樓 曉 宮恩年 商豐元 魏成剛 施志超 汪勁松 吳祖澤 郭子寬

肝細(xì)胞生長因子基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞治療股骨頭壞死的探索性研究

樓 曉 宮恩年 商豐元 魏成剛 施志超 汪勁松 吳祖澤 郭子寬

目的探討肝細(xì)胞生長因子基因修飾自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療股骨頭壞死的可行性，并評價其療效。方法對1例ARCOⅢB股骨頭壞死患者，手術(shù)過程中局部注射肝細(xì)胞生長因子基因修飾的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞1×107個，隨訪觀察評價其臨床療效和影像學(xué)改變。結(jié)果治療過程順利，術(shù)后無感染及過敏等嚴(yán)重并發(fā)癥發(fā)生。術(shù)后隨訪9個月，患者髖關(guān)節(jié)疼痛指數(shù)較治療前明顯降低，髖關(guān)節(jié)臨床癥狀Harris評分分值由治療前的63分提高到治療后的76分，髖關(guān)節(jié)活動度Harris評分由治療前分值2.5分提高至4.2分。CT掃描顯示損傷局部出現(xiàn)重建性骨修復(fù)，低密度區(qū)范圍縮小，密度增高。ARCO分期由ⅢB改善至ⅢA。結(jié)論肝細(xì)胞生長因子基因修飾的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療股骨頭壞死，安全有效，本次探索為進(jìn)一步臨床研究奠定了基礎(chǔ)。

股骨頭壞死間充質(zhì)干細(xì)胞肝細(xì)胞生長因子

股骨頭壞死（Osteonecrosis of the femoral head， ONFH）是臨床常見病，多發(fā)于青壯年，嚴(yán)重影響勞動能力和生活自理能力。多數(shù)患者不得不行人工關(guān)節(jié)置換，而中青年患者的關(guān)節(jié)置換手術(shù)后，仍需再次更換，且長期療效難以預(yù)測[1]。因此，現(xiàn)在多主張早期保守治療，阻止病情進(jìn)展，以避免或延緩人工關(guān)節(jié)置換[2]。

股骨頭壞死基本病理變化包括兩個方面：①由于外傷、藥物和其他因素引起的微循環(huán)障礙，導(dǎo)致股骨頭血液供應(yīng)不足；②血供障礙引起骨組織損傷壞死，繼發(fā)骨性關(guān)節(jié)炎，關(guān)節(jié)功能喪失。因此，ONFH恰當(dāng)?shù)闹委煷胧┍仨殞⒋俪晒呛痛傺苄律袡C(jī)地結(jié)合起來[3]。本研究將利用重組肝細(xì)胞生長因子（Hepatocyte growth factor，HGF）腺病毒感染自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells,MSCs），將HGF的促血管新生功能和MSCs的成骨功能結(jié)合起來，通過細(xì)胞治療的手段，進(jìn)行骨損傷修復(fù)，為治療ONFH提出一個新的思路。

1 材料與方法

1.1 病例資料

患者，女，48歲，術(shù)前髖關(guān)節(jié)酸痛，活動受限，跛行，病程5年。CT掃描示股骨頭骨質(zhì)疏松，骨硬化及囊性變，關(guān)節(jié)囊腫脹、積液。曾有激素藥物治療史。根據(jù)世界骨循環(huán)研究學(xué)會（ARCO）的國際骨壞死分期標(biāo)準(zhǔn)[4]，診斷為右側(cè)股骨頭壞死ⅢB。患者同意接受肝細(xì)胞生長因子基因修飾的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療，并簽署知情同意書。

