楊運(yùn)發(fā) 杜洪 黃蘋 王建煒 張光明 徐中和

基礎(chǔ)研究

XIAP表達(dá)在IIB期骨肉瘤早期預(yù)后的意義

楊運(yùn)發(fā) 杜洪 黃蘋 王建煒 張光明 徐中和

目的通過(guò)分析IIB期骨肉瘤化療前活檢標(biāo)本XIAP的表達(dá)，探討XIAP表達(dá)與IIB期骨肉瘤的早期預(yù)后預(yù)測(cè)的意義。方法應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)31例IIB期骨肉瘤化療前穿刺標(biāo)本、10例正常骨組織標(biāo)本XIAP的表達(dá)，并分析XIAP表達(dá)與各臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果IIB期骨肉瘤化療前標(biāo)本均為XIAP高表達(dá)而正常骨為低表達(dá)或不表達(dá)；XIAP表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤部位、大小、術(shù)前化療腫瘤壞死率、局部復(fù)發(fā)等臨床病理參數(shù)無(wú)關(guān)（P＞0.05），XIAP高表達(dá)與IIB期骨肉瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（r=0.748,P=0.025）及最終成活（r=0.813,P=0.014）高度相關(guān)；IIB期骨肉瘤化療前標(biāo)本XIAP高表達(dá)者預(yù)后差。結(jié)論XIAP在IIB期骨肉瘤的發(fā)展中起重要的作用，化療前活檢標(biāo)本的XIAP表達(dá)可作為IIB期骨肉瘤早期預(yù)后預(yù)測(cè)的指標(biāo)。

骨肉瘤；細(xì)胞凋亡；腫瘤蛋白質(zhì)類；抑制蛋白

研究證實(shí)X鏈鎖的凋亡抑制蛋白（XIAP，X-Linked Inhibitor of Apoptosis Protein）是惡性腫瘤諸如胰腺癌、卵巢癌、鼻咽癌、前列腺癌、膀胱癌、急性髓型白血病等的發(fā)生、發(fā)展的重要因素［1-5］?？赡苡捎谛g(shù)前化療的影響，XIAP在骨肉瘤組織中的表達(dá)卻仍知之甚少，因此，我們?cè)O(shè)計(jì)從31例IIB期骨肉瘤化療前活檢標(biāo)本來(lái)研究XIAP在骨肉瘤組織中的表達(dá)，以期揭示XIAP表達(dá)與骨肉瘤發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1一般資料

2000年1月～2006年12月，共有31符合下列條件的IIB期原發(fā)性骨肉瘤患者進(jìn)入本研究：（1）高分化骨肉瘤；（2）無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；（3）未經(jīng)任何治療；（4）有活檢標(biāo)本。腫瘤部位：股骨遠(yuǎn)段16例，脛骨近段3例，肱骨近段3例，腓骨近段1例，股骨近段4例，骨盆3例，肋骨2例。治療方法：保肢28例，截肢3例。31例患者均采用改良T10方案［6］在術(shù)前行2周期及術(shù)后至少4周期化療，每一療程均包括大劑量氨甲喋呤（MTX，8～12 g/m2，共2次）、阿霉素（adriamycin，30 mg/m2，1次）和順鉑（cisplatin，100 mg/m2，1次）。隨訪期從初次確診起，至發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移如肺轉(zhuǎn)移或最后就診止，最短隨訪時(shí)間為12月，平均隨訪時(shí)間為35月?；颊咦詈笄闆r由臨床檢查及X線檢查等證實(shí)。在整個(gè)隨訪期內(nèi)，12例死亡，19例無(wú)瘤存活；11例遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（肺轉(zhuǎn)移或骨轉(zhuǎn)移），轉(zhuǎn)移出現(xiàn)在初次確診后平均14個(gè)月，無(wú)任何肺轉(zhuǎn)移患者行肺切除術(shù)。2例出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為6.45%。局部復(fù)發(fā)患者分別在復(fù)發(fā)后1個(gè)月和8個(gè)月出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移。該31例石臘包埋的IIB期骨肉瘤化療前活檢標(biāo)本由病理科醫(yī)生進(jìn)行再次確認(rèn)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

采用免疫組織化學(xué)SP染色法。SP試劑盒由深圳晶美生物工程有限公司提供，一抗XIAP鼠抗人單克隆抗體（R&D公司）工作濃度為25 μg/ml。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，主要步驟為：石臘切片脫臘至水，3%過(guò)氧化氫室溫孵育10分鐘，以微波枸櫞酸鹽進(jìn)行抗原修復(fù)，正常羊血清封閉20分鐘，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明封片，中性樹膠封固。選用已知的骨肉瘤組織XIAP表達(dá)陽(yáng)性的標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為骨肉瘤陰性對(duì)照。

