鄒明學 陳艷紅 徐勇 郭紹貴 張海英 宮國義

（1.南通大學，江蘇南通，226007；2.國家蔬菜工程技術(shù)研究中心）

西瓜EST-SSR分子標記的篩選

鄒明學1陳艷紅1徐勇2郭紹貴2張海英2宮國義2

（1.南通大學，江蘇南通，226007；2.國家蔬菜工程技術(shù)研究中心）

利用國際共享獲得的820條EST序列，自主設(shè)計出79對EST-SSR引物，其中有32對引物經(jīng)過PCR擴增出穩(wěn)定清晰的電泳條帶，可以作為西瓜和相關(guān)物種的新的EST-SSR分子標記。

西瓜 EST-SSR 分子標記

我國是西瓜生產(chǎn)和消費大國，西瓜播種面積占世界的60%，西瓜的栽培在我國的農(nóng)村經(jīng)濟發(fā)展中起著越來越重要的作用。近年來，以RFLP，RAPD，SSR，ARLP為代表的分子標記的發(fā)展為遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建開創(chuàng)了新局面。EST-SSRs分子標記的出現(xiàn)使無功能分子標記向可揭示基因轉(zhuǎn)錄功能的分子標記轉(zhuǎn)化[1]。作為功能基因的一部分序列，它比其他分子標記提供了更多的功能信息，從而使研究者對影響該性狀變異的生物學途徑和代謝機制有更了深層次的認識[2]。由此可見，EST方法的優(yōu)點就在于它能大大縮小基因的篩選范圍，提高分離基因的效率。目前GenBank上有數(shù)量龐大的EST序列數(shù)據(jù)，為EST-SSR標記的開發(fā)提供了一個巨大而有價值的來源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試西瓜EST-SSR標記篩選的親本材料為：父本為野生西瓜（（thunb.）Mansfeld）品種，由美國Clemson大學Rhodes B B教授贈送，代號為PI296341，目前它是國際上唯一一份高抗枯萎?。‵usarium wilt）3個生理小種的材料；母本為感枯萎病的普通西瓜（（Thunb.）Mansfeld var.）品種97103。

1.2 試驗方法

①基因組DNA的提取 參照Murry和Tompson（1980）的CTAB方法進行。

②EST-SSR序列的獲取 本項研究從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得820條西瓜EST序列。登陸網(wǎng)站http://www. gramene.org/gremene/searches/ssrtool，應用SSRIT（Simple Sequence Repeat Identification Tool）軟件在線搜索EST-SSR，搜索的標準為：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸重復序列的重復次數(shù)分別大于或等于10，7，5，4。

③EST-SSR引物的設(shè)計 應用引物設(shè)計軟件Premier 5.0設(shè)計引物。引物設(shè)計的原則為：EST序列長度大于100 bp；SSR序列的開始和結(jié)束位置分別距5＇和3＇端不少于20 bp；引物中（G+C）的比例為40%～60%，退火溫度（）為54～60℃，引物長度16～20 bp，預期擴增產(chǎn)物長度為80～400 bp。盡量避免引物二級結(jié)構(gòu)dimer，hairpin，false primer以及連續(xù)6個堿基配對的出現(xiàn)。

④SSR擴增與產(chǎn)物的檢測 SSR擴增體系：總反應體系為12.5 μL，其中dNTP（2.5 mmol/L）1.0 μL，引物（15 ng/μL）2.0 μL，模板DNA（30 ng/μL）2.0 μL，rTaqE （5 U/μL）0.2 μL，10 buffer（含 Mg2+）1.25 μL，ddH2O 6.05 μL。

SSR擴增程序：94℃預變性2 min；94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。

SSR擴增產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色后對結(jié)果進行記錄并分析。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)與國際合作單位共享獲取的820條EST序列，共設(shè)計了79對EST-SSR引物。用自主設(shè)計的EST-SSR引物對PI296341，97103和它們的F1代進行EST-SSR多態(tài)性引物篩選 （每3個泳道為一對引物，泳道順序從左自右分別是父本、母本、F1），結(jié)果如圖1所示。

圖1 EST-SSR引物篩選銀染照片（從左至右為WEP1～WEP28）

經(jīng)過PCR擴增、聚丙烯酰胺凝膠電泳和硝酸銀染色，共有32對引物顯示出穩(wěn)定清晰的電泳條帶，可以作為西瓜和相關(guān)物種的新的EST-SSR分子標記。

