龐陽(yáng)康

摘要：目的：探討蜂膠對(duì)力竭游泳運(yùn)動(dòng)小鼠免疫功能的影響。 方法:38只小鼠隨機(jī)分為兩組蜂膠組和對(duì)照組，都進(jìn)行力竭游泳訓(xùn)練，蜂膠組采用0.1 mL／lOg·bw劑量的蜂膠給小鼠經(jīng)口灌胃30 d，分別測(cè)定免疫器官臟器／體重比值，進(jìn)行外周血白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、外周血T細(xì)胞亞群（CD₈+%、CD₄+%、CD₄+/CD₈+）的測(cè)定。結(jié)果與對(duì)照組比較，蜂膠能明顯提高小鼠的CD₄+%、CD₄+/CD₈+、胸腺體重比值。 結(jié)論：蜂膠具有增強(qiáng)力竭游泳小鼠免疫力的作用。

關(guān)鍵詞：蜂膠; 力竭游泳運(yùn)動(dòng);免疫

中圖分類號(hào)：G804.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007-3612(2008)03-0353-03

免疫功能與運(yùn)動(dòng)的關(guān)系越來越引起人們的重視，普遍認(rèn)為體育鍛煉可以提高機(jī)體的抗氧化能力提高免疫參數(shù)，增強(qiáng)機(jī)體吞噬細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞的活性，防止感染的發(fā)生［1］。但大量研究表明過度訓(xùn)練或運(yùn)動(dòng)會(huì)引起機(jī)體免疫功能下降。過度運(yùn)動(dòng)包含兩方面的意義：一是運(yùn)動(dòng)負(fù)荷超過機(jī)體的承受能力，機(jī)體在精神、能量方面的過度消耗，導(dǎo)致免疫機(jī)能下降；二是指機(jī)體在身體機(jī)能正常情況時(shí)所承受的運(yùn)動(dòng)量和強(qiáng)度，當(dāng)機(jī)體的某些機(jī)能發(fā)生改變時(shí)，如連續(xù)大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練時(shí)恢復(fù)手段無效、營(yíng)養(yǎng)不良、情緒突變和思想波動(dòng)等，使正常的負(fù)荷變成超量負(fù)荷，主動(dòng)運(yùn)動(dòng)變?yōu)楸粍?dòng)運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致機(jī)體免疫機(jī)能下降［2］。因此，不同運(yùn)動(dòng)量對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生不同的影響。因此尋找有效的方法防治過度訓(xùn)練引起的機(jī)體免疫功能下降, 意義重大。

蜂膠是蜜蜂采集植物樹脂，并混入蜜蜂唾腺分泌物及蜂蠟、花粉等經(jīng)加工而成的一種粘稠物質(zhì)［3］。從藥學(xué)角度看，蜂膠是一味動(dòng)、植物雙性的中藥，芳香，味苦，酸、甘、平，含有蛋白質(zhì)、糖類、酶類、花粉、無機(jī)鹽類等。從化學(xué)結(jié)構(gòu)和成分來看，蜂膠含有20余類、300多種天然成份，其中包括30多種人體必需的微量元素、20種氨基酸、數(shù)埂種芳香化合物70多種黃酮類物質(zhì)，還有豐富的有機(jī)酸、菇烯類物質(zhì)、維生素、木脂體、酶類多糖等具有生物活性的天然成份［4］。近年來研究表明，盡管不同地區(qū)蜂膠化學(xué)成分相差很大，但是它們具有相似的生物學(xué)活性［5］。從生物學(xué)活性角度看蜂膠具有抗菌消炎、抗病毒、抗真菌、排除毒素、增強(qiáng)免疫力、軟化血管降低血脂、凈化血液、改善微循環(huán)、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫功能［6］。本文從生物學(xué)的角度研究了蜂膠對(duì)小鼠的免疫功能的影響。我們以小鼠游泳訓(xùn)練模型研究蜂膠對(duì)運(yùn)動(dòng)小鼠免疫器官、和相關(guān)免疫指標(biāo)的影響, 為蜂膠的研制、開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用50只體重(17.85±2.25)g，鼠齡8周，健康雄性昆明種小鼠（由廣東醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供），在安靜、室溫條件下喂養(yǎng)，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料，每天定時(shí)通風(fēng)。分籠飼養(yǎng)，鼠籠規(guī)格25 cm×15 cm×18 cm，每籠5 只，分組前進(jìn)行一次性游泳訓(xùn)練1 h，出現(xiàn)溺水或運(yùn)動(dòng)能力不足者予以剔除。篩選出的38只適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為兩組進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器小鼠恒溫游泳缸，超凈工作臺(tái)，電子分析天平（型號(hào)GS223，日本SHINKO新電子天平）流式細(xì)胞儀(Beckman coulter cell 型號(hào) Cell Lab Quanta SC)光學(xué)顯微鏡，恒溫箱，離心機(jī)，血紅蛋白吸管，眼科剪，普通剪刀等。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑及方法受試的蜂膠樣品來源于北京某蜂產(chǎn)品企業(yè)，其性狀為棕褐色油性膏狀物。試驗(yàn)時(shí)按所設(shè)劑量取樣品加植物油配制所需濃度，分別給受試動(dòng)物灌胃，灌胃體積為0.1 mL／lOg·bw，溶劑對(duì)照組給予等體積植物油，每天灌胃1次,一直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束共60 d。其他還有三氯乙醛，肝素，生理鹽水等。