1.2 自體骨髓MSCs的分離培養(yǎng)和MSCs－HGF的制備

利多卡因局麻下自髂后上棘處行骨髓穿刺，以預(yù)含2 mL肝素鈉（100 U/mL）的10 mL注射器抽取骨髓10 mL，于GMP級細(xì)胞實驗室中的超凈工作臺內(nèi)稀釋骨髓液，加于淋巴細(xì)胞分離液，行密度梯度離心，獲得骨髓單個核細(xì)胞，以2×105cells/cm2的密度接種于含2.5%血小板裂解物（Platelet lysates，PL）的α－MEM培養(yǎng)基的塑料平底培養(yǎng)瓶中。37℃、5%CO2、飽和濕度的孵箱中靜置培養(yǎng)48 h后，去除非貼壁細(xì)胞。細(xì)胞生長至80%融合時，以0.05%的胰蛋白酶進(jìn)行消化、傳代和擴(kuò)增。達(dá)到所需細(xì)胞數(shù)目時，在無血清培養(yǎng)體系中按MOI=150∶1加入Ad－HGF腺病毒載體，48 h后收獲細(xì)胞，稱為MSCs－HGF，計數(shù)1.0×107個后立即用于植入治療。

1.3 植入方法

在持續(xù)硬脊膜外麻醉下，患者接受明膠海綿填塞術(shù)，術(shù)中局部注射MSCs－HGF細(xì)胞懸液2 mL，常規(guī)縫合。

1.4 術(shù)后處理

術(shù)后去枕平臥6 h，監(jiān)測體溫、脈搏、呼吸及血壓等變化，注意觀察切口，必要時更換敷料。術(shù)后3個月內(nèi)不能負(fù)重，3個月后扶拐負(fù)重，期間進(jìn)行常規(guī)的肌肉功能鍛煉，定期復(fù)查髖部X線片、MRI和CT掃描。

1.5 隨訪與評價

術(shù)后隨訪患者，根據(jù)WOMAC評價標(biāo)準(zhǔn)[5]，對髖關(guān)節(jié)疼痛進(jìn)行評價，疼痛程度則以目視類比式測量器（VAS）進(jìn)行測量（0～100分）。

隨訪時復(fù)查髖部X線片和CT掃描，并與術(shù)前資料對比，給予髖關(guān)節(jié)功能Harris評分（HHS），進(jìn)行療效評價[6－7]，HHS＞90分為優(yōu)，75～90分為良，60～74.9分為可，＜60分評定為差。同時計算髖關(guān)節(jié)活動度HHS分值，評價項目包括關(guān)節(jié)屈、伸、展、收、旋轉(zhuǎn)度，并根據(jù)影像學(xué)改變再次進(jìn)行ARCO分期。

2 結(jié)果

患者手術(shù)順利，術(shù)后無感染、過敏、血管神經(jīng)損傷等并發(fā)癥發(fā)生，切口愈合好，髖部疼痛減輕。用CPM關(guān)節(jié)被動練習(xí)一周后，扶拐下床活動。

對患者進(jìn)行了術(shù)后3個月和9個月的兩次隨訪，復(fù)查髖部X線片和CT掃描，術(shù)前股骨頭局部塌陷，關(guān)節(jié)面部分消失，股骨頭內(nèi)見囊性變及硬化邊。術(shù)后CT掃描顯示出現(xiàn)重建性骨修復(fù)，低密度區(qū)范圍縮小，密度增高，骨小梁和新骨生成，股骨頭局部塌陷重新隆起，消失的關(guān)節(jié)面大部分恢復(fù)（圖1）。術(shù)后9個月，ARCO國際骨壞死分期為ⅢA。

圖1 治療前后的患髖X線片和CT掃描評價

髖關(guān)節(jié)疼痛指數(shù)變化：患者術(shù)前疼痛指數(shù)是56，術(shù)后3個月和9個月時疼痛指數(shù)分別是48、42，疼痛指數(shù)明顯降低（圖2）。

圖2 治療前后的疼痛指數(shù)評價

患側(cè)髖關(guān)節(jié)進(jìn)行Harris評分：髖關(guān)節(jié)臨床癥狀HHS分值由治療前的63分顯著提高到治療后的76分，髖關(guān)節(jié)活動度HHS分值由治療前的2.5分提高至治療后的4.2分（圖3）。

