倒；4分表示不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。

1．7數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用HPIAS-1000高清晰度圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。參考圖譜每張切片觀察6個(gè)區(qū)域，計(jì)數(shù)2個(gè)表達(dá)最強(qiáng)高倍鏡視野(×400)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示。采用SPSS 12．0 forWindows統(tǒng)計(jì)軟件處理。假手?jǐn)?shù)組及相鄰時(shí)間點(diǎn)的比較采用方差分析后q檢驗(yàn)；各相應(yīng)時(shí)問(wèn)點(diǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠之間的比較均采用方差分析及SNK-q檢驗(yàn)。神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果采用Ridit分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

將線栓后24 h的轉(zhuǎn)基因小鼠及野生型小鼠分別進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果見(jiàn)圖1。用TIC染色并計(jì)算其梗死體積，結(jié)果見(jiàn)表1。梗死體積在各不同時(shí)間點(diǎn)之間的兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，且各組問(wèn)的兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠中凋亡細(xì)胞的分布結(jié)果見(jiàn)表2。梗死前轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中bcl-xl蛋白的表達(dá)量明顯高于野生型小鼠，而在缺血．再灌流后3 h時(shí)，兩種小鼠bcl-xl的表達(dá)量較梗死明顯增加(P＜0.05)，且梗死后兩種小鼠的bcl-xl的表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但所增加的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠阻塞大腦中動(dòng)脈后，于再灌流3、6、12及24 h細(xì)胞色素C的比較見(jiàn)圖2，caspase-3中P17蛋白與表達(dá)的比較見(jiàn)圖3，caspase-3的免疫組化見(jiàn)圖4。

3討論

作為bcl-2家族的一員，bcl-xl在局灶性腦缺血中起著重要的神經(jīng)元保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)用轉(zhuǎn)基因的方法使該基因在神經(jīng)細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出強(qiáng)大的神經(jīng)元保護(hù)功能：在總體水平上，bcl-xl轉(zhuǎn)基因小鼠的腦梗死體積在缺血后24 h時(shí)較野生型小鼠降低了30％，轉(zhuǎn)基因小鼠的缺血區(qū)中凋亡

細(xì)胞數(shù)也較野生型小鼠明顯減少，與梗死體積的降低結(jié)果相一致。Kim等以及Wissner等發(fā)現(xiàn)，bcl-xl轉(zhuǎn)基因小鼠具有腦保護(hù)作用而bcl-2轉(zhuǎn)基因小鼠沒(méi)有此作用，bcl-xl在缺血所導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷中起重要作用。本研究結(jié)果顯示，在線栓后24 h所進(jìn)行的神經(jīng)功能評(píng)分中，轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分明顯低于非轉(zhuǎn)基因小鼠。同時(shí)在缺血90 min后再灌流3 h時(shí)，兩種小鼠均可檢測(cè)到凋亡細(xì)胞，與正常組及假手術(shù)組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，但轉(zhuǎn)基因小鼠的凋亡細(xì)胞明顯少于野生型小鼠(P＜0.01)，說(shuō)明bcl-xl可能在缺血的早期即已開(kāi)始發(fā)揮抗凋亡作用。缺血一再灌流24 h時(shí)，兩種小鼠的凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)均有明顯增加(P＜0.01)，且達(dá)到高峰，轉(zhuǎn)基因小鼠仍顯示較強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用，其凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯低于野生型小鼠(P＜0.01)。在缺血一再灌流后72 h，兩種小鼠的凋亡細(xì)胞數(shù)均有所減少(P＜0.05)。但從總體來(lái)看，轉(zhuǎn)基因小鼠的凋亡細(xì)胞數(shù)一直明顯維持于相對(duì)較低的水平。筆者推測(cè)，這與過(guò)表達(dá)的bcl-xl的抗凋亡作用有關(guān)，但這種作用是通過(guò)何種機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)的，也是研究的重點(diǎn)。

有資料研究表明，缺血一再灌流后的急性期具有bcl-xl表達(dá)的短暫上升，此時(shí)轉(zhuǎn)基因小鼠的腦保護(hù)作用是否是通過(guò)影響內(nèi)源性bcl-xl的表達(dá)而引起?筆者檢測(cè)了梗死前后轉(zhuǎn)基因小鼠及野生型小鼠腦中的bcl-xl蛋白的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，梗死后兩種小鼠的bcl-xl的表達(dá)量雖都有增加，但所增加的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。筆者因此推測(cè)，缺血所誘導(dǎo)的內(nèi)源性bcl-xl的產(chǎn)生水平在轉(zhuǎn)基因小鼠及野生型小鼠之問(wèn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，轉(zhuǎn)基因小鼠的這種保護(hù)作用不是通過(guò)調(diào)動(dòng)內(nèi)源性bcl-xl的產(chǎn)生實(shí)現(xiàn)的，而可能是外源過(guò)表達(dá)的bcl-xl所起的作用。

另外一個(gè)問(wèn)題是在神經(jīng)元缺血性損傷時(shí)，凋亡的機(jī)制如何被啟動(dòng)?在非神經(jīng)系統(tǒng)中，已證實(shí)有兩種凋亡途徑。外源性途徑，由死亡受體介導(dǎo)；內(nèi)源性途徑，由線粒體介導(dǎo)。目前的證據(jù)證實(shí)，在神經(jīng)元的缺血．再灌流損傷中，兩條凋亡途徑均被激活。在內(nèi)源性途徑中的一個(gè)關(guān)鍵的步驟，就是線粒體釋放細(xì)胞色素C，釋放出來(lái)的細(xì)胞色素C可以在ATP或dATP存在的情況下，使凋亡蛋白酶沽化因子Apaf-1(apoptotic protease-activating factor-1)發(fā)生構(gòu)象變化而活化，活化的Apaf-1借助N-端的CARD(caspase-recmitment domain)結(jié)構(gòu)域經(jīng)同源作用于procaspase-9分子中的CARD結(jié)構(gòu)域寡聚化形成apoptosome復(fù)合體，促使procaspase-9自身活化，活化的caspase-9激活下游的效應(yīng)酶如caspase-3，2，7等，切割特定的凋亡底物，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。caspase-9存在于線粒體中并與細(xì)胞色素c同時(shí)釋放。

筆者的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因小鼠中，細(xì)胞色素c的釋放水平一直較低，直至再灌流后24 h時(shí)，細(xì)胞色素c才有較高的表達(dá)，但仍明顯低于野生型小鼠，而在缺血．再灌流的早期，caspase-3的活化受到了抑制。筆者推測(cè)bcl-xl的過(guò)表達(dá)能夠抑制細(xì)胞色素c的釋放，并在再灌流的早期能夠抑制caspase-3的活化。

目前，基因治療越來(lái)越受到人們的廣泛關(guān)注。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中基因治療已經(jīng)證實(shí)有很好的效果。由本研究結(jié)果筆者想到，若能夠通過(guò)基因治療，將bcl-xl基因轉(zhuǎn)移到腦缺血患者體內(nèi)，則可以達(dá)到很好的治療效果。在人們具有患某種病的危險(xiǎn)因素時(shí)，即將特定的治療基因轉(zhuǎn)入患者體內(nèi)，在正常情況下，這種外源基因保持靜止，而一旦一定的致病因素促發(fā)了特定的基因，即引起該基因在體內(nèi)的表達(dá)，從而達(dá)到預(yù)定的治療目的。這也可能構(gòu)成一種腦缺血損傷及其他慢性損傷新的防治策略。