免疫組化結(jié)果判斷：所有已染色的標(biāo)本分別由2名病理科醫(yī)生獨(dú)立分析。XIAP染色以細(xì)胞核著色棕或黃色為陽(yáng)性細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn)，染色強(qiáng)度選用染色陽(yáng)性的骨肉瘤組織作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，0分為藍(lán)色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞（如細(xì)胞數(shù)不足1 000，則計(jì)數(shù)實(shí)際細(xì)胞數(shù)）。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)參照Kim等[4]研究骨肉瘤組織中ezrin表達(dá)計(jì)分的四分位計(jì)分方法進(jìn)行計(jì)分，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分（陰性），陽(yáng)性細(xì)胞≤25%為1分，25%＜陽(yáng)性細(xì)胞≤50%為2分，50%＜陽(yáng)性細(xì)胞≤75%為3分，陽(yáng)性細(xì)胞＞75%為4分。將上述兩者積分相加的最后得分作為XIAP表達(dá)強(qiáng)度（0～7分）：0分為不表達(dá)，1～5分為低表達(dá)，6～7分為高表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系包括XIAP表達(dá)、年齡、性別、部位、腫瘤大?。ǔ醮蜯RI腫瘤最長(zhǎng)徑）、化療后腫瘤壞死率、局部復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、最終結(jié)果等進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行，任何可能影響預(yù)后的因素均采用雙尾Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗(yàn)，為確定各參數(shù)是否為獨(dú)立危險(xiǎn)因素，采用Spearman相關(guān)分析分析其相關(guān)性，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

XIAP主要在細(xì)胞的胞核中表達(dá)。已知強(qiáng)染色陽(yáng)性的骨肉瘤切片作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。在本研究中，幾乎所有的骨肉瘤組織均為XIAP強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而正常骨組織為陰性表達(dá)（圖1）。XIAP高表達(dá)者與患者預(yù)后差獨(dú)立相關(guān)，而與年齡、性別、部位、腫瘤大小、化療壞死率、局部復(fù)發(fā)無(wú)關(guān)（表1～2）。XIAP高表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移高度相關(guān)（r=0.748, P=0.025），并且XIAP高表達(dá)與患者最終結(jié)果也高度相關(guān)（r=0.813,P=0.014)。

3 討論

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤之一。在新輔助化療前，骨肉瘤的5年存活率僅約20%。隨著影像診斷技術(shù)、外科手術(shù)特別是新輔助化療的進(jìn)步，骨肉瘤的5年存活率達(dá)到60%～70%，其臨床效果仍不甚滿意。

骨肉瘤療效不滿意的原因，可能主要是骨肉瘤腫瘤細(xì)胞對(duì)化療等療法不敏感所致。這些看似不同的治療方法其實(shí)是通過(guò)相同的生物學(xué)機(jī)制即細(xì)胞凋亡的方式來(lái)消除腫瘤的[5]。在凋亡的調(diào)節(jié)因素中，凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）是新發(fā)現(xiàn)的一類在結(jié)構(gòu)上具有同源性的細(xì)胞凋亡抑制蛋白，是最強(qiáng)的內(nèi)源性凋亡抑制因子，而XIAP是IAP家族中最有效的凋亡抑制劑。已證實(shí)XIAP表達(dá)與胰腺癌，卵巢癌，鼻咽癌，前列腺癌，膀胱癌，急性髓型白血病等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1,2]。本研究中IIB骨肉瘤也幾乎總是XIAP高表達(dá)，而正常骨低表達(dá)或不表達(dá)，說(shuō)明XIAP也與IIB期骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

表1 XIAP表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

圖1 XIAP表達(dá)（臺(tái)盼蘭染色，蘇木素復(fù)染，×400）A已知的對(duì)照的XIAP強(qiáng)陽(yáng)性骨肉瘤切片 B本研究中XIAP強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)的骨肉瘤切片 C本研究中XIAP陰性表達(dá)的骨肉瘤切片 D平行對(duì)照的正常骨XIAP表達(dá)。.

表2 腫瘤轉(zhuǎn)移、患者存活情況與各變量的關(guān)系

已證實(shí)眾多因素如腫瘤壞死率、腫瘤大小、年齡、P-glycoprotin的過(guò)度表達(dá)和HER2/erB-2基因表達(dá)等并非總是與高分化骨肉瘤的預(yù)后相關(guān)［6］。在眾多影響預(yù)后的因素中，目前應(yīng)用最廣的是腫瘤組織的化療反應(yīng)，即腫瘤的化療壞死率。盡管已有很多研究證實(shí)腫瘤壞死率的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值，但其預(yù)測(cè)作用明顯滯后，我們不可能在化療前對(duì)該腫瘤的預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)。化療后腫瘤壞死率的預(yù)后預(yù)測(cè)的局限主要在于：（1）需2～3個(gè)月的時(shí)間判斷壞死率；（2）在化療前無(wú)從明了；（3）即便是化療敏感者也不乏早期轉(zhuǎn)移。因此，骨肉瘤的預(yù)后預(yù)測(cè)仍較困難。

