魯振強(qiáng)，潘彥遙，陳連江，朱延明，李春宇

(1.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150080；2.黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030）

甜菜BvCK2基因全長(zhǎng)cDNA的克隆和序列分析

魯振強(qiáng)1，潘彥遙1，陳連江2，朱延明3，李春宇1

(1.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150080；2.黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030）

甜菜M14品系在細(xì)胞胚胎學(xué)和遺傳學(xué)特征上具有鮮明的無融合生殖現(xiàn)象。為了尋找在這一特殊的生殖過程中的相關(guān)基因及其調(diào)控作用，實(shí)驗(yàn)通過同源克隆及cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）的方法，首次從甜菜M14品系中克隆了與生殖相關(guān)的基因BvCK2(Beta vulgaris casein kinase 2)的全長(zhǎng)cDNA序列，長(zhǎng)度為1 501 bp,開放閱讀框?yàn)? 002 bp,編碼333個(gè)氨基酸。根據(jù)氨基酸序列計(jì)算蛋白分子量為39.28kDa，pI=8.16。同源比對(duì)表明，BvCK2與煙草CK2（GenBank No.AJ437635）的相似度為64.22%，與百合CK2（GenBank No.AF517838）的相似度為65.18%。通過細(xì)胞內(nèi)定位分析，BvCK2所編碼的蛋白主要存在于細(xì)胞核中。

甜菜；BvCK2；RACE；基因克??；序列分析

蛋白激酶，也稱酪蛋白激酶-2(casein kinase2，CK2)，它是一種高度保守的真核細(xì)胞中普遍存在的信使非依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它在細(xì)胞生存、生長(zhǎng)、增殖[1]、細(xì)胞周期運(yùn)行[2，3]、信號(hào)傳導(dǎo)[4]或轉(zhuǎn)錄調(diào)控[5]及凋亡過程中具有重要的功能，同時(shí)還參與癌癥發(fā)生、病毒源性腫瘤發(fā)生以及抗凋亡等病理過程。CK2被認(rèn)為具有重要的生命功能，在細(xì)胞功能調(diào)控中處于重要地位。它是由兩個(gè)催化亞基(α和α′)和兩個(gè)調(diào)節(jié)亞基(β和β′)構(gòu)成的不均一四聚體[6]。其底物既可以是酶也可以是轉(zhuǎn)錄因子，因而它可以通過修飾轉(zhuǎn)錄因子激活或抑制基因的表達(dá)，使得細(xì)胞對(duì)外來信號(hào)做出反應(yīng)。這些底物在細(xì)胞功能的許多方面起重要作用，而且有些還是細(xì)胞復(fù)雜的信號(hào)加工系統(tǒng)的重要組成部分[7，8]。

黑龍江大學(xué)郭德棟教授等從1988年開始，通過栽培甜菜(Beta vulgaris）和具有無融合生殖特性的野生種白花甜菜(Beta corolliflora Zoss）進(jìn)行種間雜交，最終獲得并鑒定了甜菜M14品系在細(xì)胞胚胎學(xué)和遺傳學(xué)特征上具有鮮明的無融合生殖現(xiàn)象，是克隆無融合生殖基因極為難得的材料[9，10]。以往對(duì)于植物CK2的研究主要以擬南芥、水稻等模式植物為材料，本次對(duì)于CK2基因在甜菜中的克隆尚屬首次，這對(duì)于在甜菜中深入了解該基因的作用機(jī)理，尤其對(duì)研究甜菜生殖發(fā)育的分子生物學(xué)調(diào)控機(jī)理具有重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料

選用甜菜(Beta vulgaris）M14品系為植物材料，種植于黑龍江大學(xué)溫室及試驗(yàn)田。

1.2 主要試劑

pMD18-T Vector，膠回收試劑盒，M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit，TaKaRa RNA LA PCRTMKit(AMV）Ver.1.1均購(gòu)自大連寶生物(Takara）公司；5′RACE試劑盒使用SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit (CLONTECH)；所用引物由上海生物工程公司合成。

