邊素艷 蓋魯粵 葉 平 楊月峰 王榮亮 王 華 郭子寬 王立生

螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及鑒定

邊素艷 蓋魯粵 葉 平 楊月峰 王榮亮 王 華 郭子寬 王立生

目的構(gòu)建含螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，為進(jìn)一步研究生物發(fā)光活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像奠定基礎(chǔ)。方法利用重組DNA技術(shù)，將熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-Basic雙酶切得到的目的基因fluc+亞克隆至逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN中，重組質(zhì)粒pL(fluc)SN在脂質(zhì)體介導(dǎo)下“乒乓”轉(zhuǎn)染GP+E86和PA317包裝細(xì)胞，G418篩選，直至出現(xiàn)抗性克隆。擴(kuò)大培養(yǎng)，測(cè)定病毒滴度，并檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果經(jīng)限制性酶切分析鑒定，載體插入基因大小、位置均正確，并用GP+E86和PA317細(xì)胞進(jìn)行包裝、病毒滴度測(cè)定、篩選，建立具有較高滴度的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒fluc細(xì)胞系，該細(xì)胞可高效表達(dá)熒光素酶。結(jié)論成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pL(fluc)SN，為標(biāo)識(shí)干細(xì)胞進(jìn)行基礎(chǔ)研究提供了一種檢測(cè)方法和平臺(tái)。

熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-Basic重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN構(gòu)建

生物發(fā)光活體成像技術(shù)是應(yīng)用熒光素酶（Luciferase）基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA，利用一套非常靈敏的光學(xué)檢測(cè)儀器，可監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)和基因行為的技術(shù)[1]。用生物發(fā)光活體成像技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)同一組實(shí)驗(yàn)對(duì)象在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行記錄，跟蹤同一觀察目標(biāo)（標(biāo)記細(xì)胞及基因）的移動(dòng)及變化，所得的數(shù)據(jù)更加真實(shí)可信，且不涉及放射性物質(zhì)和方法。該方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果直觀、靈敏度高，為多種腫瘤細(xì)胞和病原體的體內(nèi)示蹤、免疫細(xì)胞和干細(xì)胞移植后生物學(xué)行為、細(xì)胞凋亡等研究開辟了新的方法和研究平臺(tái)[2-4]。本研究旨在構(gòu)建螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，篩選穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶報(bào)告基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞，為進(jìn)一步用生物發(fā)光活體成像方法，研究經(jīng)體外修飾細(xì)胞的體內(nèi)示蹤奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

E.coli DH5α、離心柱型普通質(zhì)粒小提試劑盒、超薄離心柱型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自天根生物化學(xué)試劑公司。SmaⅠ、Bam HⅠ、HpaⅠ等限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購(gòu)自Takara公司。pLXSN逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體（圖1A）、熒光素酶報(bào)告基因載體－pGL3－Basic（圖1B）、逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞PA317、GP+E86細(xì)胞由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofect amine 2000購(gòu)自Invitrogen公司。G418購(gòu)自Gibco公司。Bright－GloTMLuciferase AssaySystem購(gòu)自Promega公司。DMEM購(gòu)自Hyclone公司。小牛血清購(gòu)自元享生物研究所。

圖1 質(zhì)粒圖譜（引自Clontech公司）

1.2 方法

1.2.1 pL(fluc)SN構(gòu)建及酶切鑒定

首先制備線性化粘平末端的pLXSN載體。用Bam HⅠ和HpaⅠ雙酶切載體pLXSN，37℃、2 h后以0.8%瓊脂糖凝膠電泳，并用離心柱型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收載體片段。再制備線性化粘平末端的fluc基因片段。用Bam HⅠ、SmaⅠ雙酶切pGL3－Basic，37℃2 h后以0.8%瓊脂糖凝膠電泳回收大小約1 976 bp的基因片段fluc。用T4 DNA ligase將上述fluc基因片段與線性化粘平末端的pLXSN載體片段以3∶1的比例于37℃下連接反應(yīng)3 h。最后制備DH 5α感受態(tài)宿主菌，冰浴條件下加入上述連接產(chǎn)物，冰浴30 min，42℃休克90 s后，迅速冰浴2 min，加LB培養(yǎng)液500 μL，37℃保溫1 h，涂于氨芐青霉素抗性的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。隨機(jī)挑取上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的單個(gè)菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)，用離心柱型普通質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒DNA，分別用HINDⅢ、XbaⅠ單酶切載體pL(fluc)SN，酶切產(chǎn)物于0.8%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外透射儀觀察結(jié)果。將酶切鑒定正確的質(zhì)粒命名為pL(fluc)SN。

