袁文華

眾所周知,心血管疾病是威脅人類健康與生命的頭號殺手,高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率及較高的治療費(fèi)用已使其成為阻礙社會發(fā)展的一大障礙。急性心肌梗死(AMI)是冠心病中的一個非常嚴(yán)重的類型,為冠狀動脈閉塞、血流中斷,使部分心肌因嚴(yán)重而持久的缺血發(fā)生局部壞死,從而導(dǎo)致心臟功能的嚴(yán)重?fù)p害,具有較高死亡率較高。對于急診胸部不適疑為心肌梗死的患者,目前多用心電圖結(jié)合心肌損傷標(biāo)志物如肌酸激酶(CK)、肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)、肌紅蛋白(Mb/Myo)及心肌肌鈣蛋白(cTn)I或T等進(jìn)行診斷與鑒別診斷。近年來,隨著患病率的提高,關(guān)于心肌梗塞診斷的研究也更充分。隨著研究的深入,目前認(rèn)為肌鈣蛋白是檢測心肌損傷的黃金指標(biāo)[1-3]。

1結(jié)構(gòu)特性分析

肌鈣蛋白-I以三種形式存在,分別與快收縮骨骼肌、慢收縮骨骼肌和心肌中的特異性同種異型體相對應(yīng)。骨骼肌的同種異形體在分子大小上相似,大約20 000道爾頓,然而氨基酸序列40%都不同。心臟同種異型體也顯示與骨骼肌同種異型體有40%不同,但在氨基酸末端另有31個殘基,使其分子量大約為24 000 道爾頓[4-5]。

心肌肌鈣蛋白I在心肌梗死癥狀出現(xiàn)后的幾個小時內(nèi)被釋放如下,在梗死后的許多天里保持在較高水平。將這些報道的數(shù)據(jù)綜合起來看到,肌鈣蛋白-I水平在胸痛出現(xiàn)后4～8小時變得不正常,在12～16小時達(dá)到峰值,梗死后持續(xù)在較高水平5～9天[4-6]。根據(jù)這些研究,肌鈣蛋白-I在CKMB和LD的診斷窗口期升高[7]。最新臨床研究也提示,存在骨骼肌損傷時,肌鈣蛋白-I對探查心肌損傷比CKMB的心臟異性更高[8-9]。

心肌肌鈣蛋白I水平測定提供為在廣泛的診斷窗口期一種敏感特異性地心肌損傷診斷方法。在急性冠狀動脈綜合征期,包括Q-波MI、非Q-波MI和不穩(wěn)定心絞痛,已觀察到心肌肌鈣蛋白I水平升高。在能夠測定出心肌肌鈣蛋白I水平的非-Q-波MI和不穩(wěn)定心絞痛的病人,觀察到死亡率極高。提示心肌肌鈣蛋白I為這些病人的危險分級提供了一種方法[10]。

2檢測方法

2.1非均相免疫法(ELISA法)

非均相免疫法以“夾心”原理為基礎(chǔ)的一步法酶免疫檢測。樣品與包被心肌肌鈣蛋白I分子特異性抗體的二氧化鉻顆粒和共軛試劑(堿性磷酸酶,ALP)孵育形成顆粒/心肌肌鈣蛋白I/共軛物夾心。未結(jié)合的共軛物通過磁化分離和沖洗。分離和沖洗后,顆粒/心肌肌鈣蛋白I/共軛物夾心被轉(zhuǎn)移到比色杯,在比色杯夾心結(jié)合的堿性磷酸酶(ALP)激發(fā)和放大級聯(lián)反應(yīng)。ALP使合成的黃素腺嘌呤二核苷酸磷酸(FADP)脫磷酸釋放出FAD。FAD與脫輔基d-氨基酸氧化酶結(jié)合轉(zhuǎn)化為具有活性的holo d-氨基酸氧化酶。每個holo d-氨基酸氧化酶分子產(chǎn)生多分子過氧化氫分子(H202),在辣根過氧化物酶(HRP)存在的情況下轉(zhuǎn)化為3,5-二氯-2-對氨基苯磺酸(DCHBS)和4-氨基安替比林(4-AAP)形成在510 nm產(chǎn)生光吸收的有色產(chǎn)物[11]。測定的顏色強(qiáng)度與病人樣品中的心肌肌鈣蛋白I濃度成正比。在Dimension臨床生化系統(tǒng)上采用非均相免疫測定模塊定量檢查人血清的肌鈣蛋白I,其檢測低限為0.04 ng /mL,檢測范圍0.04-40 ng /mL,試驗的反應(yīng)時間為5.4分鐘。目前該方法已成為檢測肌鈣蛋白I較成熟的方法。

2.2化學(xué)發(fā)光法

化學(xué)發(fā)光法是將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立起來的一種檢測微量抗原或抗體的標(biāo)記免疫分析技術(shù)。以該法檢測cTnI具有代表性的產(chǎn)品是美國Beckman Coulter 公司的Access 微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)、SIEMENS公司的ADVIA Centaur和ACS-180電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)。Access AccTnI采用了雙抗體一步夾心酶免疫分析的方法,以化學(xué)發(fā)光劑3-(2′-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酸氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁氨(AMPPD)為底物,用cTnI單克隆抗體包被的磁性微粒為固相載體,并用ALP標(biāo)記的cTnI另一單抗作為酶標(biāo)抗體,檢測時,待測抗原與包被在固相載體的抗體及ALP標(biāo)記的抗體形成夾心復(fù)合物,發(fā)光劑AMPPD在ALP催化下脫去磷酸根基團(tuán)而發(fā)光。該系統(tǒng)最低檢出濃度為0.03 ng/mL,CV<5%, 準(zhǔn)確度可達(dá)97.8%。

