王曉南　高　鵬　王麗環(huán)

（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，河北 石家莊 050035） お

摘 要：在大腸桿菌中利用基因重組技術(shù)獲得高效表達(dá)的人過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)，即利用pMAL-c2x構(gòu)建了從人cDNA文庫(kù)中獲得的CAT編碼基因融合表達(dá)載體，并進(jìn)行了表達(dá)。使融合表達(dá)獲得可溶性蛋白，為后續(xù)重組酶性質(zhì)的研究和開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌；人過(guò)氧化氫酶基因；融合表達(dá)；表達(dá)

中圖分類號(hào)：R378.2+1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1673-2197（2009）03-0005-02

1 過(guò)氧化氫酶的功能與來(lái)源

在生物體的新陳代謝中，細(xì)胞有氧呼吸所消耗的O2約10%被還原成H2_O2，而其很容易被細(xì)胞中各種還原劑還原成OH-和極毒的自由基?OH，它能氧化與它接觸的幾乎所有細(xì)胞組分，引起衰老、癌變及其它病癥。

但生物體有自己的保護(hù)機(jī)制，體內(nèi)存在的過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)能有效地催化細(xì)胞中產(chǎn)生的高濃度H2_O2(2H2_O2→O2+2H2_O)，使H2_O2不至于與細(xì)胞有氧代謝中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基O-2?進(jìn)一步生成羥自由基?OH，從而防止自由基對(duì)細(xì)胞的損傷^[1]。

此外，CAT還具有一些其它的生理功能。它除了可調(diào)節(jié)體內(nèi)H2_O2水平外，還可充當(dāng)Hb和其它含巰基蛋白質(zhì)的保護(hù)劑。主要與細(xì)胞內(nèi)線粒體及過(guò)氧體結(jié)合，同D-氨基酸氧化酶等一系列需氧脫氫酶相偶聯(lián)，從而迅速分解細(xì)胞代謝中產(chǎn)生的毒性物H2_O2，起到解毒與保護(hù)巰基酶、膜蛋白等作用^[2]。

商品化的過(guò)氧化氫酶主要來(lái)源于牛肝、微球菌和黑曲霉^[3]，多應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)^[4]。而對(duì)醫(yī)藥和保健來(lái)說(shuō)，人源的CAT應(yīng)用價(jià)值更高。本研究利用基因重組技術(shù)將人CAT基因分別構(gòu)建了融合和非融合表達(dá)載體，在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了有生物活性的表達(dá)，為其開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

2 人過(guò)氧化氫酶基因在大腸桿菌中的克隆與表達(dá)

2.1 材料

人cDNA文庫(kù)（購(gòu)自PROMEGA公司）；

菌種E.coli TB1、JM109，質(zhì)粒pMAL-c2x、pBV221，抗MBP抗血清，Amylose Resin（購(gòu)自NEB公司）；

TaqDNA聚合酶，限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、PstⅠ、NcoⅠ，DNA回收試劑盒，DL3000 DNA Marker，pMD19-T Vector（購(gòu)自TaKaRa公司）；

Factor Ⅹa（購(gòu)自BioLabs公司）；

二抗（羊抗兔），（購(gòu)自北京百靈克生物公司）。

2.2 方法

2.2.1 CAT基因的獲得

根據(jù)Genbank上登錄的人CAT基因NM-001752，利用primer5軟件在基因全長(zhǎng)范圍設(shè)計(jì)最佳引物對(duì)，正向?yàn)椋?-CGCACGCTATGGCTGACAG-3，反向?yàn)椋?-TGATGAGCGGGTTACACGG-3，以人cDNA文庫(kù)為模板進(jìn)行PCR。擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收，克隆至pMD19-T Vector，由北京華大基因研究中心測(cè)序。2.2.2 CAT表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)閱讀框架設(shè)計(jì)兩對(duì)帶酶切位點(diǎn)的引物，并以上述經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證的陽(yáng)性質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中引物對(duì)1，正向?yàn)椋?-GCTCTAGAATGGCTGACAGCCG-3，反向?yàn)椋?-AACTGCAGTCACAGATTTGCCTTC-3，并分別帶有XbaⅠ酶切位點(diǎn)、PstⅠ酶切位點(diǎn)。用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、PstⅠ雙切質(zhì)粒pMAL-c2X及引物對(duì)1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，分別回收目的片段與線性化載體片段后，用T4DNA連接酶連接過(guò)夜，構(gòu)建融合表達(dá)載體pMAL-c2x-CAT并轉(zhuǎn)化至E.coli TB1。

2.2.3 CAT基因的誘導(dǎo)表達(dá)

將37℃振蕩過(guò)夜的重組菌按1％量轉(zhuǎn)接到含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，20℃培養(yǎng)6h，加入IPTG至終濃度1mmol/L誘導(dǎo)12h。超聲破菌后，上清液用Amylose Resin進(jìn)行親和層析純化，SDS-PAGE和Western blotting（一抗：抗MBP抗血清，二抗：羊抗兔）檢測(cè)MBP-CAT表達(dá)情況。

