馬新東　高前進(jìn)　李俊平

摘要：以雄性Wistar大鼠為研究對象，進(jìn)行“一次性大強(qiáng)度離心運(yùn)動”，一次性離心運(yùn)動實(shí)驗(yàn)為16°下坡跑臺跑，定量大負(fù)荷間歇性運(yùn)動，跑速為26.8 m/min，運(yùn)動5 min×10組，組間歇1 min。離心運(yùn)動后不同時(shí)段取大鼠后肢腓腸肌外側(cè)頭進(jìn)行分析大強(qiáng)度離心運(yùn)動后大鼠骨骼肌細(xì)胞骨架蛋白含量的變化特點(diǎn)；與延遲性骨骼肌損傷時(shí)血清酶升高的關(guān)系；探討細(xì)胞骨架蛋白在骨骼肌纖維中存在的特點(diǎn)和作用。

關(guān)鍵詞：離心運(yùn)動；細(xì)胞外基質(zhì)蛋白；骨骼肌微損傷；膜完整性

中圖分類號：G804.7文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1007-3612(2008)05-0618-05

骨骼肌細(xì)胞膜連接了細(xì)胞內(nèi)骨架與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），在維持骨骼肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮了重要作用。在骨骼肌中基膜（細(xì)胞外基質(zhì)）—肌細(xì)胞膜—細(xì)胞骨架中的一些連接蛋白的缺失導(dǎo)致了骨骼肌疾病從而使人們對它們連接的重要生物作用有了認(rèn)識［1］。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）決定組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，ECM不同成分之間相互作用形成立體骨架結(jié)構(gòu)，對細(xì)胞起著支持作用。細(xì)胞只有通過ECM連接才構(gòu)成組織，ECM決定組織的牽張強(qiáng)度。細(xì)胞外基質(zhì)蛋白在維持肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)以及力的傳導(dǎo)過程中發(fā)揮了重要作用。

對于運(yùn)動后骨骼肌微損傷的發(fā)生及恢復(fù)過程中肌細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)骨架、肌細(xì)胞膜在結(jié)構(gòu)、功能方面的變化的研究已經(jīng)相對比較成熟，但對于骨骼肌細(xì)胞外基質(zhì)在運(yùn)動后結(jié)構(gòu)、功能方面變化的研究目前還較少，因此本研究的目的是探討運(yùn)動后骨骼肌微損傷后ECM中的重要蛋白laminin-2，collagenIV蛋白含量的異同及離心方式運(yùn)動對其影響；探討損傷發(fā)生過程中基質(zhì)蛋白laminin-2基因表達(dá)的變化特征，為今后能夠更加深入全面的研究運(yùn)動后骨骼肌微損傷發(fā)生的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1研究方法

1.1實(shí)驗(yàn)對象與分組雄性Wistar大鼠42只，分為7組，每組6只，體重300～360 g，由北京維通過利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料，分籠飼養(yǎng)，自由飲食，室溫17～23℃，相對濕度60%～75%，保持12 h光照。

正式實(shí)驗(yàn)前3 d，所有動物進(jìn)行5～10 min跑臺運(yùn)動，以熟悉跑臺，速度為5～10 m/min，坡度為0°。大鼠跑臺為杭州段氏制作BCPT-98型。

一次性離心運(yùn)動的實(shí)驗(yàn)大鼠采用Armstrong(1983)［2］、田野［3］所設(shè)計(jì)的-16°下坡跑臺跑，模型略有改進(jìn)，以更適合模擬離心方式運(yùn)動造成的損傷。定量大負(fù)荷間歇性運(yùn)動，跑速為26.8 m/min，相當(dāng)于最大攝氧量的80％～90%［4］，運(yùn)動5 min，間歇1 min，共進(jìn)行10組。給以少量聲、光、電刺激，以激勵大鼠運(yùn)動。

