何 澤，南 征，李 才

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 糖尿病科，吉林 長(zhǎng)春 130021;2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 中醫(yī)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130021;3.吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130021)

解毒通絡(luò)保腎散是我們經(jīng)臨床研究治療糖尿病腎病(DN)的有效中藥復(fù)方，由中藥大黃、黃連、金銀花、黃芪等藥物組成，具有益氣養(yǎng)陰、活血化瘀、解毒通絡(luò)之功效，臨床應(yīng)用10年，取得了較好的臨床療效，初步顯示了防治DN的優(yōu)勢(shì)。為了進(jìn)一步觀察解毒通絡(luò)保腎散的防治機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)擬觀察AGEs對(duì)正常大鼠腎臟功能的毒害作用及解毒通絡(luò)保腎散的拮抗AGEs的作用，為尋找抑制非酶糖化反應(yīng)的有效中藥、防治并發(fā)癥提供可行的途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性Wistar大鼠，體重170～200 g，由吉林省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼料由吉林省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的常規(guī)大鼠飼料，實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由攝食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，取尿糖、尿蛋白陰性的健康狀況良好的動(dòng)物為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.2 主要試劑和藥品 中藥解毒通絡(luò)保腎散(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供)，氨基胍(美國(guó)Sigma公司)，尿微量白蛋白酶免法試劑盒(上海德波生物技術(shù)有限公司)。

1.3 主要儀器 醫(yī)用離心機(jī)(北京)，721(722)型分光光度計(jì)(上海)，日立7150型生化自動(dòng)分析儀(日本)，RF-540型熒光分光光度計(jì)(Shimida,日本)，PHS-3C型酸度計(jì)(上海),HZS-H水浴振器(哈爾濱)。

1.4 體外注射糖基化血清蛋白(GSP)的制備 取正?；旌洗笫笱澹?jīng)56℃、30 min滅活后，在體外糖基化體系制備GSP。按血清蛋白終濃度5 mg/mL、葡萄糖500 mmol/L、青霉素和鏈霉素各100 u/mL,溶于PBS(pH 7.2)，經(jīng)Gs漏斗抽濾后置37℃、密閉避光環(huán)境中反應(yīng)2個(gè)月。用透析袋透析72 h以除去葡萄糖，再次用Gs漏斗抽濾取樣檢測(cè)相對(duì)熒光值、果糖胺、5-HMF及葡萄糖含量后分別凍存。對(duì)照組血清蛋白(天然血清蛋白)除不含葡萄糖外，其他成分及反應(yīng)過(guò)程均同GSP，并在透析后加入葡萄糖，使與GSP中葡萄糖含量相等后凍存。

1.5 體外注射GSP的動(dòng)物模型分組及處理因素

1.5.1 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，禁食12 h,將尿糖、尿蛋白陰性者列入觀察對(duì)象，按體重隨機(jī)選取50只，均分為5組，每組10只。正常組不加任何處理；單純血清組每日1次尾靜脈注射單純血清100 mg/kg；糖化血清蛋白組、氨基胍組、解毒通絡(luò)保腎散組分別每日1次尾靜脈注射糖化血清蛋白液100 mg/kg，以上4組注射劑量由每只鼠0.5 mL逐漸增至1.5 mL，每日1次，共注射1個(gè)月。其中解毒通絡(luò)保腎散組每日上午灌服解毒通絡(luò)保腎散濃縮液6 g/kg體重(按生藥計(jì))、氨基胍組每日上午腹腔注射氨基胍40 mg/kg體重，其余3組均灌胃等體積蒸餾水,實(shí)驗(yàn)1月后，取血、尿、組織標(biāo)本測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。

1.5.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前兩天，將大鼠放入代謝籠內(nèi)收集24 h尿液。收集尿液期間動(dòng)物禁食，自由飲水，盡量減少聲、光等對(duì)動(dòng)物的刺激。收集尿液記錄體積后，按待測(cè)指標(biāo)要求進(jìn)行樣品預(yù)處理，留樣本于4 ℃待測(cè)。

1.5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，大鼠麻醉下眶后血管采血，肝素抗凝，1 500r/min,離心30 min后，分離血清，-20℃凍存?？焖偾谐I臟，取左腎，稱重，部分腎臟切成小塊，經(jīng)2.5%戊二醛/0.1M二甲胂酸鈉緩沖液(pH 7.4)固定后用于后期病理標(biāo)本制備；部分腎臟經(jīng)10%中性福爾馬林液固定，制備石蠟切片。取右腎液氮冷凍檢測(cè)AGEs含量。

