張國華　喬建衛(wèi)　張如松

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053）お

摘 要：利用響應(yīng)面法對(duì)超聲提取杭白菊中黃酮類成分的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。在對(duì)乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度等單因子實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組和設(shè)計(jì)原理，采用四因子三水平的響應(yīng)面分析法，得出了超聲提取黃酮的最佳工藝條件。

關(guān)鍵詞：響應(yīng)面法；杭白菊；黃酮

中圖分類號(hào)：R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1673-2197（2009）03-0020-03オ

杭白菊為多年生草本菊科植物菊（Cyrysanthemum Morifolium Ramat）的頭狀花序。古人吳瑞謂：“花大而香者為甘菊，花小而黃者為黃菊，花小而氣惡者為野菊。”常用的菊花品種根據(jù)地理?xiàng)l件分有亳菊（安徽亳縣）、滁菊（安徽滁縣）、杭白菊（主產(chǎn)浙江桐鄉(xiāng)、海寧，因主要集散地為杭州而得名，為浙八味之一）、懷菊（河南泌陽）等。杭白菊性辛、甘、苦，微寒；歸肺、肝經(jīng)。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為，菊花具有散風(fēng)清熱、平肝明目的功效，可用于風(fēng)熱感冒、發(fā)熱頭痛、目赤昏花、眩暈驚風(fēng)、疔瘡腫毒?，F(xiàn)代研究證明杭白菊含揮發(fā)油、黃酮及多種維生素和微量元素。其中，杭白菊黃酮類化合物（刺槐苷、大波斯菊苷、木犀草-7-葡萄糖苷、香葉木素-7-葡萄糖苷、菊苷）可保護(hù)心血管、清除自由基等。因此，優(yōu)化黃酮類化合物的提取條件具有重要意義。

響應(yīng)面分析法（RSM，Response Surface Method）采用多元二次回歸的方法，將多因子實(shí)驗(yàn)中因子指標(biāo)的相互關(guān)系用多項(xiàng)式近似擬合，通過對(duì)函數(shù)響應(yīng)面和等高線的分析，能夠精確地研究各因子與響應(yīng)^[6]值之間的關(guān)系。響應(yīng)面分析法能夠以最經(jīng)濟(jì)的方式對(duì)所選實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行全面的分析和研究，已越來越多地應(yīng)用于各種生物化工處理過程的優(yōu)化。本文以黃酮的提取率為指標(biāo)，應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)苦瓜皂苷的超聲提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到了黃酮的最佳提取工藝。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

FA1104型電子天平（上海儀器廠），UV-2600紫外可見分光光度計(jì)（惠普上海分析儀器有限公司），循環(huán)水式真空泵。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

杭白菊采于浙江杭州，經(jīng)本院資源鑒定教研室姚振生教授鑒定為Cyrysanthemum Morifolium Ramat。蘆丁對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：080-9002）。硫酸、苯酚、乙醇等試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 黃酮的提取

準(zhǔn)確稱取杭白菊1.0g，置于100mL圓底燒瓶中，加入一定量乙醇溶液，在一定的溫度、一定功料液比，提取一定的時(shí)間，取出過濾，濾液離心除雜，上清液減壓濃縮，即得皂苷粗提液。

2.2 黃酮標(biāo)準(zhǔn)液的配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密稱取經(jīng)120℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品9.15mg，置50mL量瓶中，加50%乙醇適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對(duì)照品液（0.183mg/mL）。

準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)液0.5，1，2，3，4，5mL，置25mL容量瓶中，加50%乙醇至6mL，加5%NaNO2 1.0mL，放置6min，加10% Al（NO3）31.0mL，放置6min，加10% NaOH 10mL，加50%乙醇至刻度，搖勻，放置15min，以相應(yīng)試劑作空白，509nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。用最小二乘法作線性回歸，得濃度C與吸光度A的關(guān)系曲線回歸方程式為：A=0.7716C+0.0676，R2=0.9999。