實(shí)驗(yàn)組在一次性離心運(yùn)動后即刻、運(yùn)動后4 h、12 h、24 h、48 h、72 h，取材為每組6只，分別取大鼠后肢腓腸肌外側(cè)頭進(jìn)行分析。安靜對照組取材與實(shí)驗(yàn)組相同部位。

1.2測試樣本的采集與處理1） 大鼠血清的采集：大鼠稱重后，用20%的烏來糖(或稱烏拉坦)按0.01 mL/g體重腹腔注射麻醉，心臟取血置于離心管中，傾斜靜置2～3 h后進(jìn)行常規(guī)血清分離（2 000轉(zhuǎn)/min，15 min），-20℃冰箱保存待測。

2） 用于勻漿的樣本采集：取血后速取左側(cè)腓腸肌外側(cè)頭,切約為4 min×4 min×4 mm3，用錫紙包好、標(biāo)記后放入液氮中冰凍保存，留做勻漿用。

3） 用于冷凍切片的樣本采集：大鼠稱重后，頸椎脫位法處死，取血后小心剪取約3 min×3 min×5 mm的腓腸?。ㄇ形馉坷┩度胗靡旱A(yù)冷的裝有正已烷（-70℃）的小燒杯中速凍，之后用錫紙包好放入液氮中保存，用于冷凍切片。

4） 組織勻漿總蛋白測試：10%勻漿，總蛋白（TP）的測試采用Bradford法［5］（即考馬斯亮藍(lán)法）法。

5） 血清CK、LDH的測試方法：測試采用酶動力法，試劑盒購自北京北控中生生物科技股份有限公司，測試嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行，儀器為MD-100半自動生化分析儀。

6） 羥脯氨酸（hydroxyproline）測試。原理：羥脯氨酸在膠元蛋白中占13.4%,在彈性蛋白中占極少量，其他蛋白中均不存在，因此羥脯氨酸能反映膠元代謝情況。羥脯氨酸在氧化劑的作用下所產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物與二甲氨基苯甲醛作用呈現(xiàn)紫紅色，根據(jù)其呈色的深淺可推算出其含量。

試劑盒購自南京建成生物制品公司，測試嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行，儀器為721分光光度計(jì)。

7） laminin-2原位雜交測試。大鼠Laminin-2基因的寡核苷酸探針序列設(shè)計(jì)參考Maher,J.J等［6］，用Blast在NCBI的RGD（Rat Genome Database）中驗(yàn)證其定位，使用Oligo 6.0驗(yàn)證其不含穩(wěn)定的二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。其序列為： 5' AGGAGGTTGTCAGCAACAGCGGTCTTGACATGGACAACGA 3' ，由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成，3'端地高辛標(biāo)記。

8） 組織切片的圖像分析。組織切片染色后，顯微鏡觀察，通過Panasonic WV-CP410/G攝像頭和BOSER BS602A圖像采集卡進(jìn)行圖像采集，之后用Scion Image (National Institutes of Health, USA)進(jìn)行分析。用Scion Image分別測量不同類型肌細(xì)胞膜染色的光密度，以此反映其含量。每樣本測量上、下、左、右、中部5個(gè)視野。

9） 肌肉勻漿方法：秤取腓腸肌肉樣品，迅速剪碎后放入玻璃勻漿器中，以1:10的比例加入勻漿液進(jìn)行勻漿。

10） 冷凍切片：在SLEE冷凍切片機(jī)上進(jìn)行切片，厚度為15μm，切片恒溫-20℃。將實(shí)驗(yàn)組貼于一張切片上，以便于比較［7］。

1.3指標(biāo)測試與方法11） 肌肉勻漿測SOD、MDA方法：SOD的測試采用黃嘌呤氧化酶法，MDA的測試采用硫代巴比妥酸（TBA）法，試劑盒均購自南京建成生物制品公司，測試嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行，儀器為721分光光度計(jì)。