1.2.2 重組pL(fluc)SN載體的包裝

活化鑒定正確的重組pL(fluc)SN宿主菌單個(gè)菌落，接種于50 mL LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜，用上述質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，溶于無菌Nuclease－Free水200 μL中。加1/10倍體積的3 mol/L乙酸鈉，2.5倍體積的無水乙醇，混勻后置于－20℃（＞30 min）后14 000 g離心，棄上清，70%乙醇于超凈臺(tái)內(nèi)沖洗晾干，溶于無菌Nuclease－Free水50 μL中備轉(zhuǎn)染用。

選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的逆轉(zhuǎn)錄病毒的單噬性包裝細(xì)胞GP+E86，用胰蛋白酶消化后按1×105的細(xì)胞數(shù)接種于6孔板中，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)60%～70%融合時(shí)可供DNA轉(zhuǎn)染用。將4 μg DNA溶于250 μL無血清培養(yǎng)基中，將10 μL lipofectamine 2000溶于250 μL無血清培養(yǎng)基中，將上述兩溶液輕輕混勻，置室溫20 min；棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次；將lipofectamine 2000－DNA混合物小心滴加到包裝細(xì)胞上，輕輕混勻，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h后棄培養(yǎng)上清，換新鮮含10%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h收獲瞬時(shí)病毒上清，連續(xù)3次，于－70℃儲(chǔ)存用于感染雙噬性逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞PA317。

選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好PA317細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后以1×105細(xì)胞數(shù)接種于6孔板中，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至60%～70%融合時(shí)用于感染。棄舊培養(yǎng)基，加入24 h收獲的Luc單噬性逆轉(zhuǎn)錄病毒上清2 mL，并同時(shí)加入polybrene 8 μg/mL，2 h后更換新鮮含10%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。將收獲的病毒上清每12 h再感染包裝細(xì)胞1次，連續(xù)3次，再培養(yǎng)24 h，細(xì)胞按1∶10～1∶30的比例傳代，并用800 μg/mL G418篩選至抗性細(xì)胞集落形成，挑選細(xì)胞集落擴(kuò)大培養(yǎng)，以制備含病毒的包裝細(xì)胞上清并測(cè)定病毒滴度。轉(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞命名為PA317/fluc?？瞻踪|(zhì)粒pLXSN包裝方法同上，轉(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞命名為PA317/0。收集PA317/fluc細(xì)胞培養(yǎng)上清液，4 000 r/min離心10 min，-70℃保存?zhèn)溆谩?.2.3重組逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度測(cè)定

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的NIH 3T3細(xì)胞用胰蛋白酶消化，按1∶3傳代于6孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，當(dāng)細(xì)胞達(dá)60%～80%融合時(shí)用于病毒滴度測(cè)定。將制備的病毒液作10-2、10-3、10-4倍比稀釋。吸去6孔板中NIH 3T3細(xì)胞的培養(yǎng)液，分別吸取1 mL稀釋的病毒液加在NIH 3T3細(xì)胞上，并加入polybrene至終濃度8 μg/mL，每個(gè)稀釋倍數(shù)設(shè)2個(gè)平行孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，再補(bǔ)加培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，傳代NIH 3T3細(xì)胞，用含800 μg/mL G418的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)21 d，計(jì)細(xì)胞數(shù)大于50的抗性集落數(shù)，計(jì)算平均值。病毒滴度的單位為克隆形成單位（Clone forming units，CFU）/毫升（mL）?？召|(zhì)粒pLXSN的包裝及病毒滴度測(cè)定完全同上。

