趙文魯　匡瑞霞　劉　肅　陳　璐

[摘要]目的：通過建立兔耳腹側(cè)增生性瘢痕的模型，探討積雪草甙（Asiaticoside,Ad）對TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響。方法：新西蘭大白兔20只（喂養(yǎng)過程中死亡4只），在兔耳腹側(cè)制備直徑為1cm、深達(dá)軟骨膜的圓形瘢痕93個(gè)，隨機(jī)分為4組：空白對照組、得寶松組、低濃度積雪草甙組（25mg/ml）、高濃度積雪草甙組（50mg/ml），分別于瘢痕制備3天后局部應(yīng)用相應(yīng)藥物，2周后取材，分別測量瘢痕組織TGF-β1 mRNA的表達(dá)量。結(jié)果：積雪草甙組與空白對照組相比，TGF-β1mRNA表達(dá)量明顯降低，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）；積雪草甙與陽性對照組相比，二者mRNA表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；積雪草甙組之間，高濃度組與低濃度組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。結(jié)論：較高濃度積雪草甙注射液局部注射可以減少增生性瘢痕TGF-β1 mRNA的表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]增生性瘢痕瘢痕；積雪草；TGF-β1；熒光PCR

[中圖分類號(hào)]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2009）01-0072-04

Effects of asiaticoside on the expression of TGF-β1 mRNA in hypertrophic scar model of therabbit ears

ZHAO Wen-lu,KUANG Rui-xia,LIU Su，CHEN Lu

(Department of Cosmetic Surgery, the Affiliated Hospital of Medical College Qingdao University, Qingdao 266003,Shandong,China）

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of Asiaticoside on TGF-β1 mRNA expression in hypertrophic scars.MethodsNinety-three full-thickness round wounds (1cm in diameter on ventral side of rabbits ears)on rabbits' ears of 20 rabbits（four died） were created. Then rabbits were randomized into 4 groups: negative group, diprospan group, asiaticoside（25mg/ml）group andasiaticoside（50mg/ml）group. The corresponding injectant were given three days after the scar model was formed lasting for 7days.Samples were collected 2 weeks later and expressions of TGF-β1 mRNA of different groups were detected.ResultsAsiaticoside group has a lower expression of TGF-β1 mRNA compared with negative group（P<0.01），while there are no respective diversity（P>0.05） between asiaticoside group and masculine group. As to the two asiaticoside groups, group of higher concentration has a lower expression of TGF-β1 mRNA and the difference is significant.ConclusionHigher concentration of asiaticoside injected could inhibittheexpressionofTGF-β1 mRNA

Key words: hypertrophic scars; TGF-β1;asiaticoside;quantitative RT-PCR

增生性瘢痕的形成是由于皮膚創(chuàng)傷后的愈合過程中成纖維細(xì)胞過量增殖和膠原纖維過度增生的結(jié)果，增生性瘢痕的防治是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的難題之一，尋找治療和預(yù)防瘢痕增生的藥物具有重要的意義。積雪草甙為積雪草提取物三萜皂甙的主要成分之一，已有的資料顯示，在各種皮膚損傷修復(fù)治療中，無論是在正常創(chuàng)面，還是在延遲愈合的創(chuàng)面中，積雪草甙（Asiaticoside，Ad）均具有促進(jìn)皮膚損傷修復(fù)的藥物活性。臨床上，已有積雪草甙的片劑和霜?jiǎng)┑膽?yīng)用，本實(shí)驗(yàn)是對兔耳增生性瘢痕的局部注射該提取物，通過RT-PCR方法對比研究其前后TGF-β1 mRNA的表達(dá)有無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，進(jìn)而為臨床上治療增生性瘢痕尋找新的治療途徑。

1材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑、儀器：新西蘭大白兔20只，體重2.2～2.7kg，雌雄不拘，購自山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心代為飼養(yǎng)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，死亡2只，剩余18只。積雪草甙標(biāo)準(zhǔn)品，由西安市小草植物開發(fā)有限公司惠贈(zèng)； SYBRPremixScript 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及定量PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）；RT-PCR引物： TGF-β1 mRNA 序列取自美國基因庫，引物采用Primer5軟件設(shè)計(jì)，所有引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成（見表2）；冷凍高速離心機(jī)(日本Sigama公司)、7500 型熒光定量 PCR 儀(美國Bio-Rad公司)、普通離心機(jī)、研磨機(jī)、震蕩儀、-70℃冰箱

1.2 兔耳瘢痕模型的制作：氯胺酮和地西泮按分別按2mg/kg和5mg/kg肌肉注射麻醉，然后在兔雙側(cè)耳腹側(cè)分別作3～4個(gè)直徑為1cm的圓形切口，切口間距1cm，完整切除皮膚全層至軟骨膜表面，并切除軟骨膜，保留耳軟骨。創(chuàng)面壓迫止血后予以暴露，無需包扎。術(shù)后3天死亡2只，剩余16只，共形成高出正常皮膚的瘢痕塊93個(gè)。