EST-SSR引物雖然是經(jīng)過嚴格標準設(shè)計合成的，但仍然有23對引物沒有擴增結(jié)果或者擴增主帶不明顯，原因可能一方面是引物的序列結(jié)合到2個外顯子上；另一方面可能是2個引物間有一個長的內(nèi)含子致使不能擴增出產(chǎn)物。還有一些擴增產(chǎn)物與預期產(chǎn)物長度不一致，可能一是所分析的材料中存在復等位基因，盡管編碼區(qū)相同但是DNA序列不一定相同，擴增出的產(chǎn)物與預期的產(chǎn)物大小不同；二是引物特異性不夠高，擴增出引物的同源序列。

EST-SSR引物由于國際合作原因目前暫不能公開。

3 小結(jié)與討論

EST-SSR標記是基于EST或cDNA數(shù)據(jù)開發(fā)的一種分子標記。作為一種新型分子標記，EST-SSR來自表達基因，因而除具備傳統(tǒng)基因組來源的SSR標記所有優(yōu)勢外，可能與基因功能表達具有直接或間接關(guān)系，從而強化了SSR標記在遺傳研究中的應用。Levi A等于2007-2008年利用西瓜EST-SSR標記進行了EST-SSR分子標記在葫蘆科種間轉(zhuǎn)移可能性方面和遺傳多樣性等方面的研究[3～4]，Verma M等2008年進行了西瓜EST-SSR標記尋找方面的研究[5]。本研究利用NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取西瓜的EST序列設(shè)計引物，利用抗枯萎病PI296341與感枯萎病的97103及它們雜交獲得的F1代進行EST-SSR標記的篩選，是國內(nèi)在西瓜研究中首次利用已經(jīng)有的EST序列進行EST-SSR標記的開發(fā)和應用方面的研究，以期為以后的西瓜及葫蘆科其他作物的EST-SSR標記的發(fā)展作出重要貢獻。

由于目前西瓜的EST序列還比較少，可以用來開發(fā)EST-SSR標記的也還較少，隨著西瓜及葫蘆科其他作物的EST序列的豐富，利用EST-SSR標記的通用性借鑒葫蘆科其他作物的EST-SSR引物對，會有更多的西瓜EST-SSR標記得到開發(fā)和利用，同時利用SSR標記的通用性，也可以將西瓜的SSR標記和EST-SSR標記應用到葫蘆科其他物種上。

[1]Stack S，Campbell L，Henderson K，et al.Development of EST-derived microsatellitemarkersformapping and germplasm analysis in wheat[C].San Diego，California，USA：Plant&Animal GenomeⅧ Conference，January，2000：9-12.

[2]朱振東，賈繼增.小麥SSR標記的發(fā)展及應用[J].遺傳，2003，25（3）：355-360.

[3]Levi A,Patrick W,Davis A,et al.Interspecific transferability of watermelon EST-SSR markers in cucurbit species[J]. Hortscience,2007,42(4):1012.

[4]Levi A,Ling K,Davis A R.Est-ssrs of watermelon(citrullus sp.)useful in assessing genetic diversity among lagenaria siceraria accessions[J].Plant and Animal Genome Conference Proceedings,2008(1):643.

[5]Verma M,Arval L.Development of EST-SSRs in watermel-and their transferability tospp.[J].Journal of horticul science&biotechnology,2008,83(6):732-736.

Selection of Watermelon EST-SSR Molecular Marker

ZOU Mingxue1,CHEN Yanhong1,XU Yong2,GUO Shaogui2,ZHANG Haiying2,GONG Guoyi2

From 820 ESTs of watermelon,we have identified 87 ESTs containing perfect simple sequence repeats(SSR)of di-,tri-,tetra-or pentanucleotides.79 EST-SSR primer pairs were designed for watermelon based on the searching results.Through PCR amplifications and silver detection,32 primer pairs had successful and distinctive bands in different cultivars of watermelon.These EST-SSR markers can be taken as a new molecular marker of watermelon and related species.

Watermelon;EST-SSR;Molecular marker

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.18.004

鄒明學（1973-），男，碩士，助教，研究方向為分子遺傳學，電話:0513-85015438，13912299027。E-mail:greatdream001@126.com

2009-07-01