1．4實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽?/p>

1.4.1動(dòng)物分組篩選后的動(dòng)物（38只小鼠）按體重隨機(jī)分為2組，常規(guī)喂養(yǎng)，喂養(yǎng)時(shí)間為8 周，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，適應(yīng)性運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練1 周，Ⅱ組即蜂膠組小鼠灌胃（ig）8周。Ⅰ組：對(duì)照組：選20 只小鼠，以生理鹽水0.1 mL/10 g/日灌胃。

1.4.2運(yùn)動(dòng)條件游泳缸直徑70 cm，水深40 cm，水溫30℃左右，密度50 cm2/只。

1.4.3運(yùn)動(dòng)方式Ⅰ、Ⅱ組均進(jìn)行負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中使每只小鼠四肢不停運(yùn)動(dòng)，如果小鼠漂浮在水面停止活動(dòng)，可用木棒在其附近輕輕攪動(dòng)使之繼續(xù)活動(dòng)。負(fù)重方式：在小鼠尾部系上施加相當(dāng)于自身體重4%的負(fù)荷的鐵片。

1．4．4運(yùn)動(dòng)方案以1 周為1 單元，每只小鼠每周訓(xùn)練5 次，周末休息。Ⅰ、Ⅱ組：第1～3 d適應(yīng)性游泳30 min，第4～6 d每天遞增10 min 逐漸延長(zhǎng)至60 min，第7 d休息，然后每天以60 min 游泳1 次。適應(yīng)性訓(xùn)練1周后，對(duì)小鼠進(jìn)行力竭性游泳訓(xùn)練（在小鼠尾部附加相當(dāng)于自身體重4％的負(fù)荷），每天1次， 每周5次，持續(xù)8周。

1.4.5力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)按Dawson 法［7］1) 小鼠游泳動(dòng)作明顯失調(diào)（劃水頻率極其緩慢，連續(xù)下沉），不能再堅(jiān)持；

2) 沉入水底8 s不能回到水面；

1.5樣本采集于運(yùn)動(dòng)后即刻,用三氯乙醛腹腔麻醉,腹主動(dòng)脈取血3 mL,肝抗凝。靜置30 min后2 500轉(zhuǎn)/min離心10 min,取上清液體保存于小試管中, -20℃凍存待測(cè)。然后稱重后處死小鼠,取出胸腺和脾臟。

1.6指標(biāo)的測(cè)試和方法脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的測(cè)定:

分別采用稱重法, 測(cè)量?jī)x器為日本SHINKO新電子天平，型號(hào)GS223。具體方法: 稱量小鼠體重(g) 后處死小鼠,取出并稱量脾臟(mg) , 胸腺(mg) , 分別計(jì)算脾指數(shù)和胸腺指數(shù), 脾指數(shù)= 脾重/體重(mg/ g) , 胸腺指數(shù)= 胸腺重/體重(mg/g)。