圖3 治療前后的Harris評分

3 討論

股骨頭壞死是由于多種病因破壞股骨頭的血供，使骨的活性成分（包括骨細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和脂肪細(xì)胞）死亡所引起的一個病理過程，隨后機(jī)體對壞死區(qū)進(jìn)行自然修復(fù)，壞死骨小梁被逐步吸收，股骨頭力學(xué)強(qiáng)度下降，塌陷變形，從而導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎和髖關(guān)節(jié)功能的嚴(yán)重?fù)p傷[8]。其病因大致分為創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性兩大類。目前對于股骨頭壞死的治療主要有非手術(shù)保守治療、姑息性手術(shù)治療和人工關(guān)節(jié)置換。人工關(guān)節(jié)置換術(shù)主要用于晚期繼發(fā)髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的患者且受病變程度、年齡和人工關(guān)節(jié)使用壽命等因素的制約，因而并非是首選方法[9]。ONFN的理想治療應(yīng)在早期阻止骨質(zhì)繼續(xù)壞死，促進(jìn)骨再生，改善股骨頭內(nèi)血液循環(huán)，防止塌陷，改善臨床癥狀，延緩進(jìn)行人工髖關(guān)節(jié)置換的時間。然而，早期治療方法雖多，但尚無一種方法能取得滿意的效果[10]。近年來，隨著生物治療理論和骨組織工程學(xué)的不斷發(fā)展，一些新型臨床技術(shù)逐漸得到應(yīng)用并取得較好的效果。

近期研究已發(fā)現(xiàn)，股骨頭壞死與局部MSCs增殖能力下降或活力不足相關(guān)[11]。干細(xì)胞研究是生命科學(xué)的熱點(diǎn)，也越來越顯示出對臨床醫(yī)學(xué)進(jìn)步的革命性推動作用。間充質(zhì)干細(xì)胞是目前應(yīng)用廣泛的一類成體干細(xì)胞，可向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞分化，是骨組織工程研究的最佳種子細(xì)胞[12-14]。由于其分離培養(yǎng)簡便，低免疫原性，分泌多種成骨活性因子，能在骨損傷壞死局部促進(jìn)爬行替代和新骨形成，間充質(zhì)干細(xì)胞已被美國FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于多項骨損傷修復(fù)的臨床試驗中[15]。

髓芯減壓可以暫時降低骨內(nèi)壓，延緩早期骨壞死的自然過程，但并沒有徹底解決股骨頭的修復(fù)問題。骨內(nèi)壓升高的惡性循環(huán)會不斷降低股骨頭生物強(qiáng)度，最終導(dǎo)致股骨頭塌陷[16]。在本病例中，治療后9個月，CT掃描顯示出現(xiàn)重建性骨修復(fù)、低密度區(qū)范圍縮小、密度增高、骨小梁和新骨生成、股骨頭局部塌陷重新隆起、消失的關(guān)節(jié)面大部分恢復(fù)，HHS分值提高，ARCO分期由ⅢB改善至ⅢA，這證實了MSCs-HGF的體內(nèi)骨修復(fù)能力。

目前有關(guān)干細(xì)胞治療股骨頭壞死的報道絕大多數(shù)為直接局部注射骨髓單個核細(xì)胞，罕見運(yùn)用分離培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行治療[3]。事實上，骨髓中間充質(zhì)干細(xì)胞含量很低，約為105～106分之一，因此必須經(jīng)過體外擴(kuò)增才能達(dá)到治療劑量，發(fā)揮相應(yīng)生物效應(yīng)。我們的動物研究已表明，MSCs可以促進(jìn)骨缺損部位的骨形成[17]。