1.3 總RNA的提取及RT-PCR

于甜菜花期陽光較充足的上午進(jìn)行采樣，取約0.6g花蕾用錫紙包好，液氮速凍，-70℃保存?zhèn)溆?。用TRIzo1法提取甜菜M14品系花蕾總RNA。根據(jù)已發(fā)表的其他物種的CK2基因核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，找出其高度同源的序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物：BvCK2-1，BvCK2-2(表1）。取花蕾總RNA 0.6μL，反轉(zhuǎn)錄過程參照LA PCRTMKit試劑盒說明書。

PCR反應(yīng)：逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物10μL，10×LA RNA PCR BufferⅡ4μL，25mM MgC124μL，引物BvCK2-1和BvCK2-2各1μL，ddH2O 31.75μL，TaKaRa LA Taq 0.25μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果。

1.4 3'RACE

根據(jù)已克隆的CK2基因的保守片段和真核生物3′末端具有Po1y尾的特性，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPrimier5.0設(shè)計(jì)3′RACE引物：BvCK2-3，M13 Primer M4(表1）。反轉(zhuǎn)錄體系同1.3。反應(yīng)條件：30℃10min，50℃30min，99℃5min，5℃5min。

PCR反應(yīng)體系為：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物10μL，MgC12(25mM）3μL，10×LA PCR BufferⅡ4μL，滅菌蒸餾水31.75μL，TaKaRa TaqTM0.25μL，M13 Primer M4 0.5μL，BvCK2-3 Primer 0.5μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果。

1.5 5'RACE

根據(jù)已克隆的3′RACE序列和引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPrimier5.0，在3′RACE序列的5′末端設(shè)計(jì)兩組5′RACE引物：BvCK2-GSP1，BvCK2-GSP2(表1）。

反轉(zhuǎn)錄過程：RNA 3μg，5′CDS引物1μL，SMART II A引物1μL。70℃保溫2min，冰上冷卻2min，加入5×First-Strand buffer 2μL，DTT 1μL，10mM dNTP Mixture 1μL，Reverse Transcriptase 1μL。42℃水浴1.5h。加入TE(Tricine-EDTA）緩沖液100μL。72℃保溫7h。

PCR反應(yīng)體系為：PCR-Grade Water 34.5μL，10×Advantage 2 PCR Buffer 5μL，10mM dNTP Mixture 10μL，50×Advantage 2 Po1ymerase Mix 1μL，5′RACE-Ready cDNA 2.5μL，10×UPM引物5μL，10μM GSP引物1μL。以降落PCR程序進(jìn)行擴(kuò)增，94℃30s，72℃3min，5個(gè)循環(huán)，94℃30s，70℃30s，72℃3min，5個(gè)循環(huán)，94℃30s，68℃30s，72℃30s，25個(gè)循環(huán)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果。

1.6 序列測(cè)序拼接及RT-PCR驗(yàn)證和酶切驗(yàn)證

將RT-PCR產(chǎn)物、3′RACE產(chǎn)物及5′RACE第二輪產(chǎn)物分別連接到pMD18-T載體進(jìn)行測(cè)序。采用DNAMAN軟件將3′端和5′端的保守區(qū)段進(jìn)行重疊序列拼接，并根據(jù)此序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增全長(zhǎng)的cDNA序列：BvCK2-4，BvCK2-5(表1）。對(duì)PCR驗(yàn)證后的陽性克隆子用HindⅢ進(jìn)行酶切鑒定。

表1 BvCK2擴(kuò)增引物

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜BvCK2全長(zhǎng)cDNA序列擴(kuò)增