病毒滴度=抗性細(xì)胞克隆數(shù)×病毒稀釋倍數(shù)÷病毒上清體積

1.2.4 PA317/fluc熒光素酶活性檢測(cè)

用Bright-GloTMLuciferase Assay System檢測(cè)熒光素酶活性。提前將5×102～1×106不同數(shù)量級(jí)個(gè)PA317/fluc細(xì)胞接種于24孔板，待貼壁完全后吸凈細(xì)胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗2次，每孔加入細(xì)胞裂解液及無血清的DMEM等比混合液100 μL，晃動(dòng)數(shù)次以保證完全覆蓋細(xì)胞。吸取細(xì)胞裂解液加入到小燒杯中，20 min內(nèi)用BPCL型微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x檢測(cè)20 s內(nèi)的發(fā)光值，并用BPCL分析軟件計(jì)算均值，活性用相對(duì)光度單位（RLU）/轉(zhuǎn)染效率表示。

2 結(jié)果

2.1 含目的基因的重組質(zhì)粒連接產(chǎn)物及酶切鑒定

線性化粘平末端的pLXSN載體與fluc基因片段用T4 DNA ligase連接、轉(zhuǎn)化DH 5α感受態(tài)宿主菌，經(jīng)HINDⅢ單酶切和XbaⅠ單酶切后各得到兩個(gè)片段，與預(yù)期大小相近，故而證明重組表達(dá)載體構(gòu)建成功（圖2）。

2.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系的建立及病毒滴度測(cè)定

重組pL（fluc）SN載體DNA 4μg經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染GP+E86后收集病毒上清“乒乓”感染PA317包裝細(xì)胞（圖3A），800 mg/L G418篩選，14 d后挑選抗性細(xì)胞集落(圖3B)，繼續(xù)用含800 mg/L G418的完全DMEM培養(yǎng)液中擴(kuò)大培養(yǎng)，生長(zhǎng)至2周左右收集病毒上清用以測(cè)病毒滴度。以NIH 3T3為靶細(xì)胞測(cè)定病毒滴度，21 d后鏡下可見抗性細(xì)胞集落形成，結(jié)晶紫染色并計(jì)數(shù)。測(cè)滴度為2×105pfu/cell。

2.3 PA317/fluc熒光素酶活性檢測(cè)

PA317/fluc熒光素酶活性檢測(cè)示，G418抗性包裝細(xì)胞表達(dá)熒光素酶，且酶活性隨細(xì)胞數(shù)目的增多而增加，兩者呈相關(guān)關(guān)系，最小檢測(cè)細(xì)胞數(shù)為500個(gè)（圖4）。

圖3 逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞

圖4 PA317/fluc熒光素酶活性與細(xì)胞數(shù)的關(guān)系

3 討論

生物發(fā)光活體成像技術(shù)的原理是將fluc基因整合到細(xì)胞染色體DNA上以表達(dá)熒光素酶，當(dāng)外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素（Luciferin），即可在數(shù)分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP及氧氣存在的條件下，催化熒光素的氧化反應(yīng)才可以發(fā)光，故僅在活細(xì)胞內(nèi)才會(huì)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且光的強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目線性相關(guān)，因而可用于細(xì)胞及基因的活體內(nèi)示蹤。本研究成功構(gòu)建了逆轉(zhuǎn)錄病毒-熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體，并檢測(cè)了包裝細(xì)胞熒光素酶表達(dá)活性，證實(shí)我們構(gòu)建的載體攜帶有fluc目的基因，為進(jìn)一步用此報(bào)告基因標(biāo)志干細(xì)胞、研究干細(xì)胞移植后的體內(nèi)生物學(xué)行為奠定了基礎(chǔ)。