隨即選擇每只兔的左右側(cè)耳進(jìn)行藥物對比觀察，分為空白對照組—低濃度積雪草甙組、空白對照組∣高濃度積雪草甙組、空白對照組∣得寶松組、低濃度積雪草甙組∣高濃度積雪草甙組、低濃度積雪草甙組∣得寶松組、高濃度積雪草甙組∣得寶松組；共得到空白對照組19個(gè)瘢痕塊、得寶松組22個(gè)、低濃度積雪草甙注射組24個(gè)（25mg/ml）、高濃度積雪草甙注射組28個(gè)（50mg/ml），各組分別于瘢痕制作后3天開始隔天局部注射得寶松和相應(yīng)濃度積雪草甙藥液0.5ml/個(gè)，各組局部藥物注射均持續(xù)至瘢痕制作術(shù)后10天。于瘢痕制作術(shù)后2周切取瘢痕組織標(biāo)本。

1.3 HE染色：于瘢痕制作2周后切取瘢痕組織，隨即固定于中性甲醛液，常規(guī)石蠟包埋，4μm切片，切片常規(guī)用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級乙醇至水洗，然后蘇木素染色5min、自來水沖洗，鹽酸鹽酸乙醇化30s，置伊紅液2min，再經(jīng)常規(guī)脫水、透明、封片，鏡檢。

1.4 總RNA的提?。簯?yīng)用TRIzol試劑盒，方法按說明書進(jìn)行。所提取的總RNA用紫外分光光度計(jì)定量，A260/A280值≥1.8的進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。

1.5 實(shí)時(shí)定量熒光PCR擴(kuò)增：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行；PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（20μl）含SYBRPremix ExTaqTM（10μl），PCRForwardPrimer(0.7μl)，PCRReversePrimer(0.7μl)，ROX Reference Dye II(0.4μl)，dH2O(5.1μl)，cDNA(2μl)。反應(yīng)條件：90℃10s, 94℃5s,60℃45s,共40個(gè)循環(huán)。 TGF-β1 mRNA 的定量：采用相對定量法。以GAPDH為參照，利用Ct值計(jì)算TGF-β1 mRNA 的相對量。TGF-β1 mRNA/GAPDH用下述公式計(jì)算：2-△ct。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理系統(tǒng)，組間差異采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 大體情況：空白對照組瘢痕塊顏色較紅，質(zhì)地較硬，瘢痕高出皮膚平面，增生范圍未超出原創(chuàng)緣；得寶松組和積雪草甙組瘢痕顏色淡，質(zhì)軟。如圖1。

2.2 病理結(jié)果：HE染色觀察可見，空白對照組毛細(xì)血管增生明顯，有大量成纖維細(xì)胞，核大、密集，排列不規(guī)則；積雪草甙組和得寶松組成纖維細(xì)胞數(shù)量較少，核較小，排列相對規(guī)則。如圖2。

2.3 熒光強(qiáng)度曲線：熒光PCR 儀在PCR 擴(kuò)增過程中,會(huì)自動(dòng)記錄每一循環(huán)的熒光強(qiáng)度,故稱實(shí)時(shí)熒光PCR ,在最佳實(shí)驗(yàn)條件、相同擴(kuò)增效率的前提下,反應(yīng)體系產(chǎn)生一定強(qiáng)度的熒光信號(hào)所需的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)與反應(yīng)體系中的原始模板數(shù)成反比。通過對熒光信號(hào)及擴(kuò)增進(jìn)程的實(shí)時(shí)監(jiān)測,以熒光強(qiáng)度與循環(huán)數(shù)建立坐標(biāo),陽性標(biāo)本呈現(xiàn)典型的S 形曲線,電泳圖見特異性條帶，而陰性對照呈一條不規(guī)則的波浪線。根據(jù)各組不同的Ct值算出相應(yīng)初始cDNA的相對量，應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析。

2.4核酸初始相對量：根據(jù)不同組、不同引物得出不同的熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)曲線中的Ct值由上述公式算出相應(yīng)初始cDNA的相對量（TGF-β1 mRNA / GAPDH mRNA），如表1。

2.5 PCR擴(kuò)增結(jié)果，見表2。

3討論

本實(shí)驗(yàn)采用兔耳瘢痕模型，是基于動(dòng)物自身對創(chuàng)傷的修復(fù)反應(yīng)與人類病理性瘢痕產(chǎn)生的過程頗為相似。優(yōu)點(diǎn)是運(yùn)用這一模型可以對瘢痕組織的產(chǎn)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸進(jìn)行動(dòng)態(tài)的連續(xù)性的觀察,可隨時(shí)留取瘢痕標(biāo)本,便于對病理性瘢痕組織進(jìn)行全面系統(tǒng)的研究。國內(nèi)李薈元[1]等從1998年開始研究兔耳增生性瘢痕模型的建立，成功從20只新西蘭大白兔兔耳腹側(cè)面制造增生明顯的瘢痕80余處；李希軍[2]、周勤生[3]等也先后成功復(fù)制本模型，成功率高、穩(wěn)定。我們在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭兄谱?09處創(chuàng)面，共形成高出正常皮膚表面得增生性瘢痕93個(gè)，成功率為85.32%，具備了統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的標(biāo)本數(shù)量。