壞死部位普遍存在缺血、缺氧、缺乏營養(yǎng)的不利環(huán)境，不利的局部環(huán)境勢必影響植入細(xì)胞的生存、再生、分化和修復(fù)，難以取得預(yù)期效果。因此，針對股骨頭壞死的生物治療，除糾正成骨缺陷，還應(yīng)包含促進(jìn)血管新生、改善局部血供的策略。肝細(xì)胞生長因子是一種可引起多種細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，與其受體c-MET結(jié)合后，能激活MAPK、PI3K、鞘氨醇激酶等多種細(xì)胞內(nèi)信號途徑，發(fā)揮促細(xì)胞增殖、促細(xì)胞遷移、抑制細(xì)胞凋亡、促血管新生、抗纖維化和修復(fù)組織損傷等生物學(xué)作用[18]。我們之前的研究證實，MSCs-HGF擁有比MSCs更好的抗低氧損傷能力[17]。本研究利用我室研制的Ad-HGF腺病毒載體，轉(zhuǎn)導(dǎo)MSCs，從而將HGF的促血管新生、促細(xì)胞增殖作用與MSCs的條件成骨能力有機(jī)結(jié)合，發(fā)揮有效的骨修復(fù)效應(yīng)。這是國內(nèi)首次MSCs-HGF治療股骨頭壞死的臨床應(yīng)用，并取得令人欣喜的療效，必將進(jìn)一步推動股骨頭壞死生物治療的研究與實踐。誠然，相關(guān)的臨床治療方案仍需進(jìn)一步探討和規(guī)范，以期擴(kuò)大病例數(shù)，使之成為一種常規(guī)的臨床新技術(shù)。

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Exploratory Research for Hepatocyte Growth Factor Gene-Modified Mesenchymal Stem Cells on Femoral Head Osteonecrosis

LOU Xiao1,GONG Ennian2,SHANG Fengyuan2,WEI Chenggang2,SHI Zhichao2,WANG Jinsong1,WU Zuze1,GUO Zikuan1.
1 Institute of Radiation and Irradiation Medicine,Academy of Military Medical Science,Beijing 100850,China;2 66400 Orthopaedic Hospital of PLA,Beijing 100143,China.Corresponding author:GUO Zikuan.

ObjectiveTo explore the clinical feasibility and therapeutic effect of mesenchymal stem cells modified by hepatocyte growth factor gene for treating femoral head osteonecrosis.MethodsAutologous bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs)from one patient with osteonecrosis of the femoral head in a stage of ARCOⅢB were separated and expanded in vivo.Cells were modified by an adenoviral vector carrying human hepatocyte growth factor gene,and total cells of 1.0×107were surgically implanted into the necrotic sites of the affected femoral head.During the nine-month follow-up,the clinical symptoms and imaging change were evaluated.ResultsNo any severe complications that without obvious infection and allergy were observed.After nine months,there was a significant reduction in hip joint pain measured with the WOMAC index.The Harris scores of hip joint were obviously improved,which indicated respectively for clinical symptoms(63 versus 76)and for joint range of motion(2.5 versus 4.2).Computer Tomography displayed reconstructive repair manifestation,which exhibited as decreased low-intensity region accompanied with new bone formation.The classification of disease severity was improved from stage-ⅢB to stage-ⅢA,according to the system of the Association Research Circulation Osseous.Conclusion Implantation of autologous MSCs modified by hepatocyte growth factor gene was one of safe and effective treatment for osteonecrosis of the femoral head.Our results here might provide supportive data for further large scale clinical trials.

Femoral head necrosis;Mesenchymal stem cells;Hepatocyte growth factor

R683.42

A

1673－0364（2009）－02－0083－04

2008年12月22日；

2009年1月25日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.04.006

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863項目）（2007AA02Z454）。

100850北京市軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所（樓曉，汪勁松，吳祖澤，郭子寬）；100143北京市北京66400部隊骨病醫(yī)院（宮恩年，商豐元，魏成剛，施志超）。

郭子寬。