1.6 觀察指標(biāo) 各組大鼠一般情況、血清生化指標(biāo)檢測(cè)：包括血糖、腎功能(血清肌酐、尿肌酐、尿素氮)、尿蛋白、尿微量白蛋白含量測(cè)定、腎重、血清、腎組織AGEs含量的測(cè)定等。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)比較 各組大鼠精神狀態(tài)、毛色、飲水量、尿量、體重等無(wú)明顯差異(P>0.05)。

2.2 各組大鼠血清生化指標(biāo)比較 各組大鼠尿素氮、血肌酐、總膽固醇、血糖均無(wú)明顯差別(P>0.05)。

2.3 各組大鼠腎重/體重比值結(jié)果 見表1。

表1 各組大鼠腎重/體重比較

2.4 各組大鼠24 h尿總蛋白、尿總白蛋白比較 見表2。

表2 各組大鼠24 h尿蛋白、尿總白蛋白比較

2.5 各組大鼠血清及腎組織AGEs含量比較 見表3。

表3 各組大鼠血清及腎組織AGEs含量比較

3 討論

糖尿病腎病(DN)的發(fā)生發(fā)展是多因素綜合作用的結(jié)果，其中非酶糖化及其終末產(chǎn)物AGEs在DN的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，同時(shí)在糖尿病(DM)時(shí)腎臟易受到AGEs的損害。腎小球基底膜增厚和以腎小球系膜區(qū)為主的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)積聚是DN的基本病理特點(diǎn)。檢測(cè)體內(nèi)AGEs水平，對(duì)中西醫(yī)進(jìn)一步研究DM慢性并發(fā)癥的發(fā)生、評(píng)估程度、監(jiān)測(cè)長(zhǎng)期血糖控制水平以及指導(dǎo)DM治療，阻斷高血糖的遠(yuǎn)端效應(yīng)等均具有十分重要的意義。由于至今尚未完全弄清楚其結(jié)構(gòu),因此在實(shí)驗(yàn)中若直接應(yīng)用AGEs或AGEs的修飾物是比較困難的。而用糖基化血清蛋白(GSP)觀察其對(duì)腎臟功能的影響是適宜的。AGEs在DN中的一個(gè)重要作用是引起ECM的分子結(jié)構(gòu)及組成改變。從而引起基質(zhì)功能的改變。體內(nèi)給予AGEs能引起正常大鼠發(fā)生類似DN的組織學(xué)改變和病理生理改變[4-6]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，解毒通絡(luò)保腎散組、氨基胍對(duì)照組大鼠尿微量白蛋白均明顯低于糖化血清蛋白組(P<0.01),尿微量白蛋白主要反應(yīng)腎小球?yàn)V過(guò)功能，AGEs分子間的異常交聯(lián)增多，膠原纖維之間的正常交聯(lián)減少，造成腎小球率過(guò)孔徑增大，是出現(xiàn)蛋白尿的形態(tài)基礎(chǔ)。與糖化血清蛋白組比較，解毒通絡(luò)保腎散組血清及腎組織AGEs含量明顯降低(P<0.01)。結(jié)果提示：AGEs的形成、堆積與DM腎臟損害及白蛋白尿的排泄密切相關(guān)，而中藥解毒通絡(luò)保腎散具有拮抗AGEs的毒害作用。

[1]Vlassara,H.Pathogenic effects of advanced glycosylation: Biolojic,biologic and clinical implilation for diabetes and ageing.Lab Invest,1994,70:138.

[2]Yang C-W,et al.Andvanced glycation end products up-regulate gene expression found in diabetic glomerrular diease.Proc Natl Acad USA,1992,91:9436.

[3]凌啟波.實(shí)用病理特殊染色和組化技術(shù)[M].廣州:廣東高等教育出版社,1989:232-235.

[4]Vlassara H.Pathogenic effects of advanced glycosylation:Biolojic,biologic and clinical implilation for diabetes and ageing.Lab Invest,1994,70:130.

[5]Valassara H et al.Advanced glycation end products induce glomerular sclersis and albuminia in normal rats.Pro Natl Acad Sci USA,1994,91:11704.

[6]Okada Y,Gonoji y,Nata k.Matrix metalloproteinase-9 (92KD gelatinase/typeⅣcollagenase)from HT1080 human fibrosarcoma cells.j.Biol Chem,1992,267:21712-21719.