提取甜菜M14植株的花蕾RNA，經(jīng)RT-PCR后，獲得383bp的特異條帶(圖1）。通過B1ast同源比較，發(fā)現(xiàn)其與百合(GenBank No.AF517838）、擬南芥(GenBank No.NM-114860）、水稻(GenBank No.AB036788）及煙草(GenBank No.AJ437635）的相應(yīng)保守片段相似率分別為79.37%、80.79%、80.00%和82.51%，從而初步證實(shí)了這條特異條帶為目的基因BvCK2的基因片段。為了獲得全長(zhǎng)基因，實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行了3′RACE、5′RACE擴(kuò)增。如圖2a所示，通過3′RACE擴(kuò)增，獲得了產(chǎn)物大小為1.27kb的片段；同時(shí)，5′RACE擴(kuò)增的結(jié)果顯示，第一輪擴(kuò)增并沒有獲得明顯條帶。繼而取第一輪5′RACE產(chǎn)物稀釋10倍后作為巢式PCR的模板，擴(kuò)增BvCK2基因的5′末端，電泳結(jié)果出現(xiàn)大約476bp的條帶(圖2b）。將已測(cè)序的BvCK2 cDNA保守片段3′和5′末端片段互相核對(duì)，尋找互相重疊的片段從而拼接出全長(zhǎng)cDNA序列。為了進(jìn)一步確定所獲得基因的正確性，實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行了PCR和酶切檢測(cè)，如圖3所示，PCR擴(kuò)增后在1300bp位置獲得了目的條帶(圖3a）；而由于BvCK2全序列上有一個(gè)HindⅢ酶切位點(diǎn)，因而經(jīng)酶切鑒定后分別獲得了800bp和500bp左右的片段(圖3b）。

圖1 BvCK2目的基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果M，marker

圖2 BvCK2基因片段3'RACE(a),5'RACE(b)擴(kuò)增結(jié)果M，marker

圖3 a,BvCK2基因PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)；b,BvCK2基因(1)及其HindⅢ酶切結(jié)果(2)M，marker

2.2 甜菜BvCK2全長(zhǎng)cDNA序列分析

甜菜BvCK2全長(zhǎng)1501bp，含有444個(gè)腺嘌呤(29.6%）、307個(gè)胞嘧啶(20.5%）、313個(gè)鳥嘌呤(20.9%）和437個(gè)胸腺嘧啶(29.1%）(圖4）。采用NCBI的B1ast軟件對(duì)核酸序列進(jìn)行分析，BvCK2與水稻CK2(GenBank No.AB036788）同源性為61.05%，與玉米CK2(GenBank No.NP001105）的同源性為61.07%，與擬南芥CK2 (GenBank No.NM-114860）的同源性為62.07%，與煙草CK2(GenBank No. AJ437635）的同源性為64.22%，與百合CK2(GenBank No.AF517838）的同源性為65.18%。運(yùn)用NCBI中ORF查找器對(duì)甜菜CK2核苷酸序列進(jìn)行ORF查找及氨基酸序列推導(dǎo)分析，發(fā)現(xiàn)甜菜CK2基因中含有一個(gè)長(zhǎng)度為1002bp，編碼333個(gè)氨基酸殘基的完整的開放閱讀框，始于176bp，止于1177bp，含有175bp的5′非編碼序列，287bp的3′非編碼序列以及40bp的po1y A尾。該蛋白預(yù)期的分子量為39.28kDa，pI=8.16。細(xì)胞內(nèi)的定位進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，PSORT(Prediction of protein 1oca1ization sites，version6.4）表明基因所編碼的蛋白主要存在于細(xì)胞核中。

圖4 BvCK2的核苷酸序列

3 討論

對(duì)于甜菜M14品系無融合生殖相關(guān)基因的克隆，近年來已成為分子育種領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，但由于這一特殊的生殖現(xiàn)象是一個(gè)由多基因控制的數(shù)量性狀，并且單基因的表達(dá)豐度較低，這就給利用差異顯示等方法進(jìn)行基因克隆帶來了難度。本研究另辟蹊徑，利用在其它物種中已有的生殖相關(guān)基因的保守序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，并利用3′和5′RACE對(duì)M14甜菜的生殖相關(guān)基因的全長(zhǎng)進(jìn)行克隆。CK2(casein kinase2)是一類具有代表性的具有生殖相關(guān)特性的蛋白激酶。研究中發(fā)現(xiàn)，利用5′RACE的方法進(jìn)行5′端未知片段的擴(kuò)增時(shí)，效率相對(duì)較低，而且容易出現(xiàn)非特異條帶。因而，通過反復(fù)的優(yōu)化，在本研究中，在向5′上游擴(kuò)增未知片段時(shí)，采用了巢式PCR的方法，設(shè)計(jì)了兩對(duì)外側(cè)引物和內(nèi)側(cè)引物，分別進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)，將外側(cè)引物擴(kuò)增的片段又經(jīng)內(nèi)側(cè)引物擴(kuò)增，這樣既可增加了產(chǎn)物特異性，又增加了反應(yīng)的敏感性。