ACS-180電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)則以細(xì)小的順磁性微粒為固相載體,以電化學(xué)發(fā)光劑吖啶酯標(biāo)記抗體,待加入氧化劑H202和NaOH后,吖啶酯則可在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光,光的強(qiáng)度與待測抗原的濃度成正比。該系統(tǒng)靈敏度接近0.15 ng/mL,回收率為96.97%～102.60%。

ADVIA Centaur化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)的超敏TnI檢測法是采用直接化學(xué)發(fā)光技術(shù)的3位點夾心免疫測試法。所含的輔助試劑用于減少非特異性結(jié)合。二元標(biāo)記試劑包括一個采用吖啶酯標(biāo)記的山羊多克隆抗肌鈣蛋白I抗體和2個生物素結(jié)合的鼠單克隆抗肌鈣蛋白I抗體。固相試劑是結(jié)合鏈霉親和素的乳膠磁顆粒。所有試劑都包含于ReadyPack中。二元標(biāo)記試劑中的抗體與樣品中的肌鈣蛋白I結(jié)合。免疫復(fù)合物中所含的生物素隨機(jī)與磁性顆粒上標(biāo)記的鏈霉親和素結(jié)合。超敏TnI的檢測低限為0.006 ng/mL,檢測范圍0.006-50 ng/mL,回收率為91%～113%。

其干擾實驗是根據(jù)CLSI文件EP7-A2確定干擾測試[12],將心肌鈣蛋白T、骨骼肌鈣蛋白I、原肌凝蛋白、肌動蛋白、肌鈣蛋白C、輕鏈肌凝蛋白、肌紅蛋白和CK-MB化合物按照規(guī)定濃度添加到已知cTnI濃度的樣品中。添加樣品的ADVIA Centaur超敏TnI檢測結(jié)果與未添加對照樣品進(jìn)行比較,結(jié)果肌動蛋白和肌鈣蛋白C<0.005 、骨骼肌鈣蛋白I<0.007,其余均未檢出有交叉反應(yīng),ADVIA Centaur超敏TnI測試項目顯示出具有高度的cTnI特異性

2.3免疫比濁法

免疫比濁分析屬液相沉淀試驗,其基本原理是抗原、抗體在特定的電解質(zhì)溶液中反應(yīng),形成小分子免疫復(fù)合物,在增濁劑的作用下,迅速形成免疫復(fù)合物微粒,使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度,待測抗原量與反應(yīng)溶液的濁度呈正相關(guān)。該法根據(jù)檢測器的位置及其所檢測的光信號的不同,可分為免疫乳膠比濁法(turbidimetry)、免疫散射比濁法(nephelometry)等。王永卿[13]報道了免疫乳膠比濁法測定cTnI的臨床應(yīng)用。該法將cTnI與膠乳顆粒表面的抗體結(jié)合,導(dǎo)致相鄰的膠乳顆粒彼此交聯(lián),進(jìn)而通過比較反應(yīng)前后透射光和散射光改變的程度,達(dá)到測定的目的。該法靈敏度可達(dá)0.3 ng/mL,線性范圍為0～25 ng/mL,批內(nèi)CV值4.0%,批間CV值4.7%。李寧沙等[14]同樣采用了此法檢測cTnI,并比較了不同抗凝劑對檢測結(jié)果的影響,發(fā)現(xiàn)肝素鋰相對于肝素鈉、EDTA-K2而言,對抗原活性影響最小,是較為理想的抗凝劑。上述研究證實免疫比濁法相關(guān)性好、線性范圍寬、精密度高,具有一定的臨床應(yīng)用價值。

2.4膠體金免疫層析法(ICA)

免疫金技術(shù)是繼放射性同位素標(biāo)記、酶標(biāo)記、發(fā)光熒光標(biāo)記之后的又一大標(biāo)記技術(shù)。膠體金由于具有特殊的光學(xué)性質(zhì)和電性質(zhì),例如顯色性、導(dǎo)電性和非線性光學(xué)特性等,在免疫分析方面有著其獨特的優(yōu)勢。目前,金標(biāo)免疫法主要是應(yīng)用到與免疫層析技術(shù)相結(jié)合的ICA中,該法標(biāo)本用量少,簡便快速,適合于cTnI的床旁檢測。國外在這方面的研究相對較多,如美國的Spectral Diagnostics 公司、德國萊幫公司等都推出了利用ICA法制備的cTnI檢測卡,其基本原理均是利用兩個cTnI單克隆抗體的結(jié)合來檢測cTnI。當(dāng)血清樣本滴到吸收孔內(nèi),第一個被膠體金標(biāo)記的抗體與cTnI結(jié)合形成一個抗體抗原結(jié)合體。第二個固定化的cTnI單抗捕捉到這個結(jié)合體,產(chǎn)生一個粉紅色的顏色帶,相對于無結(jié)合體的存在,反應(yīng)圈內(nèi)則沒有色帶。但基于該方法開發(fā)的檢測卡,雖可快速完成檢測,但僅能用于cTnI定性和急性心肌梗死患者的初選,臨床應(yīng)用有一定局限性。

隨著肌鈣蛋白I廣泛應(yīng)用于臨床診斷,取得了良好的效果,作為檢測心肌損傷高度特異與敏感的指標(biāo)。目前由于其檢測方法尚未完全標(biāo)準(zhǔn)化,使不同檢測系統(tǒng)的測定結(jié)果缺乏可比性。因此,在抗體的制備、參照物和檢測試劑等許多方面均需建立統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。隨著在這方面研究的進(jìn)一步深入,以及抗體制備及標(biāo)記技術(shù)的不斷進(jìn)步,cTnI檢測會有更廣泛的研發(fā)及應(yīng)用前景。

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(收稿日期2009-10-29)