外周血WBC、淋巴細(xì)胞數(shù)量的測(cè)定：

取20 μL全血，放入事先加好血細(xì)胞稀釋液試管（1∶200 稀釋），用Culltae MEK-6318K 血細(xì)胞分析儀（日本光電公司制造）測(cè)定WBC、淋巴細(xì)胞數(shù)量。

T淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定：

取25 μL肝素抗凝血，加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗小鼠CD4或CDsMcAb(購(gòu)自美國(guó)Pharmingen公司)33 μL(pH7．2的PBS對(duì)倍稀釋)，混勻，事溫孵育30 min，加入750 μL雙蒸水于抗凝血中溶血，混勻后再加入750 μLpH7．2的PBS稀釋血液，流式細(xì)胞儀(Beckman coulter cell 型號(hào) Cell Lab Quanta SC)檢測(cè)小鼠外周血CD₄+T、CD₈+T淋巴細(xì)胞的百分率(各檢測(cè)5 000個(gè)細(xì)胞)，測(cè)定結(jié)果采用Cell Quest功能軟件進(jìn)行參數(shù)獲取和數(shù)據(jù)分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)用SPSS 10.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示,采用t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2．1蜂膠對(duì)小鼠外周血WBC 和淋巴細(xì)胞的影響由表1可見，單純訓(xùn)練組即對(duì)照組的大鼠外周血WBC和淋巴細(xì)胞數(shù)值與文獻(xiàn)參考值［7，8］相比較低，提示大強(qiáng)度力竭運(yùn)動(dòng)可能造成免疫功能下降。補(bǔ)充蜂膠組的WBC、淋巴細(xì)胞數(shù)值均接近文獻(xiàn)中的正常小鼠數(shù)值，但各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2蜂膠對(duì)小鼠外周血T細(xì)胞亞群的影響表2顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠外周血CD₄+百分比、CD₄+/CD₈+與對(duì)照組相比出現(xiàn)顯著性差（P<0.05），而CD₈+百分比未出現(xiàn)明顯變化,提示長(zhǎng)時(shí)間大負(fù)荷游泳訓(xùn)練能降低小鼠外周血CD₄+百分比和CD₄+/CD₈+比值, 從而抑制小鼠T細(xì)胞免疫功能, 蜂膠能提高運(yùn)動(dòng)小鼠外周血D4+百分比、CD₄+/CD₈+比值, 從而具有抵抗力竭游泳訓(xùn)練對(duì)T淋巴細(xì)胞免疫功能的抑制作用。

2．3蜂膠對(duì)小鼠的臟器/ 體重比值的影響

表3顯示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的脾臟/ 體重百分比無顯著差異。胸腺/ 體重百分比試驗(yàn)組出現(xiàn)了顯著增加，提示蜂膠可抵抗長(zhǎng)時(shí)間力竭游泳訓(xùn)練引起的機(jī)體免疫器官的損傷。

3討論

現(xiàn)有大量研究已證實(shí)不同的運(yùn)動(dòng)對(duì)免疫系統(tǒng)的影響并不一致。反應(yīng)免疫系統(tǒng)變化的方法和指標(biāo)很多，主要免疫指標(biāo)包括免疫細(xì)胞、白介素、免疫球蛋白、細(xì)胞因子等［9］。

關(guān)于運(yùn)動(dòng)和免疫的關(guān)系，目前的研究很多，得出的結(jié)論也各有不同，目前達(dá)成共識(shí)的是：適度的運(yùn)動(dòng)可增強(qiáng)機(jī)體免疫力,而過度或激烈運(yùn)動(dòng)則會(huì)產(chǎn)生較多自由基，進(jìn)一步降低機(jī)體免疫力。因此,如何減輕過度訓(xùn)練引致的機(jī)體免疫力下降、提高機(jī)體抗氧化的免疫功能成了研究熱點(diǎn)［10］。