3 結(jié)果

3.1 CAT基因的擴(kuò)增

通過(guò)PCR擴(kuò)增可以從人cDNA文庫(kù)直接獲得CAT基因，但由于CAT基因較長(zhǎng)（約1.7kb），采用一般的PCR反應(yīng)條件較難獲得。本研究在沒有改變普通Tag酶的情況下，適當(dāng)延長(zhǎng)了延伸時(shí)間，結(jié)果獲得了較理想的結(jié)果。如圖1A所示，當(dāng)延伸時(shí)間為1min時(shí)，沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，但延伸時(shí)間改為2min和3min后，擴(kuò)增產(chǎn)物隨延伸時(shí)間的增加而增加。將獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到T載體后，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST分析表明，獲得的目的片段為人過(guò)氧化氫酶基因。以此測(cè)序重組子為模板進(jìn)行的二次PCR反應(yīng)，獲得僅含編碼序列的片段。由于此反應(yīng)的模板單一，延伸1min與3min擴(kuò)增效果相同(圖1B)。

圖1 嵌套式PCR擴(kuò)增CAT基因的瓊脂糖凝膠電泳

A.以人cDNA文庫(kù)為模板，改變不同延伸時(shí)間獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

1:延伸時(shí)間為1min;2:延伸時(shí)間為2min;3:延伸時(shí)間為3min;M:DL3000 DNA Marker。

B.以第一次擴(kuò)增產(chǎn)物為模板， 改變不同延伸時(shí)間獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

M:DL3000 DNA Marker;1:延伸時(shí)間為1min;2:延伸時(shí)間為2min;3:延伸時(shí)間為3min。

3.2 CAT基因在大腸桿菌中的表達(dá)

將CAT編碼基因片段克隆入pMAL-c2x載體，構(gòu)成pMAL-c2x-CAT重組質(zhì)粒。其中CAT基因的上游為MBP基因，它與CAT基因以融合形式表達(dá)。因MBP分子量為42kD，其與59kD的CAT融合，表達(dá)蛋白應(yīng)為100kD左右。如圖2所示，將pMAL-c2x-CAT重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli TB1，分別用37℃、28℃、20℃三種溫度進(jìn)行誘導(dǎo)，破菌處理后SDS-PAGE檢測(cè)，顯示表達(dá)區(qū)帶出現(xiàn)在略高于97400的標(biāo)準(zhǔn)蛋白位置上，并且均為可溶性蛋白。相比之下以20℃誘導(dǎo)溫度為獲得最佳表達(dá)量。Western bloting檢測(cè)(與抗MBP抗體反應(yīng))，結(jié)果顯示該條區(qū)帶確實(shí)是融合蛋白MBP-CAT（圖3）。

圖2 SDS-PAGE檢測(cè)MBP-CAT在大腸桿菌中的表達(dá)

M:低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白;1～4，5～8，9～12分別為37℃，28℃，20℃三個(gè)溫度梯度下的未誘導(dǎo)樣品、IPTG誘導(dǎo)樣品、超聲破菌后的上清、超聲破菌后的沉淀。

圖3 Western blotting檢測(cè)MBP-CAT在大腸桿菌中的表達(dá)

M:低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白; 1: pMAL-c2x- CAT重組子超聲破菌的上清轉(zhuǎn)膜后考馬斯亮藍(lán)染色;2:pMAL-c2x-CAT重組子超聲破菌的上清與抗MBP抗血清反應(yīng);3:pMAL-c2x陰性對(duì)照菌的上清與抗MBP抗血清反應(yīng)。

4 討論

本研究利用嵌套引物和增加延伸時(shí)間，順利獲得目的基因。由于目的片段較長(zhǎng)（1.7kb），當(dāng)使用普通Taq酶時(shí)，僅采用一般的PCR反應(yīng)條件不太容易直接獲得目的片段，所以本實(shí)驗(yàn)適當(dāng)延長(zhǎng)嵌套式PCR第一次擴(kuò)增反應(yīng)的延伸時(shí)間，保證目的片段得到充分延伸。實(shí)驗(yàn)證明，在常規(guī)延伸時(shí)間（1min）條件下不能獲得目的片段，但當(dāng)將延伸時(shí)間加長(zhǎng)（2min、3min）即可獲得目的片段，而且隨時(shí)間的延長(zhǎng)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物更多。在進(jìn)行嵌套式PCR反應(yīng)的第2次擴(kuò)增中，由于模板單一，所以常規(guī)延伸時(shí)間（1min）就能保證目的片段的充分延伸。

在表達(dá)過(guò)程中，本研究選擇了融合表達(dá)（pMAL-c2x），分別選擇37℃、28℃、20℃作為不同誘導(dǎo)溫度對(duì)pMAL-c2x-CAT重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，盡管不同溫度的表達(dá)產(chǎn)物都為可溶性蛋白，但隨著溫度的降低，目的蛋白的表達(dá)量逐步增加，說(shuō)明低溫誘導(dǎo)有利于蛋白的表達(dá)，但由于CAT片段較長(zhǎng)，表達(dá)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)部分降解。

本研究分別構(gòu)建了人CAT基因的融合表達(dá)載體，在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，為以后重組人過(guò)氧化氫酶的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 彭志英，蔣黎.紫外速率直接法測(cè)定過(guò)氧化氫酶活性［J］.華西醫(yī)學(xué)，1995（10）：4-8.

［2］ 王坤.實(shí)用診斷酶學(xué)［M］.重慶：科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社重慶分社，1989：273.

［3］ 王凡強(qiáng)，王正祥，邵蔚藍(lán)，等.重組大腸桿菌熱穩(wěn)定性過(guò)氧化氫酶的純化及性質(zhì)研究［J］.微生物學(xué)報(bào)，2002，42(3):348-353.

［4］ Dhaese，Patrick. Catalase，an enzyme with growing industrial potential［J］.Chim.Oggi，1996，14（1）;19-20.

（責(zé)任編輯：曾楚華）