冷凍切片。固定：切片自然干燥，浸入新鮮配制的4%多聚甲醛中2 min。消化：胃蛋白酶，一般使用濃度為0.4%，消化時(shí)間為37℃、30～180 min，主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的顯示，如：Laminin（層粘蛋白），Collagen IV（IV型膠原）等。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法對觀察分析結(jié)果用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件SPSS11.5進(jìn)行ANOVA單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1離心方式運(yùn)動后血清CK、LDH 以及羥脯氨酸的變化┎饈越峁見表1。

血清CK、LDH的變化呈現(xiàn)相似的趨勢，在離心運(yùn)動后即刻最高隨后呈現(xiàn)下降的趨勢到12 h后達(dá)到最底點(diǎn)，然后呈現(xiàn)上升的趨勢到48 h后又呈現(xiàn)下降趨勢(圖1)。ANOVA分析表明：運(yùn)動后即刻CK與其它各時(shí)段均有非常顯著性差異，玃<0.01;LDH除24 h外的各時(shí)段和即刻組均有顯著性差異,玃<0.05;CK 4 h組高于12 h組、72 h組，差異顯著，玃<0.05;12 h最低，與除24 h外的各段均有顯著差異，玃<0.05；肌組織中SOD值從離心運(yùn)動后即刻開始升高，到12 h達(dá)最高，48 h又有一次高峰，隨后下降。運(yùn)動后肌組織SOD含量，在12 h顯著高于安靜對照、72 h含量，玃＜0.05(表2)。

肌組織中MDA變化規(guī)律與SOD相似(表2，圖3)，在運(yùn)動后即刻開始升高，12 h達(dá)最高，在48 h又有一次高峰趨勢，其后下降。其中12 h肌組織MDA含量與安靜對照、運(yùn)動后48 h、72 h差異顯著，玃＜0.05。圖3，肌組織MDA擴(kuò)大十倍顯示。

2.2運(yùn)動后細(xì)胞外基質(zhì)蛋白含量變化與骨骼肌內(nèi)容物泄漏及自由基代謝變化的相關(guān)分析(表3，圖4)。

圖5，圖6。測量每張切片中5個(gè)視野（左上、左下、中、右上、右下）的藍(lán)紫色顆粒的光密度值，結(jié)果見表4和圖7。

離心運(yùn)動即刻laminin-2基因表達(dá)水平明顯下降與對照組差異顯著，玃＜0.05；隨后逐漸升高，在48 h達(dá)到最大，在4 h后直至72 h均處于較高水平，對照組與4 h組至72 h組差異顯著玃＜0.05(圖7)；

腓腸肌外側(cè)頭，冷凍切片，15 μm厚；寡核苷酸探針，地高辛標(biāo)記，堿性磷酸酶系統(tǒng)顯色，雜交陽性信號為藍(lán)紫色顆粒(圖8)。

腓腸肌外側(cè)頭，冷凍切片，15μm厚；寡核苷酸探針，地高辛標(biāo)記，堿性磷酸酶系統(tǒng)顯色，雜交陽性信號為藍(lán)紫色顆粒(圖9)。

3分析與討論

3.1離心運(yùn)動后大鼠肌纖維中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白laminin-2,cllagenIV含量的變化根據(jù)對腓腸肌組織切片的觀察來看，我們觀察到離心運(yùn)動后腓腸肌更為明顯。ECM的量受到身體活動的影響，一定形式的慢性負(fù)荷練習(xí)可以增加膠元的含量，只不過是膠元合成的類型以及膠元合成的程度情況不同。這些變化可以改變組織的粘彈性以及機(jī)械特性，使組織更易抗拉。［8-9］在laminin-2基因缺失大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)［10-11］，伴隨著laminin-2的減少而CollagenIV含量呈增加趨勢，而本研究卻發(fā)現(xiàn)離心運(yùn)動后laminin-2含量增加伴隨著CollagenIV含量的減少，laminin-2蛋白和CollagenIV之間是否存在著動態(tài)平衡，二者之間的增加和減少是否存在著因果關(guān)系？需要進(jìn)一步研究的證實(shí)。