由于物種間差距，相同基因的同源性一般并非很高。在其它物種中表達(dá)的基因在甜菜M14品系中并不一定表達(dá)。即便表達(dá)，其豐度也很低。由于基因表達(dá)存在時(shí)空差異性，在特定的開花期和特定的表達(dá)部位——花蕾中是否表達(dá)也不確定，這便加大了克隆的難度。還由于一些結(jié)構(gòu)基因表達(dá)量較高，在之前實(shí)驗(yàn)中克隆出的片段經(jīng)測(cè)序后為一些表達(dá)量較高的結(jié)構(gòu)基因而并非待擴(kuò)增的片段，如16srRNA基因等，這就干擾了低表達(dá)量基因的克隆。為了克服基因表達(dá)豐度低的問題，本實(shí)驗(yàn)加大了cDNA模板的使用量，并優(yōu)化PCR體系，反復(fù)多次實(shí)驗(yàn)，最終獲得了全長(zhǎng)的目的基因，進(jìn)而也為下一步進(jìn)行對(duì)BvCK2基因特性更加深入地分析打下了良好的基礎(chǔ)。

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Molecular Cloning and Sequence Analysis of the Full-length cDNA of Gene BvCK2 from Beta vulgaris

LU Zhen-qiang1，PAN Yan-yao1，CHEN Lian-jiang2，ZHU Yan-ming3，LI Chun-yu1
(1.College of Life Sciences,Heilongjiang University,Harbin 150080,China;2.Institute for Crop Research,Heilongjiang University, Harbin 150080,China;3.College of Life Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Beta vulgaris 1ine M14 has an obvious characteristic of apomixis phenomenon in ce11 embryo1ogy and genetics.In order to find re1ated genes in such process and its function，BvCK2(Beta vulgaris casein kinase 2)gene was first1y c1oned by using the method of homo1ogous c1one by the technique of Rapid Amp1ification of cDNA End (RACE).The fu11-1ength cDNA sequence of BvCK2 is 1 501 bp in size and has an open reading frame of 1 002 bp encoding a po1ypeptide of 333 amino acids.The pI/protein mo1ecu1ar weight deduced from the amino acids sequence is 8.16 and 39.28 kDa.Homo1ogous a1ignment indicates that it is 64.22%homo1ogy with tobacco (GenBank No.AJ437635)，65.18%homo1ogy with 1i1y(GenBank No.AF517838).Prediction of protein 1oca1ization sites(version6.4)indicates that the coding protein of BvCK2 gene main1y exists in nuc1eus.

Sugarbeet(Beta vulgaris);BvCK2;RACE;Gene c1oning;Sequence ana1ysis

雜566.303

A

1007-2624(2009）01-0008-04

2008-07-17

中國(guó)博士后科學(xué)基金面上資助項(xiàng)目(20080440918）；黑龍江省博士后基金資助項(xiàng)目(LBH-Z07029）；黑龍江省教育廳資助項(xiàng)目(11521222）；黑龍江大學(xué)青年基金項(xiàng)目(QL200526）。

魯振強(qiáng)(1968-），男，博士，碩士生導(dǎo)師。主要從事植物基因組研究。Te1.0451-86608243;E-mai1.zhenqiang1u@163.com

陳連江，研究員，黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院。E-mai1：1jchen.2008@163.com。