目前，臨床約85%的基因治療項(xiàng)目采用病毒載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體具有將外源基因穩(wěn)定整合進(jìn)入靶細(xì)胞的基因組中且感染效率高的優(yōu)點(diǎn)，故能夠?qū)崿F(xiàn)目的基因的長(zhǎng)期、穩(wěn)定、高效表達(dá)。此外，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體還有宿主細(xì)胞范圍廣、制備方便等優(yōu)點(diǎn)，最適于體外間接基因治療。在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN，可以高效率地感染嚙齒類和靈長(zhǎng)類細(xì)胞。該載體含有從鼠源病毒（MoMuLV和MoMuSV）的長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）。一旦轉(zhuǎn)染入包裝細(xì)胞系，pLXSN能夠整合到細(xì)胞基因組中，并穩(wěn)定表達(dá)一個(gè)病毒包裝信號(hào)(Ψ),一個(gè)用于在真核細(xì)胞中G418抗生素篩選的新霉素抗性基因（Neo）和直接位于病毒的即早啟動(dòng)子（PCMV）下游的靶基因序列。以載體為模版的轉(zhuǎn)錄體可被在包裝細(xì)胞中表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒外殼蛋白包裝，從而形成有感染力卻復(fù)制缺陷型的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒[5-6]。

逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染所面臨的最大難題在于病毒滴度較低，影響了外源基因的轉(zhuǎn)染效率。我們將構(gòu)建的pL(fluc)SN導(dǎo)入GP+E86單嗜性細(xì)胞并獲得瞬間表達(dá)，繼而再感染PA317雙嗜性細(xì)胞，即所謂“乒乓效應(yīng)”(Ping-pong mechanism)，獲得高滴度重組病毒，為提高逆轉(zhuǎn)錄病毒fluc基因感染效率奠定了基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)中，我們將fluc基因亞克隆至逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLXSN，成功構(gòu)建了pL(fluc)SN載體，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法“乒乓”轉(zhuǎn)染GP+E86和PA317包裝細(xì)胞，G418篩選，直至出現(xiàn)抗性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，測(cè)定病毒滴度，并檢測(cè)熒光素酶活性，為進(jìn)一步研究活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1]張怡,韓彧,趙春林.活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像技術(shù)的研究進(jìn)展[J].生命科學(xué),2006(18):25-30.

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Construction of Recombinant Retroviral Vector Containing Firefly Luciferase Reporter Gene

BIAN Suyan1,GAI Luyue1,YE Ping1,YANG Yuefeng2,WANG Rongliang2,WANG Hua2,GUO Zikuan2,Wang Lisheng2.
1 Second Department of Cardiology,Southern building,General Hospital of PLA,Beijing 100853,China.2 Department of Experimental hematology,Institute of Radiation Medicine,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China.Corresponding author:GAI Luyue.

ObjectiveTo construct recombinant retroviral vector carrying firefly luciferase reporter gene(fluc)for further study of bioluminescence imaging in vivo.MethodsTarget gene-fluc was obtained by cutting firefly luciferase reporter gene(fluc)vector pGL3-Basic using restriction enzyme digestion.Then fluc gene was sub-cloned into retroviral vector pLXSN.GP+E86 and PA317 pakage cells were infected by the obtained recombinant retroviral vector pL(fluc)SN with ping-pong infection assay and screened with G418 resistance.The stable expression of the fluc gene in positive clones was identified by detecting luciferase enzyme activity.ResultsEnzyme digestion indicated that the retroviral vector pL(fluc)SN was successfully constructed.The fluc gene was integrated into the PA317 and GP+E86 genome and expressed stably in the host cells.ConclusionThe target retroviral vector pL(fluc)SN was constructed successfully.It provides an effective tool or platform for basic research of tracing grafted cells.

Firefly luciferase reporter gene(fluc)vector,pGL3-Basic;Recombinant retroviral vector,pLXSN; Construction

Q784

A

1673－0364（2009）－02－0075－04

2009年1月16日；

2009年2月23日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.04.004

自然科學(xué)基金青年基金面上項(xiàng)目（30400182）；國(guó)家高技術(shù)發(fā)展計(jì)劃（863）項(xiàng)目（2007AA02Z454）。

100853北京市解放軍總醫(yī)院心血管二科（邊素艷，蓋魯粵，葉平）；100850北京市軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)血液學(xué)研究室（楊月峰，王榮亮，王華，郭子寬，王立生）。

蓋魯粵。