2.3 黃酮提取率的計(jì)算

吸取一定體積的杭白菊提取液，置于試管中，按2.2項(xiàng)方法操作，測(cè)定吸光度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出黃酮質(zhì)量，并按下述公式計(jì)算黃酮提取率：

黃酮提取率（%）=提取的黃酮質(zhì)量/杭白菊粉質(zhì)量×100%

3 結(jié)果分析

采用SAS 9.13軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸，以吸光度（Y）為因變量，乙醇濃度（X1）、料液比（X2）、提取溫度（X3）、提取時(shí)間（X4）為自變量，建立回歸方程如下：

Y=-20.3402+160.3279X1+0.241104X2-0.376771X3-9.714958X4-126.5104X1X1-0.286125X1X2+0.01275X1X3+3.97875X1X4-0.000138X2X2+0.001048X2X3-0.003362X2X4+0.002217X3X3+0.078981X3X4+0.304052X4X4

回歸方程可信度分析見表3，其中R2=87.96，表明87.96%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可用該模型進(jìn)行解釋，說明方程可靠性較高。CV值越低，顯示實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性越好，本實(shí)驗(yàn)中CV值為17.27946%，較低，說明實(shí)驗(yàn)操作可信。綜上所述，該回歸方程為優(yōu)化超聲提取黃酮的工藝條件提供了一個(gè)良好的模型。

采用SAS 9.13程序?qū)υ囼?yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見表4。表4中的“Pr>F”項(xiàng)表示大于F值的概率，從中可以看出X2料液比和X3*X4對(duì)Y值的影響顯著（“Pr>F”值小于0.05）；X1乙醇濃度，X3提取溫度和X1﹡X1對(duì)Y值的影響十分顯著（“Pr>F”值小于0.01），表明實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，因子間的交互作用影響較小。這和回歸方程中一次項(xiàng)影響顯著與二次項(xiàng)影響十分顯著相一致。

由SAS分析得到的最大響應(yīng)值（Y）時(shí)X1，X2，X3和X4對(duì)應(yīng)的編碼值分別為-0.10558，0.260214，0.830582，0.480911，與之對(duì)應(yīng)的黃酮提取的最佳工藝條件為：

乙醇濃度=0.7×（1-0.10558）=0.626094

料液比=30×（1+0.260214）=37.80642

提取溫度=70×（1+0.830582）=128.14074

提取時(shí)間=3×（1+0.480911）=4.442733

4 結(jié)論

本文通過響應(yīng)面分析法對(duì)杭白菊中黃酮的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并得到回歸方程。結(jié)果表明，各因素與指標(biāo)之間的關(guān)系不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而是二次關(guān)系，其中料液比對(duì)Y值的十分顯著；乙醇濃度、提取溫度對(duì)Y值的影響十分顯著。結(jié)合考慮實(shí)際操作的方便性及實(shí)驗(yàn)方差結(jié)果，確定最佳提取工藝條件為：料水比38，提取溫度128℃，乙醇濃度63%，提取時(shí)間4.5h。本實(shí)驗(yàn)方法工藝簡(jiǎn)單，提取率較高。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 楊俊，蔣惠娣，徐娟華.杭白菊總黃酮的提取工藝及其含量的動(dòng)態(tài)變化研究［J］.中草藥，2002，33（11）：988-990.

［2］ 陳志強(qiáng)，李貞景，王昌祿.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取苦瓜皂苷工藝條件的研究［J］.氨基酸和生物資源，2007，29（4）：21-25.

［3］ 欒連軍，孫禮富，楊學(xué)運(yùn)，等.杭白菊化學(xué)成分研究［J］.現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，1992，9（4）：159-160.

［4］ 任潔，朱英.杭白菊總黃酮的堿水提取工藝研究［J］.陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，31（2）：48-49.

［5］ 胡碧波，吳祖帥，蔡君，等.杭白菊中主要黃酮苷的測(cè)定及影響因素考察［J］.中國中藥雜志，2006，31（21）：1772-1775.

（責(zé)任編輯：姜付平）