胸腺和脾臟屬于機(jī)體免疫器官, 在T 細(xì)胞發(fā)育、成熟和T、B 細(xì)胞發(fā)揮免疫監(jiān)控過程中發(fā)揮重要作用。研究表明過量運(yùn)動(dòng)會(huì)損傷機(jī)體免疫器官, 導(dǎo)致脾臟和胸腺重量降低,并發(fā)生結(jié)構(gòu)的變化, 使器官的免疫反應(yīng)降低。［11］本研究結(jié)果亦提示長(zhǎng)時(shí)間大負(fù)荷訓(xùn)練會(huì)降低胸腺、脾臟重量, 而蜂膠可抵抗長(zhǎng)時(shí)間大負(fù)荷訓(xùn)練引起的機(jī)體免疫器官的損傷。但我們的研究結(jié)果顯示蜂膠組的胸腺/體重比之增大，而脾臟/體重比值無明顯變化，相關(guān)機(jī)制尚不清楚。考慮可能原因是8周月齡小鼠胸腺組織尚未退化，對(duì)蜂膠的刺激反應(yīng)強(qiáng)烈 ，而脾臟組織屬外周淋巴器官，其變化需要較長(zhǎng)時(shí)間用藥才能表現(xiàn)出來。

T 淋巴細(xì)胞按表型不同分為CD₄⁺ 、CD₈⁺兩大亞群, 根據(jù)分泌細(xì)胞因子的不同又分為I 型T 細(xì)胞(Thl 和Tcl ) 和Ⅱ型T 細(xì)胞(TH₂和Tc2) 兩大亞群［12］。大量研究表明過量運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致外周血CD₄⁺百分比和CD₄⁺ /CD₈⁺比值降低,從而抑制機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)［13～15］。本研究結(jié)果亦提示長(zhǎng)時(shí)間大負(fù)荷訓(xùn)練會(huì)降低機(jī)體外周血CD₄⁺百分比和CD₄⁺/CD₈+比值而對(duì)CD₈⁺百分比影響不大,可能與過量運(yùn)動(dòng)引起血漿皮質(zhì)醇和細(xì)胞因子IL-6的升高,從而刺激CD₄⁺細(xì)胞等有關(guān),我們的研究顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠外周血CD₄⁺百分比、CD₄⁺/CD₈⁺與對(duì)照組相比出現(xiàn)顯著性差（P<0.05），而CD₈+百分比未出現(xiàn)明顯變化,提示長(zhǎng)時(shí)間大負(fù)荷游泳訓(xùn)練能降低小鼠外周血CD₄⁺百分比和CD₄+/CD₈⁺比值,從而抑制小鼠T細(xì)胞免疫功能,蜂膠能提高運(yùn)動(dòng)小鼠外周血D₄⁺百分比、CD₄+/CD₈⁺比值,從而具有抵抗力竭游泳訓(xùn)練對(duì)T淋巴細(xì)胞免疫功能的抑制作用，需要指出的是。胸腺是產(chǎn)生免疫的中樞淋巴器官，使免疫細(xì)胞法分化的場(chǎng)所，主要功能是產(chǎn)生T細(xì)胞和分泌胸腺因子，發(fā)揮細(xì)胞免疫功能，所以，蜂膠能提高運(yùn)動(dòng)小鼠外周血CD₄+百分比、CD₄⁺/CD₈⁺比值也和蜂膠可抵抗長(zhǎng)時(shí)間大負(fù)荷訓(xùn)練引起的機(jī)體免疫器官的損傷，增加胸腺的百分比有關(guān)［16］。

對(duì)照組的大鼠外周血WBC和淋巴細(xì)胞數(shù)值與文獻(xiàn)參考值相比較低，提示大強(qiáng)度力竭運(yùn)動(dòng)可能造成免疫功能下降。補(bǔ)充蜂膠組的WBC、淋巴細(xì)胞數(shù)值均接近文獻(xiàn)中的正常小鼠數(shù)值［7，8］，但各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。許多學(xué)者對(duì)不同訓(xùn)練后白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量的改變進(jìn)行了研究。一次急性訓(xùn)練，運(yùn)動(dòng)時(shí)間少于3 h，在中等強(qiáng)度和大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)中及運(yùn)動(dòng)后即刻，白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞均出現(xiàn)10％～20％不同程度的下降［17］，我們的研究也表示蜂膠能夠使WBC、淋巴細(xì)胞數(shù)值在大強(qiáng)度訓(xùn)練后不至下降得過低。