與術(shù)前化療后壞死率相比，應(yīng)用未行任何治療前活檢標(biāo)本的XIAP表達(dá)指標(biāo)來(lái)預(yù)測(cè)骨肉瘤預(yù)后似乎更為簡(jiǎn)單和有效。本研究結(jié)果顯示，IIB期骨肉瘤幾乎總是XIAP高表達(dá)，而正常骨低表達(dá)或不表達(dá)，且XIAP高表達(dá)與轉(zhuǎn)移和最終結(jié)果均高度相關(guān)。由于幾乎所有的骨肉瘤化療前活檢標(biāo)本均為強(qiáng)XIAP表達(dá)而正常骨標(biāo)本僅弱表達(dá)或不表達(dá)，既然XIAP高表達(dá)者預(yù)后差，我們就可以通過(guò)檢查XIAP表達(dá)及比較臨床化療反應(yīng)預(yù)測(cè)其預(yù)后，還可根據(jù)活檢時(shí)XIAP表達(dá)將骨肉瘤分組（XIAP高表達(dá)組與低表達(dá)組）來(lái)制定更為個(gè)體化的治療方案，甚至可能通過(guò)這一做法進(jìn)一步提高患者的存活率，比如針對(duì)XIAP較低表達(dá)者有更長(zhǎng)的生存期，可采取更為積極的保肢治療[7]。因此，化療前穿刺標(biāo)本的XIAP表達(dá)可作為IIB期骨肉瘤患者早期預(yù)后預(yù)測(cè)的指標(biāo)。

1 Eckelman BP,Salvesen GS,Scott FL.Human inhibitor of apoptosis proteins:why XIAP is the black sheep of the family [J].EMBO Rep,2006,7(10):988-994.

2 Li M,Song T,Yin ZF,et al.XIAP as a prognostic marker of early recurrence of nonmuscular invasive bladder cancer[J]. Chin Med J(Engl),2007,120(6):469-473.

3 Meyers PA,Heller G,Healey J,et al.Chemotherapy for nonmetastatic osteogenic sarcoma: the Memorial Sloan-Kettering experience[J].J Clin Oncol,1992,10(1):5-15.

4 Kim MS,Song WS,Cho WH,et al.Ezrin expression predicts survival in stage IIB osteosarcomas[J].Clin Orthop Relat Res, 2007,459:229-236.

5 Meyers PA,Schwartz CL,Krailo M,et al.Osteosarcoma:a randomized,prospective trial of the addition of ifosfamide and/ or muramyl tripeptide to cisplatin,doxorubicin,and high-dose methotrexate[J].J Clin Oncol,2005,23(9):2004-2011.

6 Serra M,Scotlandi K,Reverter-Branchat G,et al.Value of P-glycoprotein and clinicopathologic factors as the basis for new treatment strategies in high-grade osteosarcoma of the extremities[J].J Clin Oncol,2003,21(3):536-542.

7 Yang YF,Zhang GM,XU ZH,et al.Structural bone allografts with intramedullary vascularized fibular autografts for the treatment of massive bone defects in extremities[J].J Med Coll PLA,2007,22(5):298-302.

（本文編輯 白朝暉）

XIAP expression and its predictive significance of prognosis in stage IIB osteosarcomas

Objective To evaluate XIAP expression in biopsy specimens from the patients with stage IIB osteosarcomas before chemotherapy and its predictive value of prognosis in this stage.Methods The expression of XIAP was retrospectively detected by SP immunohistochemistry in 31 biopsy specimens from stage IIB osteosarcomas before chemotherapy and 10 normal individuals.The relationship between XIAP expression and clinic-pathological features of the patients was analyzed.Results The osteosarcoma specimens showed strong cellular nucleus immunre-activity of XIAP compared normal bone specimens.High XIAP positive expression independently predicted the patient's poor outcome,and had no relationship with clinic-pathologic variables such as age,gender,location,tumor size,rate of tumor necrosis to preoperative chemotherapy,as well as local recurrence(P＞0.05).However significant correlations were found between high XIAP expression and degree of metastasis(r=0.748,P=0.025),and also final survival rate(r=0.813,P=0.014).Conclusions XIAP plays an important role in the development of stage IIB osteosarcomas and this expression before chemotherapy can be a early promising prognostic marker in the outcome of patients with stage IIB osteosarcomas.

Osteosarcoma;Apoptosis;Neoplasms proteins;Arrestin

R738.1

A

1674-666X(2009)01-0062-04

廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目（2006-YB-017）

510180廣州，廣州市第一人民醫(yī)院（廣州醫(yī)學(xué)院附屬?gòu)V州第一人民醫(yī)院）骨科（楊運(yùn)發(fā),王建煒，張光明，徐中和），病理科（杜洪）；廣州醫(yī)學(xué)院附屬荔灣醫(yī)院外科(黃蘋）

E-mail：yyf701107@163.com

*YANG Yun-fa,DUHong,HUANG Pin,WANG Jian-wei,ZHANG Guang-ming,XU Zhong-he.Department of Orthopaedics, Affiliated Guangzhou First Municipal People's Hospital,Guangzhou Medical College,Guangzhou,Guangdong 510180,China