3.2運(yùn)動后骨骼肌內(nèi)容物泄漏、羥脯氨酸、自由基代謝變化以及骨架蛋白含量變化的相關(guān)分析羥脯氨酸是膠元蛋白的一種主要氨基酸，是反映體內(nèi)膠元代謝的生化標(biāo)志物，在膠元蛋白中占13.4%,在彈性蛋白中占極少量，其他蛋白中均不存在，因此羥脯氨酸能反映膠元代謝情況。血清羥脯氨酸與血清LDH呈負(fù)相關(guān)；而血清羥脯氨酸與collagenIV沒有相關(guān)性，可能和collagenIV本身的特殊性有關(guān)系，collagenIV作為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的一種，在細(xì)胞外基質(zhì)中含量很少并且是基膜的框架結(jié)構(gòu)，也是基膜特有的膠原，在組織中細(xì)胞排列和骨骼肌中維持力的穩(wěn)定性中發(fā)揮著重要的作用［12-13］，在運(yùn)動過程中可能沒有對膠元的代謝產(chǎn)物羥脯氨酸的增加作出貢獻(xiàn)有關(guān),本研究證實(shí)了這一點(diǎn)，即羥脯氨酸雖然是膠元的代謝產(chǎn)物但主要是I、III型膠元的代謝產(chǎn)物，也有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道羥脯氨酸主要是I、III型膠元的代謝產(chǎn)物［14］；肌組織中MDA水平與SOD水平相關(guān)；肌組織中SOD與血清LDH水平負(fù)相關(guān)；

本研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白collagenIV與血清CK呈正相關(guān)；而Mackey, Donnell y（2004）［15］在以人為研究對象進(jìn)行一次性離心運(yùn)動后也同樣發(fā)現(xiàn)了collagenIV與血清CK的明顯的相關(guān)關(guān)系提示可能骨骼肌的離心收縮影響了IV型膠元的代謝更新。

3.3研究骨骼肌在損傷過程中l(wèi)aminin-2基因表達(dá)的變化特征細(xì)胞外基質(zhì)蛋白laminin-2基因mRNA的原位雜交結(jié)果代表了laminin-2基因表達(dá)水平。如圖10所示，離心運(yùn)動即刻laminin-2基因表達(dá)水平明顯下降與對照組差異顯著玃＜0.05，隨后逐漸升高，在48 h達(dá)到最大，在4 h后直至72 h均處于較高水平，對照組與4 h組至72 h組差異顯著；本研究觀察到了即刻laminin-2基因水平的降低但是沒有觀察到蛋白水平的下降，可能和實(shí)際蛋白水平有下降的趨勢但是沒有設(shè)置相應(yīng)的時(shí)相觀察到相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，也有可能離心運(yùn)動后即刻laminin-2基因表達(dá)水平的下降激活了laminin-2基因的調(diào)控過程使得laminini-2基因表達(dá)水平提高從而增加laminin-2蛋白的合成，laminin-2蛋白的升高也有可能和其本身就有較強(qiáng)的修復(fù)能力有關(guān)，從圖11我們可以看到laminin-2基因和蛋白變化有大致相同的趨勢。

4結(jié)論

1） 離心運(yùn)動后基質(zhì)蛋白laminin-2在24 h處于最高水平，24 h與其它各組組差異顯著,其它組間的變化無顯著性差異,說明了laminin-2是有較強(qiáng)調(diào)整和修復(fù)能力的蛋白，其變化有可能是因?yàn)槠湎噜彽鞍椎臏p少而代償性的增加以維持機(jī)體的功能。

2） 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白含量collagenIV的變化與血清CK相關(guān)，提示可能骨骼肌的離心收縮影響了collagenIV的代謝更新；

3） 離心運(yùn)動即刻laminin-2基因表達(dá)水平明顯下降與對照組差異顯著；隨后逐漸升高，在48 h達(dá)到最大，laminin-2基因和蛋白的表現(xiàn)了基本相同的變化趨勢。

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