目前，已從蜂膠中分離鑒定出的成分有黃酮類、萜烯類、醌類、酯類、醇類、酚類、醚類、有機(jī)酸和大量氨基酸、酶類、維生素B1、維生素H2、維生素B6、維生素E和維生素A以及礦物質(zhì)等。其中分離鑒定的黃酮化合物有30余種，包括白楊素、柚柏楊素、芹菜素、金合歡素、槲皮素、蘆丁、山奈酚等，蜂膠大部分的生理及藥理功能都與此類化合物有密切關(guān)系?；瘜W(xué)研究表明，產(chǎn)地不同的蜂膠盡管化學(xué)成分不同，但都不同程度地含有大量黃酮類化合物［18］。

有研究者用蜂膠乙醇提取液(其主要成分為蜂膠黃酮)給免疫力低下的小鼠灌胃，發(fā)現(xiàn)能增強(qiáng)小鼠的抗體生成細(xì)胞活性，提高溶血素的含量，增強(qiáng)單核一巨噬細(xì)胞碳廓清能力［19］。由此，我們推測(cè)蜂膠增強(qiáng)小鼠免疫力可能是黃酮類物質(zhì)發(fā)揮了主要作用。可能是黃酮類物質(zhì)作用于機(jī)體免疫器官一胸腺，刺激其產(chǎn)生T細(xì)胞，或是激活巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞 從而使其發(fā)揮免疫功能。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明蜂膠能增強(qiáng)小鼠的細(xì)胞免疫能力，和免疫器官所占百分比。李淑華等對(duì)免疫功能低下模型鼠細(xì)胞免疫功能的研究,用單克隆抗體技術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠藥物處理前后T細(xì)胞總數(shù)及亞群變化,用MTT法檢測(cè)T細(xì)胞增殖,結(jié)果顯示蜂膠能促進(jìn)ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖,增加T細(xì)胞總數(shù)并調(diào)整T細(xì)胞亞群紊亂［１９］,證明EEP對(duì)免疫功能低下小鼠細(xì)胞免疫功能具有免疫刺激和調(diào)節(jié)作用。提示,大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練后運(yùn)動(dòng)員可以通過服用蜂膠來調(diào)節(jié)其T細(xì)胞亞群和增加T細(xì)胞總數(shù)以改善機(jī)體的免疫功能。

綜上所述 國(guó)內(nèi)外研究證明:蜂膠具有其本身沒有抗原性,但可起到免疫佐劑作用;可以增高丙種球蛋白的效應(yīng),激活巨噬細(xì)胞,增強(qiáng)脾淋巴細(xì)胞的增殖能力,提高血清溶血素(抗體積數(shù))含量,增加T細(xì)胞總數(shù),調(diào)整T細(xì)胞亞群紊亂;它既能增強(qiáng)抗體形成細(xì)胞的功能活性,促進(jìn)機(jī)體增加抗體產(chǎn)生,又能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力和自然殺傷細(xì)胞活性,具有免疫刺激和調(diào)節(jié)作用,提高機(jī)體的特異性和非特異性的免疫功能［2０］。我們的研究也證明了這一點(diǎn)，因此,在長(zhǎng)時(shí)間、大強(qiáng)度訓(xùn)練或比賽期間運(yùn)動(dòng)員服用蜂膠會(huì)對(duì)改善其運(yùn)動(dòng)疲勞或過度疲勞后免疫功能有一定的效能或具有一定的輔助治療作用。

本文僅從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的的角度來探討其提高大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后免疫能力的可能機(jī)理,以起到拋磚引玉的作用。 但蜂膠的組成成分是一個(gè)非常復(fù)雜的復(fù)合體，要明確某種成分起何種生物學(xué)作用，還需要作大量的實(shí)驗(yàn)研究工作。至于其生物學(xué)作用機(jī)理，更是有待于進(jìn)一步探討。

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