本實(shí)驗(yàn)采用SYBR Green染料法，是熒光實(shí)時(shí)定量 PCR技術(shù)的一種，即是在 PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)實(shí)時(shí)檢測整個(gè) PCR過程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。它是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新的核酸定量技術(shù),其分辨率比傳統(tǒng) PCR高,定量更準(zhǔn)確,受循次數(shù)的影響小 ,由于其在擴(kuò)增的同時(shí)采集數(shù)據(jù) ,可避免普通PCR后處理對結(jié)果的影響。其優(yōu)點(diǎn)是：①無需設(shè)計(jì)、合成探針,實(shí)驗(yàn)成本低；②使用方便,與常規(guī) PCR的操作幾乎相同。由于 SYBR Green和雙鏈 DNA是非特異性結(jié)合,反應(yīng)過程中如產(chǎn)生非特異產(chǎn)物、引物二聚體將影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此,反應(yīng)時(shí)要設(shè)定熔解曲線分析。由圖3b可以看到，本實(shí)驗(yàn)中，溶解曲線均為單一峰，表明無非特異性擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的 DNA拷貝數(shù)最初呈指數(shù)方式增加,隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,最終經(jīng)線性期進(jìn)入平臺(tái)期。參數(shù) Ct值代表達(dá)到設(shè)定可測熒光閾值的循環(huán)數(shù)，與樣品中起始模板的拷貝數(shù)的對數(shù)成線性反比關(guān)系。由于Ct值是反映實(shí)際 PCR反應(yīng)過程中擴(kuò)增即將進(jìn)入指數(shù)期的參數(shù),該參數(shù)幾乎不受試劑消耗等因素的影響,因此利用 Ct值可精確判斷起始模板拷貝數(shù)。

TGF-β[4]有3種亞型，TGF-β1是首先被發(fā)現(xiàn)得有利于傷口愈合得因子，陳偉[5]等研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1的持續(xù)存在會(huì)不斷刺激成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)基質(zhì)產(chǎn)生，導(dǎo)致過度的ECM沉積的纖維反應(yīng)。Hu[6]等研究表明通過使用透明質(zhì)酸植入得方法降低TGF-β1含量，能夠減少瘢痕形成；Cheng CL[7]等在初步建立兔耳增生性瘢痕模型得基礎(chǔ)上，用組織原位雜交方法，對兔耳增生塊進(jìn)行了TGF-β1 mRNA檢測，結(jié)果各組增生塊組織TGF-β1 mRNA表達(dá)均較正常皮膚。另外，張選奮[8]等發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可以活化蛋白激酶C，在瘢痕形成過程中對于其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起一定的作用。這個(gè)指標(biāo)是檢測瘢痕形成或者預(yù)后的比較好的指標(biāo)之一，因此我們選用它作為測量指標(biāo)。

積雪草甙是中草藥積雪草的提取物，為三萜皂甙化合物。陳明春[9]等研究表明，中草藥積雪草能抑制T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放堿性成纖維細(xì)胞生長因子，具有抑制成纖維細(xì)胞（fibroblast,FB）的增值、促進(jìn)瘢痕FB凋亡、減少免疫細(xì)胞數(shù)目、封閉血管、疏松膠原纖維的作用。通過本實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，高、低濃度（分別為50mg/ml和25mg/ml）積雪草甙組TGF-β1 mRNA相對量與生理鹽水組相比較，差異均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），表明積雪草甙注射液對增生性瘢痕局部內(nèi)TGF-β1 mRNA有明顯得抑制作用。不同濃度的積雪草甙組間相比較（t檢驗(yàn)），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），提示高濃度組能更好地抑制TGF-β1 mRNA的表達(dá)；在高濃度積雪草甙組和得寶松組之間的比較中可以發(fā)現(xiàn)，二者無明顯差異（P>0.05），提示高濃度積雪草甙具有臨床推廣應(yīng)用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)局部應(yīng)用多種藥物對兔耳瘢痕進(jìn)行治療，得寶松對于兔耳瘢痕具有較明顯的療效，這與以往的報(bào)道基本相同。積雪草甙局部注射可以明顯抑制TGF-β1 mRNA的表達(dá)，并且在一定范圍內(nèi)療效與藥物濃度成正比。與口服積雪草甙片劑相比較，局部注射可以大大減少全身的副作用，而與積雪草甙霜?jiǎng)┫啾?，局部注射能更大地提高瘢痕局部的藥物濃度。與局部注射糖皮質(zhì)激素可引起色素脫失、骨質(zhì)疏松、月經(jīng)紊亂等相比較，中藥的副作用更小，尤其對于禁忌使用糖皮質(zhì)激素的患者。因此，積雪草甙瘢痕內(nèi)局部注射具備臨床推廣的價(jià)值。但由于中藥本身成分復(fù)雜，其具體作用機(jī)理往往是多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)地，亟需更深層次的研究為其臨床治療提供有力的依據(jù)。

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[收稿日期]2008-09-22[修回日期]2008-12-10

編輯/張惠娟